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Untersuchungen zur Aktivierung von Transglutaminasen durch das Zytokin Tumor Nekrose Faktor Alpha und Cathepsin D in Fibroblasten und Keratinozyten
Get PDFEgberts et al. (2004) wiesen eine Aktivitätssteigerung der TG1 in Keratinozytenkulturen durch exogene Zugabe von Cathepsin D (CATD) nach. Daraufhin wurde die Regulation der Transglutaminase 1 (TG1) durch CATD mit Hilfe von CATD defizienten Mausfibroblasten überprüft. Es zeigte sich eine gestörte Prozessierung der TG1 in CATD-defizienten Fibroblasten. Daraus wurde geschlossen, dass die TG1 durch/über CATD vermittelte proteolytische Prozessierung aktiviert werden kann. Da von der Arbeitsgruppe Schütze, Institut für Immunologie, vorher gezeigt wurde, dass CATD durch den Tumornekrosefaktor alpha (TNF-α) aktivierbar ist (Heinrich et al., 2004), wurde in der vorliegenden Arbeit der Versuch unternommen die Ergebnisse von Egberts et al. (2004) zu reproduzieren und darüber hinaus zu überprüfen, ob ein Zusammenhang zur TNF-α-Signalkaskade besteht. Zusätzlich wurde untersucht, ob CATD auch einen Einfluss auf die Regulation der Transglutaminase 2 und 3 hat.
Dazu wurde für Kolokalisationsexperimente das Verfahren der konfokalen Mikroskopie, für die Analyse der Protein-Prozessierungen die Westernblotanalyse und zur Bestimmung der enzymatischen Aktivität der Transglutaminaseaktivitäts-Assay eingesetzt. Es wurde erstmals gezeigt, dass es nach Stimulation mit TNF-α in Mausfibroblasten und humanen Keratinozyten zu einer Kolokalisation von Transglutaminase 2 und Cathepsin D kommt. Somit besteht zwischen diesen Enzymen ein durch TNF-α induzierbarer direkter räumlicher Kontakt. Im Westernblot zeigte die Transglutaminase 2 eine Zunahme der 74 kDa-Isoform und der 55 kDa-Isoform nach Stimulation mit TNF-α in den Wildtypfibroblasten und den humanen Keratinozyten. Anders verhielt es sich bei den CATD- defizienten- und den mit CATD retransfizierten Fibroblasten. Während die 74 kDa-Isoform der TG2 bei beiden Zelltypen nach Stimulation mit TNF-α kaum Veränderungen zeigte, kam es bei den CATD-defizienten Fibroblasten nach Stimulation mit TNF-α zu einer Abnahme der 55 kDa-Isoform der TG2, bei den mit CATD retransfizierten Fibroblasten hingegen zu einer Zunahme der 55 kDa-Isoform.
Weiterhin ist Cathepsin D notwendig für den durch TNF-α vermittelten Anstieg der Transglutaminaseaktivität. Die Ergebnisse im Westernblot zeigten, dass es nur in Anwesenheit von CATD zu einer Zunahme der 55 kDa-Isoform der TG2, also TG2-β kommt. Weiterhin kommt es nach Stimulation mit TNF-α in Mausfibroblasten und humanen Keratinozyten zu einer Kolokalisation von Transglutaminase 2 und Cathepsin D.
Zusammenfassend konnten wir erstmals zeigen, dass Cathepsin D essentiell für die Aktivierung der Transglutaminase 2 unter Einfluss des Entzündungsmediators TNF-α ist
In vitro und in vivo Untersuchungen zur Bedeutung der β-Defensine 3 und 14 in derkutanen Erregerabwehr der Maus
Get PDFFür die kutane Abwehr von Mikroorganismen sind antimikrobielle Peptide, welche in der Haut induzierbar oder konstitutiv exprimiert werden, von großer Bedeutung. Die Expression der humanen Beta-Defensine 2 (hBD2) und 3 (hBD3) ist induzierbar durch Bakterien, Zytokine, Wachstumsfaktoren und Verwundungen der Haut. Homologieuntersuchungen zeigten, dass die murinen Beta-Defensine 3 (mBD3) und 14 (mBD14) Strukturorthologe zu hBD2 und 3 sind. Mit in vitro und in vivo Stimulationsversuchen wurde gezeigt, dass mBD3 und mBD14 auch funktionelle Homologie zu hBD2 und hBD3 haben. Die Expression von mBD3 wird in vitro in primären Keratinozyten durch Stimulation mit Überständen von P. aeruginosa und durch IFNγ, IL-1β und TNFα induziert und in vivo durch Störungen der Hautbarriere. In vitro konnte die Expression von mBD14 durch Überstände von P. aeruginosa und S. aureus, sowie durch PMA, IFNγ und TGFα induziert werden. Störungen der Hautbarriere in vivo induzierten die Expression von mBD14 ebenfalls
Regulation der TLR 1,2,5,6-mRNS-Expression in humanen Keratinozyten durch das Interferon y
Get PDFDie Toll-like-Rezeptoren (TLR) sind im Rahmen des angeborenen Immunsystems essenziell für die Erkennung von pathogenen Erregern.
Ziel dieser Arbeit war es festzustellen, welche proinflammatorischen Zytokine ausgewählte TLR auf der mRNS-Ebene in humanen Keratinozyten induzieren können. Dazu wählten wir TLR 2, der grampositive Bakterien erkennt, seine Heterodimerpartner TLR 1 und 6, und TLR 5, als Vertreter der Erkennung begeißelter Bakterien.
Primäre humane Keratinozyten wurden zunächst mit den Zytokinen (IL)-1β, IL-4, -5, -6, -13, -15, -17, -18, -20, -31, TGF-alpha, TNF-alpha, Interferon y stimuliert und die mRNS-Expression der TLR mittels einer Realtime-PCR semiquantitativ untersucht. Hierbei zeigte sich ein hoch signifikanter Effekt durch Stimulation mit IFN-y, insbesondere auf die TLR-2-mRNS-Expression.
Anschließend wurde der Einfluss des IFN-yauf die vier ausgewählten TLR in einer Konzentrationsreihe (5 bis 50 ng/ml bei 24h) und einer Zeitreihe (zusätzlich 8 und 16h bei einer Konzentration von 30ng/ml) genauer untersucht. Auch hier zeigte sich ein hoch signifikanter Effekt ausgehend von IFN-yauf die TLR-2-mRNS-Expression bei verschiedenen Konzentrationen bei 24 h und der maximale Effekt zeigte sich nach 16 h bei einer Konzentration von 30 ng/ml.
Die Arbeit zeigt, dass TLR 1, 2, 5 und 6 auf den humanen Keratinozyten konstitutiv exprimiert werden und TLR 2 einer Induktion durch das Zytokin IFN-y auf der mRNS-Ebene unterliegt. Die Wertigkeit der Ergebnisse bezüglich TLR 2 wird durch die Abhängigkeit des Effekts von der Konzentration des IFN-y wesentlich gestützt. Bei den TLR 1, 5 und 6 konnte keine signifikante Induktion durch die getesteten Zytokine nachgewiesen werden. Insgesamt legen meine Ergebnisse eine zentrale Rolle von TLR 2 in der Regulation der Erkennung pathogener Organismen in der menschlichen Haut nah.The innate immune system supports the physical skin barrier in antimicrobial defense. Human keratinocytes constitutively express various members of the toll-like receptors family important for innate immunity. We asked whether TLR 1, TLR2, TLR 5, TLR 6 expression is stimulated by cytokines in human keratinocyte culture in vitro. The expression of human TLR 1, 2, 5, 6 was assessed by realtime PCR analysis. Keratinocytes were stimulated by cytokines which have been described to be involved either in Th1 or Th2 dominated immune responses: (IL)-1β, IL-4, -5, -6, -13, -15, -17, -18, -20, -31, TGF-alpha, TNF-alpha, Interferon y. We found a significant upregulation of TLR 2 expression especially by stimulation with IFNy. The effect of IFNy stimulation was concentration and time dependent with a maximum response after stimulation with 40 ng/ml about 24 h after stimulation. Interestingly neither TLR 1 or TLR 6 expression was induced by IFNy
at any time point or concentration tested. As both receptors are thought to be act as heterodimers with TLR 2 when detecting their ligand this suggests that TLR 2 dominates the innate immune reaction of the skin although other receptors are also expressed. As IFNy is a typical Th1 cytokine it may be responsible for the induction of TLR 2 Expression in psoriatic skin
Immunhistochemische Analyse der Expression von humanem Beta-Defensin-2 und des inflammatorischen Infiltrates in entzündlichen Dermatosen zur Abgrenzung gegenüber der Psoriasis vulgaris
Get PDFDie Psoriasis vulgaris ist eine häufige, inflammatorische Hauterkrankung mit charakteristischen histologischen Veränderungen wie z.B. einer abnormalen epidermalen Proliferation oder der Infiltration von Zellen des Immunsystems wie neutrophile Granulozyten und T-Zellen (Nestle F.O. et al. 2009). Bestehen trotz spezifischer histologischer Merkmale dennoch Zweifel an der richtigen Diagnose und sind im Vergleich mit anderen entzündlichen Dermatosen nur wenige Unterscheidungskriterien vorhanden, so kann im Fall einer Fehldiagnose die erkrankungsindividuelle Therapie erfolglos bleiben. Insgesamt stellt sich daher die Frage nach einer weiterführenden Differenzierungsmöglichkeit. Da die Psoriasis vulgaris sowohl durch die Einwanderung von T-Lymphozyten als auch durch die Produktion von antimikrobiellen Peptiden charakterisiert ist, sollte über deren immunhistochemischen Nachweis ein mögliches Unterscheidungskriterium zu anderen Dermatitiden untersucht werden. Anhand der Hautläsionsproben von 140 unter einer Psoriasis vulgaris oder einer psoriasisähnlichen Dermatitis leidenden Patienten konnten mit Hilfe antigen-/antikörperbasierter immunhistochemischer Analyseverfahren Unterschiede im Färbeverhalten der Psoriasis vulgaris im Vergleich mit anderen entzündlichen Hauterkrankungen dargestellt werden. Spezieller wurden die inflammatorisch veränderten kutanen Proben mit einem humanen ß-Defensin-2 (hBD-2) markierenden Antikörper gefärbt und anschließend mikroskopisch analysiert. Des Weiteren sind beschriebene Hautexzidate mit T-Zell erkennenden Antikörpern gefärbt und folgend auf Unterschiede hin untersucht worden. Für die Detektion der T-Zell Subpopulationen führten wir eine CD1a-, eine CD8-, eine Fox P3- und eine PD1 Färbung durch. Die beispielhaft von der Psoriasis vulgaris zu unterscheidenden Erkrankungen waren neben dem Ekzem noch die Pityriasis, die Parapsoriasis und die Tinea. Zur Illustration der Färbeergebnisse wurden Score-Systeme genutzt mit deren Hilfe sich semiquantitativ entweder die Detektion der T-Zellen oder die Detektion des hBD-2 darstellen ließ.
Mit den jeweiligen Scores ließen sich Relationsgrafiken anfertigen mit denen die einzelnen Erkrankungen aufgrund ihres Färbeverhaltens in Beziehung gesetzt werden konnten. Die präsentierten Ergebnisse illustrieren die Möglichkeiten und Limitierungen der immunhistochemischen Analysen für die diagnostische Abgrenzung der Psoriasis vulgaris von anderen entzündlichen Hautläsionen. Es konnte gezeigt werden, dass das humane ß-Defensin-2 im inflammatorisch veränderten Gewebe immunhistochemisch detektierbar ist und darüber hinaus zur Abgrenzung insbesondere gegenüber dem Ekzem eine hohe Differenzierungspotenz aufweist.
In Bezug auf die Markierung der T-Zell-Populationen der unterschiedlichen entzündlichen Hautläsionen zeigten sich ebenfalls deutliche Unterschiede. Bei einer allerdings sehr hohen Streuungsbreite der Ergebnisse kann eine isolierte Untersuchung bespielsweise nur der Fox P3 positiven Zellen kein Unterscheidungskriterium darstellen. Die Kombination der einzelnen Untersuchungen könnte jedoch einen erheblichen Beitrag zur Diagnoseeingrenzung leisten. Ob tatsächlich immer zweifelsfrei die Psoriasis vulgaris mit diesen Färbeverfahren detektiert werden kann, wird sich zeigen wenn die immunhistochemischen Verfahren in der Praxis an einem größeren Patientenkollektiv genutzt werden und ein entsprechendes “Follow up“ erfolgt. Wenn sich die Ergebnisse dieser Arbeit dabei bestätigen, könnten diese Analysen künftig als Zusatzkriterium neben der konventionell histologischen Aufarbeitung der kutanen Läsionen zur Differentialdiagnostik und Diagnosebestätigung der Psoriasis vulgaris einen erheblichen Beitrag leisten
Einfluss der Disintegrin-ähnlichen Metalloproteinase ADAM10 auf die proteolytische Spaltung von transmembranen Proteinen der Haut
Get PDFDisintegrin-ähnliche Metalloproteinasen (ADAMs) sind an verschiedenen biologischen Prozessen wie Kontrolle von Membranfusion, Muskelentwicklung und Entzündungsreaktionen beteiligt. ADAM10 wird von Keratinozyten konstitutiv exprimiert. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass membranständige Chemokin CXCL16 von epidermalen Keratinozyten in gesunder Haut konstitutiv exprimiert wird. In primären humanen und murinen Keratinozytenkulturen wird CXCL16 in den Kulturüberstand abgegeben. Diese Proteolyse wird präferentiell von ADAM10 durchgeführt, wie durch Experimente mit spezifischen Inhibitoren und siRNA-gene knockdown-Experimenten gezeigt werden konnte. Die proteolytische Spaltung konnte durch Ionomycin und UVB-Bestrahlung verstärkt werden. Der Rezeptor für CXCL16, CXCR6, wird von einer Subpopulation von Zellen in der Dermis exprimiert, bei denen es sich wahrscheinlich um dermale T-Zellen handelt. Als ein weiteres Substrat von ADAM10 wurde E-Cadherin, eins der wichtigsten Adhäsionmoleküle in der Epidermis untersucht. ADAM10 ist für die proteolytische Spaltung von E-Cadherin verantwortlich. Es konnte gezeigt werden, dass bei Patienten, die am akuten Ekzem, einer inflammatorischen Hautkrankheit mit Bläschenbildung in der Epidermis, litten, vermehrt die mature Form von ADAM10 und C-terminale E-Cadherin Fragmente gebildet werden. Auch anhand von Histologien wurde gezeigt, dass in den Bereichen der spongiotischen Bläschen in der Epidermis das Expressionsmuster von E-Cadherin verändert war
Analyse der Expression von antimikrobiellen Peptiden und deren Regulatoren bei der akuten Appendizitis
Get PDFDie akute Appendizitis ist in jüngerem Patientenalter die häufigste Entzündung im Bereich des Abdomens und somit eines der häufigsten Ursachen für Abdominalschmerz. Unbehandelt oder zu spät therapierte Fälle weisen eine hohe Letalität auf. Die Blockade des Appendixlumens durch hervorgedrungenen Darminhalt aus dem Caecum lässt vermuten, dass die Appendizitis eine lymphatische Gewebereaktion auf enterische Pathogene ist. Nicht jedes Individuum macht im Laufe seines Lebens eine akute Appendizitis durch, so dass die Vermutung nahe legt, dass bestimmte Keime für die Pathogenese dieser Erkrankung verantwortlich seien. Auch der angeborenen Abwehr, vor allem den Antimikrobiellen Peptiden, werden im Rahmen der Entzündungsreaktion und zur Begrenzung des Ausmaßes der bakteriellen Invasion vermehrt Funktionen zugesprochen.
Antimikrobielle Peptide werden von verschiedenen Epithelzellen und Granulozyten gebildet und sind dem angeborenen Immunsystem zugeordnet. Eine wichtige Untergruppe stellen die Defensine dar. Im Dünndarm werden die beiden „Humanen alpha Defensine“ (HD) -5 und -6 gebildet. Die „humanen beta Defensine“ (hBD) -1, -2 und -3 werden im Dickdarm und auf der Haut exprimiert, wobei hBD-2 und hBD-3 durch die inflammatorischen Zytokine, Interleukin (IL-1β) und dem Tumornekrosefaktor alpha (TNFα), induziert werden können. Defensine bewirken eine Schädigung der Zellwand von Mikroorganismen. Sie haben ein breites Wirkspektrum gegen Gram-positive und Gram-negative Bakterien, Mycobakterien, Pilze und Viren. Das Peptid RNase 7 wird hauptsächlich von der Haut exprimiert und zeigt hohe antimikrobielle Aktivität gegen Staphylococcus aureus und Escherichia coli.
Um eine mögliche pathophysiologische Funktion zu verifizieren, wurde die Expression der Antimikrobiellen Peptide und ihrer Regulatoren im Rahmen der akuten Appendizitis untersucht.
Dazu wurden Gewebeproben aus operativ entnommenen Appendices von 38 Patienten untersucht. 24 Proben aus entzündlich veränderten Appendices wurden 14 Proben aus gesundem Appendixgewebe in ihrem Gen-Expressionsverhalten gegenübergestellt. Zusätzlich wurde gesundes Vergleichsgewebe aus anderen Darmabschnitten, je 23 Proben aus dem gesunden Ileum und dem gesunden Colon untersucht. Aus allen Abschnitten wurde RNA isoliert und nach reverser Transkription mittels quantitativer real-time PCR (Polymerase Kettenreaktion) die Genexpression von Antimikrobiellen Peptiden, Zytokinen und TLR bestimmt.
Die Genexpression des β-Defensins hBD-1 wurde in den gesunden Vergeleichsgeweben (Ileum, Colon und gesundem Appendix) auf ähnlich hohem Expressionsniveau nachgewiesen. Interessanterweise kam es im Rahmen der Appendizitis zu einer Herabregulation der hBD-1 Expression. Im Unterschied dazu wurden die beiden β-Defensine hBD-2 und hBD-3 nur in entzündetem Gewebe nachgewiesen, wobei die proinflammatorischen Zytokine IL-1β und TNFα durch ihr kongruentes Verhalten als mögliche Stimulatoren für die Gen-Expression dieser beiden β-Defensine nachgewiesen wurden.
Die hohe basale Expression von IL-1β und IL-8 im gesunden Appendix und deren steigende Expression bei akuter Appendizitis bestätigt zum Einen die Ergebnisse vorausgegangener Untersucher und zum Anderen legen diese Befunde nahe, dass im Appendix ein Entzündungsschwerpunkt liegt und hier Defensine bei Bedarf induziert werden können.
Die α-Defensine HNP1-3 wurden, im Vergleich zum gesunden Ileum und Colon, wo sie kaum exprimiert wurden, sowohl im gesunden als auch mit steigenden Werten im entzündeten Appendix gefunden.
Die Vermutung, dass bakterielles Lipopolysaccharid (LPS) eine zentrale Rolle in der Entwicklung der Appendizitis einnimmt, wird durch das Expressionsverhalten des Toll-like-Rezeptors (TLR-4), der durch bakterielles LPS aktiviert wird, unterstützt. Im entzündeten Appendix verdoppelt sich seine Gen-Expression.
Die Anlayse eines größeren Spektrums von inflammatorischen Botenstoffen und Rezeptoren mittels TaqMan Array verifizierte die Einzelgenanalyse und erbrachte den Nachweis einer vermehrten Expression von NOD2. Dieser Sensor für Muramly-Dipeptid ist vor allem auch für die Abwehr der bakteriellen Invasion wichtig, so dass im Zusammenspiel mit den TLRs hier offensichtlich eine Aktivierung des angeborenen und erworbenen Immunsystems im Rahmen der Appendizitis mit dem Ziel der Terminierung einer bakteriellen Entzündung stattfindet.
Im Einklang mit dieser Hypothese konnte die Analyse der Microbiota eine erhöhte bakterielle Diversität und Anreicherung nachweisen.
Abschließend kann zusammengefasst werden, dass im Rahmen der Appendizitis eine differentielle angeborene Immunanwort mit vermehrter Expression von α-Defensinen, hBD-2 und hBD-3 und einer Herabregulation von hBD-1 stattfindet
Einflüsse von Pimecrolimus und Triamcinolonacetonid auf die epidermale Hautbarriere bei atopischer Dermatitis
Get PDFUntersuchung der epidermalen Hautbarriere durch Bestimmung klinischer Parameter, biophysikalischer Parameter (Transepidermaler Wasserverlust, Hauthydratation, Integrität des St. corneum), lichtmikroskopischer Analysen (Immunhistochemie auf epidermale Proliferations- und Differenzierungsmarker) sowie elektronenmikroskopischer Analysen (Lamellenkörperchen/ lamellar bodies)
Kontrollierte, randomisierte Prüfung zur Bestimmung der Wirkung von WO1932 bei Behandlung weiblicher Mamma-CA Patienten mit Radiodermatitis
Get PDFDissertation zur Bestimmung einer Öl-in-Wasser Emulsion in Bezug auf die Hydratation bei weibl. Pat. mit Mamma-CA in Bezug auf Radiodermatiti
Charakterisierung von Hautmanifestationen beim Morbus Parkinson und atypischen Parkinson- Syndromen
Get PDFFragestellung: Im Rahmen von Parkinson-Syndromen kommt es neben motorischen Symptomen häufig zur nicht-motorischen Beteiligung einschließlich Hautmanifestationen (beim idiopathischen M. Parkinson (iPD) lt. PRIAMO-Studie bei ca. 25%). Dennoch bleibt dies weiterhin unzureichend untersucht. Ziel der Studie war daher eine Charakterisierung von Hautmanifestationen beim Morbus Parkinson und atypischen Parkinson-Syndromen.
Methodik: Bei 79 Patienten (64 iPD; 8 MSA; 5 PSP; 1 CBD; 1 DLB) und 32 Kontrollen wurden eine standardisierte Anamnese einschl. Non-Motor-Scale, eine dermatologisch-ausgerichtete Lebensqualitätsbefragung (DLQI), sowie die Anamnese anhand eines neu entwickelten Fragenkatalogs über die Form und Manifestation von Hautbeteiligung und Patientenzufriedenheit; sowie eine klinische Untersuchung (UPDRS III, Hoehn & Yahr) durchgeführt.
Ergebnisse: Während der Parkinson-Erkrankung traten bei 36% Patienten mit iPD; bei 75% mit MSA und je 0% mit PSP, CBD oder LBD neue Hautbeschwerden auf. Am häufigsten wurden Rötung, Schuppung, Schwitzen und Juckreiz angegeben. Bei iPD-Patienten waren vorwiegend die Stirn (33%) und der Rumpf (25%) betroffen. Bei 19% der iPD-Patienten hatte die Parkinson-Therapie einen negativen Effekt auf die Hautbeschwerden. Die Lebensqualität war durch die Hautbeteiligung zwar nur geringfügig beeinflusst, dennoch wünschte sich knapp die Hälfte der Befragten mehr Aufmerksamkeit durch den Arzt.
Schlussfolgerung: Hautmanifestationen treten häufig auf, stehen aber für Patienten bezüglich ihrer Lebensqualität nicht im Vordergrund
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