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Extending lifespan through autophagy stimulation: a future perspective
No full textAging is a natural process characterized by the gradual decline of physiological functions. In the last decades, human lifespan has considerably increased. Consequently, population aging and the resulting increase of people affected by age-related diseases, is emerging as a major social and economic challenge in developed countries. This scenario has led to an exponential growth of research projects in the field of aging, with the aim of identifying amenable drug targets and pharmacological interventions to extend human healthy lifespan. Extensive evidence in literature suggests that the dysfunction of autophagy, a highly conserved pathway involved in maintaining cellular homeostasis, is part of the aging process with roles in the pathobiology of age-related diseases. Moreover, accumulating experimental data from invertebrate and vertebrate animal models demonstrate that intervening to increase lifespan also induces autophagy, suggesting that stimulating such cellular process may represent an effective strategy to increase longevity. Here, we reviewed the literature on autophagy in aging and age-related diseases, also discussing the perspective of behavioral and pharmacological interventions that may increase healthy lifespan through autophagy stimulation
Jurkat T-cell stimulation up-regulates the expression of lysosomal β-hexosaminidase and β-galactosidase and triggers their recruitment to lipid microdomains
No full textβ-Hexosaminidase α-subunit overexpression affects lipid microdomain glycohydrolases content
No full text
Plasma membrane β-galactosidase and β-hexosaminidase are associated to lipid raft of Jurkat T-cell upon raft clustering.
No full textPHYSICOCHEMICAL CHARACTERIZATION OF RAPAMYCIN-LOADED SOLID LIPID NANOPARTICLES FOR BRAIN TARGETING
No full textBrain disorders such as Alzheimer’s and lysosomal storage diseases belong to the most debilitating and progressive lesions of affluence, which still remain without an effective remedy. Due to the presence of the blood-brain barrier (BBB), i.e tight cell-to-cell connections in brain capillary walls, the transport of pharmaceuticals to the central nervous system is strictly regulated and at times forbidden. One of the most crucial protein complexes, that regulates vital processes within signal transduction, proliferation and autophagy pathways in the brain cells, is the mammalian target of rapamycin complex (mTOR). Specific targeting of the mTOR by rapamycin in-feed administration has been recently demonstrated to repair the cognitative behavior in the Alzheimer’s mice model.
In light of an average size below 100 nm and lipophilic properties, P80-stabilized solid lipid nanoparticles (SLNs) have become a powerful, non-invasive strategy to overcome the BBB and release the drug directly into the brain tissue. We present a characterization of rapamycin loaded SLNs prepared using O/W emulsion - high-pressure homogenization technique and analyzed by means of Raman, UV-NIR and photon correlation spectroscopy. The effectiveness of the therapeutic application of SLN formulations will be validated in vitro on HEK293 and SH-SY5Y neuroblastoma cells and in vivo in normal and transgenic mice models
Recruitment of plasma membrane β-galactosidase and β-hexosaminidase in lipid rafts upon T-cell activation
No full textSolid lipid nanoparticle as a tool to deliver mTOR inhibitors
No full textRecently, the use of mammalian target of rapamycin (mTOR) inhibitors, in particular rapamycin (Rp), has been suggested to improve the treatment of neurodegenerative diseases.
However, as Rp is a strong immunosuppressant, specific delivery to the brain has been postulated to avoid systemic exposure. In this work, Rp loaded solid lipid nanoparticles (Rp-SLN) stabilized with polysorbate 80 (PS80) were prepared comparing two different methods and lipids.
The formulations were characterized by differential scanning calorimetry (DSC), nuclear magnetic resonance (NMR), wide angle X-ray scattering (WAXS), cryo-transmission electron microscopy (cryo-TEM), dynamic light scattering (DLS) and particle tracking. In vitro release and short-term stability were assessed. Biological behavior of Rp-SLN was tested in SH-SY5Y neuroblastoma cells. The inhibition of mTOR complex 1 (mTORC1) was evaluated over time by a pulse-chase study compared to free Rp and Rp nanocrystals.
Compritol Rp-SLN resulted more stable and possessed proper size and surface properties with respect to cetyl palmitate Rp-SLN. Rapamycin was entrapped in an amorphous form in the solid lipid matrix that showed partial crystallinity with stable Lbeta, sub-Lalfa and Lbeta’ arrangements. PS80 was stably anchored on particle surface.
The SEM and AFM imaging and shape-modeling by the combined DLS-SANS analysis revealed that Rp-SLN with a hydrodynamic radius of ∼46 nm preserve a platelet-like or flat ellipsoidal structure with a thickness of 8–9 nm. These dimensions correlate with a single lipid bilayer, organized in a triclinic Lbeta polymorph, and covered with a 1–2-nm P80 shell. Consistently, FT-IR spectra acquired in the range 52–75◦C, confirmed that the Rp incorporation within the lipid matrix decreases the point of the gel-liquid crystal (Lbeta-Lalfa) phase transition.
No drug release was observed over 24 h and Rp-SLN had a higher cell uptake and a more sustained effect over a week. The mTORC1 inhibition was increased with Rp-SLN. Overall, compritol Rp-SLN show suitable characteristics and short-term stability to be considered for further investigation as Rp brain delivery system
Rapamycin-loaded solid lipid nanoparticles for brain targeting
No full textNeurodegenerative diseases are very debilitating conditions with
an increasing impact on the world population and as yet without
an effective remedy. Therefore, the development of new strategies
for early diagnosis and treatment of these diseases is becoming a
priority. The selectivity of the blood-brain barrier (BBB) strictly
limits the number of therapeutic substances able to reach the
brain and therefore, in recent years, many studies have been directed
to the development of systems that facilitate the passage of
drugs to the central nervous system (CNS). One of the most crucial
protein complexes, that regulates vital processes within signal
transduction, proliferation and autophagy pathways, is the mammalian
target of rapamycin (Rp) complex (mTOR). Specific inhibition
of mTOR by Rp in-feed administration has been recently
demonstrated to ameliorate the cognitive behavior in an Alzheimer’s
mice model [1]. Rp is an immunosuppressive drug that can
pass the BBB, but its systemic administration produces a number
of side effects that may impair its therapeutic efficacy [2].
Nanoparticles represent one of the most innovative and noninvasive
approaches for drug targeting. In particular, due to an
average size below 100 nm and lipophilic properties, the use of
P80-coated solid lipid nanoparticles (SLNs) can overcome the
BBB and allow accumulation of drugs directly into the brain tissue,
through the apolipoprotein blood-to-brain pathway. Here,
we report the development of a novel formulation of Rp loaded
SLNs and the investigation of the effect upon treatment of SHSY5Y
neuroblastoma cells. Our results show that Rp loaded
SLNs are able to inhibit mTOR activity over a longer period of
time compared to free Rp. This prolonged action is rather evident
even at concentrations as low as 2 nM and it is consistent
with a longer retention of Rp due to a slower release from the
SLNs. On the basis of the data obtained, we will perform experiments
to assay in vivo the ability of Rp-SLNs to deliver Rp therapeutic
doses to the CNS, limiting systemic exposure to the drug
side effects
FORMULAZIONE E CARATTERIZZAZIONE DI NUOVI TIPI DI NANOPARTICELLE PER STRATEGIE DI “DRUG DELIVERY” A LIVELLO CEREBRALE
No full textAttualmente le malattie neurodegenerative e cerebrovascolari hanno un impatto crescente sia dal punto di vista sociale che economico. Pertanto lo sviluppo di nuove strategie per una diagnosi precoce e per un trattamento efficace e sicuro di tali patologie sta diventando sempre più importante. Per queste ragioni, la ricerca di sistemi in grado di passare la barriera emato-encefalica per il trasporto di molecole terapeutiche a livello di sistema nervoso centrale (SNC) rappresenta una delle sfide più impegnative. La selettività della barriera emato-encefalica limita fortemente il numero di sostanze terapeutiche in grado di raggiungere il cervello e pertanto, negli ultimi anni, molti sforzi vengono rivolti allo sviluppo di sistemi che facilitino il passaggio dei farmaci verso il SNC. Tra questi, l’approccio basato sulle nanotecnologie sembra essere molto promettente. Tale approccio comporta l'uso di almeno due componenti, uno dei quali è costituito da una nanoparticella, che funge da vettore (nano-carrier), e l'altro è l'agente terapeutico (cargo).
La ricerca in atto ha lo scopo di indagare la potenziale efficacia di nanoparticelle solido-lipidiche coniugate con il farmaco Rapamicina (Rp-SLN) per la cura delle malattie neurodegenerative. Recentemente è stato dimostrato che l’inibizione specifica di mTOR, un complesso molecolare che riveste un ruolo centrale nel controllo della omeostasi cellulare, da parte della Rapamicina (Rp) è in grado di migliorare il comportamento cognitivo nel modello murino della Malattia di Alzheimer. mTOR è una serina / treonina chinasi implicata nella regolazione del metabolismo energetico, della proliferazione e motilità cellulare e dell'autofagia. mTOR forma due diversi complessi enzimatici,
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mTORC1 e mTORC2. mTORC1 integra stimoli diversi provenienti da nutrienti, fattori di crescita, stato energetico e stress, interagendo strettamente con il complesso TSC1-TSC2 [Maiese et al., 2013 Trends Mol Med. 195, 1-60]. La Rp è un farmaco immunomodulatore approvato dalla US Food and Drug Administration per l'uso clinico come immunosoppressore. Attualmente viene usato per indurre tolleranza in pazienti che hanno subito trapianto d’ organo, ma anche in oncologia per il trattamento del carcinoma renale avanzato. Studi recenti dimostrano che il trattamento con Rp, o con il suo analogo Everolimus, apporta benefici neurologici nella Sclerosi Tuberosa (TS) [Krueger et al. 2010 N Engl J Med 363,1801-11], una malattia genetica associata allo sviluppo di tumori al cervello e nella Malattia di Alzheimer [Caccamo et al. J Biol Chem 2010, 285, 13.107-20]. La Rp ed il suo analogo sono in grado di passare la barriera emato-encefalica ed apportare significativi benefici nelle due patologie neurodegenerative sopra citate, ma la loro somministrazione sistemica produce una serie di effetti indesiderati che possono compromettere la loro efficacia terapeutica, soprattutto se si pensa ad una loro somministrazione cronica. D’altro canto una somministrazione in loco sarebbe troppo invasiva e non consona ad un trattamento prolungato e precoce, quando ancora la sintomatologia non è conclamata. Al fine di mettere a punto una strategia terapeutica a bassa invasività basata su un sistema di nano-carrier specifico in grado di superare la barriera emato-encefalica e rilasciare in modo efficace una dose terapeutica del farmaco, abbiamo sintetizzato nanoparticelle solido-lipidiche caricate con Rp e opportunamente funzionalizzate con polisorbato 80 (P80). Il P80 ha il duplice ruolo di stabilizzatore e modificatore di superficie, in grado di favorire l'adsorbimento delle apolipoproteine sulla superficie delle particelle, convogliando così le stesse nel pathway dei recettori delle LDL presenti sulla barriera emato-encefalica e consentendone così l’attraversamento ed il rilascio del loro contenuto (che in questo caso era rappresentato da un colorante) a livello di sistema nervoso centrale [Blasi 2007Advanced Drug Delivery Recensioni 59, 454-477]. Le Rp-SLN sono state da noi preparate con il metodo della omogeneizzazione a freddo ad alta pressione. Il Cetil-palmitato e la Rp (10 e 20% p/p) sono stati sciolti in cloroformio e adeguatamente miscelati con una soluzione acquosa di P80 all’1% (p/v) per ottenere una microemulsione olio-acqua. La produzione delle Rp-SLN consiste in 5 cicli di omogeneizzazione ad alta pressione. Il cloroformio è stato allontanato o over-night a temperatura ambiente oppure mediante evaporazione rapida sotto vuoto. Misure di light-scattering dinamico hanno evidenziato che la dimensione media delle particelle è tra 50 e 200 nm. Il potenziale zeta è risultato essere neutro per le preparazioni ottenute mediante evaporazione rapida, mentre con tempi di evaporazione lunghi le Rp-SLN risultano cariche negativamente. La differenza osservata è correlata alla quantità di farmaco presente sulla superficie delle particelle che aumenta con il tempo di caricamento. L’intrappolamento del farmaco è stato valutato mediante spettroscopia UV. Misure della Rp nel
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sopranatante opportunamente centrifugato e filtrato hanno evidenziato una efficienza di incapsulamento compresa tra 84 e 90%. Inoltre è stata effettuata una analisi TEM per controllare la morfologia delle particelle ed escludere la presenza di nanocristalli di Rp.
La eventuale citotossicità delle Rp-SLN ed il grado di internalizzazione sono stati analizzati in vitro in cellule SH-SY5Y (modello cellulare neurale) ed in cellule staminali neuronali. In queste ultime, da noi prodotte a partire dal modello murino di Alzheimer o da quello di Sclerosi Tuberosa, è stato valutato il livello di inibizione di mTOR dopo esposizione alle Rp-SLN e quindi l’effetto terapeutico. Sulla base dei dati ottenuti abbiamo ora intrapreso la preparazione di Rp-SLN marcate con una sonda fluorescente per valutare in vivo la loro capacità di oltrepassare la barriera-ematoencefalica e di trasportare le dosi terapeutiche di Rp a livello di sistema nervoso centrale
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