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Modulation of activators and inhibitors of coagulation by Reactive Oxygen Species (ROS) Progetto PRIN - Coordinatore Unità B
No full textStudio della modulazione dei livelli di espressione del Fattore Tissutale ed implicazioni per le complicanze trombotiche della patologia aterosclerotic
POST-TRANSCRIPTIONAL AND TRANSLATIONAL MECHANISMS UNDERLYING THE REGULATION OF GENE EXPRESSION IN PHYSIOLOGICAL AND PATHOLOGICAL CONDITIONS- progetto PRIN
No full textL'espressione genica nelle cellule eucariotiche è modulata da meccanismi complessi. Negli ultimi anni è emersa l'importanza fondamentale dei meccanismi
post-trascrizionali nella regolazione dell'espressione genica, nel controllo di qualità e nella determinazione della variabilità del proteoma. Tuttavia, molti aspetti di
questo complesso "network" di regolazione devono essere ancora chiariti, ed alcuni di essi saranno oggetto di studio nel nostro progetto.
In questo contesto, proponiamo i geni di fattori della coagulazione, i cui livelli sono finemente modulati per garantire l'equilibrio emostatico, come modelli per lo
studio di meccanismi regolatori a differenti livelli, dallo splicing, alla degradazione dell'mRNA ed alla terminazione della traduzione.
I geni di diversi fattori della coagulazione sono soggetti a splicing alternativo (AS), e possono dare origine ad isoforme proteiche con caratteristiche strutturali e
biochimiche distinte. In questo progetto studieremo nel dettaglio l'impatto dell'AS sull'espressione e la funzione di alcuni geni della coagulazione: i fattori V (FV), VII
(FVII) e XI (FXI) e i geni per le catene del fibrinogeno. I meccanismi che regolano l'AS saranno analizzati in condizioni sia fisiologiche che patologiche; inoltre, le
proprietà funzionali delle isoforme di splicing saranno investigate sia a livello di mRNA che di proteina.
L'AS sarà analizzato anche per il suo possibile ruolo nella regolazione dell'espressione genica attraverso l'accoppiamento con il Nonsense Mediated mRNA Decay
(NMD), il così detto pathway "RUST" (Regulated Unproductive Splicing and Translation).
Modelli ex-vivo di inclusione o salto di esoni, prodotti sulla base di mutanti spontanei identificati tramite screening di ampie coorti di pazienti affetti da coagulopatie
ereditarie rare, saranno usati per identificare e caratterizzare fattori di regolazione dello splicing che agiscono in-cis o in-trans.
Gli obiettivi principali di questa parte del progetto saranno:
1. la caratterizzazione qualitativa e quantitativa del profili di splicing alternativo;
2. lo studio dei possibili ruoli fisiologici e fisiopatologici delle isoforme di splicing (AS in-frame e out-of-frame);
3. l'analisi del ruolo dell'NMD nella modulazione di trascritti fisiologici e di messaggeri recanti codoni prematuri di stop;
4. lo studio di elementi regolatori dello splicing in-cis ed in-trans attraverso l'uso di modelli ex-vivo derivati da mutanti spontanei.
Anche il processo di terminazione della traduzione è cruciale per la corretta espressione genica. L'errata incorporazione di un aminoacido a livello di un codone di
stop (readthrough) avviene con una frequenza di 10(-4). Il readthrough del codone di stop è fortemente influenzato dalle sequenze fiancheggianti, ma i dettagli sono
solo parzialmente noti. A questo proposito investigheremo un numero consistente (n°15) di mutazioni nonsenso nel fattore IX della coagulazione (FIX), per le quali il
readthrough comporterebbe aumenti di proteina plasmatica e miglioramenti nel fenotipo dei pazienti. La precisa misurazione nei pazienti dei livelli di FIX circolante,
grazie a saggi fluorogenici ottimizzati per questa proteina, e di mRNA, permetterà la stima dell'efficienza del readthrough in vivo, e fornirà informazioni sui
determinanti di sequenza nell'uomo. Studi di espressione associati a mutagenesi e studi funzionali permetteranno di validare questi dati ed anche di investigare le
conseguenze del readthrough a livello proteico, un aspetto di grande rilevanza ma ancora inesplorato. Similmente verrà studiato il readthrough indotto da
aminoglicosidi.
Attraverso indagini in vivo, in modelli cellulari e in vitro, questo studio integrato chiarirà meccanismi ed interazioni molecolari alla base del controllo
dell'espressione genica in condizioni fisiologiche e patologiche. I risultati amplieranno le conoscenze sui processi che garantiscono l'equilibrio emostatico in differenti condizioni. Accanto a questo, ed alla disponibilità di protocolli per lo studio di questi aspetti in altri geni, ci si attende di fornire approcci per la modulazione del processamento di mRNA (snRNA modificati) o del readthrough (aminoglicosidi), potenzialmente utili per la correzione di mutazioni di splicing e nonsenso, cause frequenti di malattie ereditarie nell'uomo
RNA−based therapeutic approaches for blood coagulation factor deficiencies caused by splicing mutations. PROGETTO TELETHON TRIENNALE
No full textIl progetto di ricerca propone nuovi approcci terapeutici per il difetto coagulativo congenito di fattore VII, autosomico raro, ed il difetto di fattore IX (emofilia B), legato al cromosoma X che colpisce un
individuo su circa 35.000 nati maschi.
Nella maggior parte dei pazienti la terapia sostitutiva convenzionale, pur prevenendo la grave sintomatologia emorragica, è spesso associata a gravi complicanze.
L'obiettivo dellapproccio proposto è il ripristino parziale dei livelli dei fattori FVII/FIX in forme gravi di deficienza causate da mutazioni in siti donatori per lo splicing, relativamente frequenti in queste
patologie.
Il piccolo RNA nucleare U1 (U1−snRNA), un componente chiave dellapparato di splicing, rappresenta lo strumento terapeutico chiave per il progetto. U1−snRNAs opportunamente modificati dovrebbero mediare il riconoscimento delle giunzioni di splicing mutate e ripristinare la corretta espressione genica. Questa strategia ci ha permesso di correggere,in vitro, gli effetti di mutazioni nel FVIi e nel FIX e di ripristinare la sintesi di molecole funzionali e con capacità procoagulante.
Il progetto finanziato prevede due Unità, quella del responsabile e quella guidata dal Dott. Pagani all'International Centre for Genetic Engineering and Biotechnology di Trieste. Inoltre prevede l'intensa collaborazione con il prof. Arruda presso il Children's Hospital di Philadelphi
Residual factor IX expression in Hemophilia B patients with nonsense mutations: a determinant of inhibitory development?
No full textThe rationale is provided by the process of “ribosome readthrough” over nonsense mutations that, by reverting premature translation termination, would restore protein biosynthesis. Although at low rate, this process can occur spontaneously, and account for residual levels of protein that in coagulation factor disorders might have relevant pathophysiological implications. So far, we provided evidence for residual FVII and FIX levels (~1%) associated to a few nonsense changes.
In the present project, through studies in vivo and in vitro, we propose to investigation on a panel of F9 nonsense mutations to verify the hypothesis that part of nonsense mutations found in severe HB patients are associated to residual FIX levels. If confirmed, we expect to assess whether these traces of FIX are related to the clinical phenotype of patients and their immunological complications. Moreover, it could suggest potential “high responders” to drugs inducing readthrough. The knowledge of “leaky” nonsense mutations, less prone to trigger immune-response, could help diagnosis and treatment. Results from this study on a limited patients’ number could boost a more extensive study in HB patients, and extended to hemophilia A
Development of a RNA-based therapeutic approach for Hemophilia B caused by exon-skipping mutations
No full textBroad objectives and specific aims
To develop a correction strategy based on Exon Specific U1snRNAs (ExSpeU1) for the therapy of
coagulation factor IX (FIX) deficiency (Hemophilia B, HB) caused by exon-skipping mutations. To create
ExSpeU1 derivatives with improved efficacy, to develop a straightforward strategy to create animal
models for splicing mutations and demonstrate the ExSpeU1 therapeutic efficacy in vivo.
Background-rationale
A significant proportion of disease-causing mutations affects pre-mRNA splicing by inducing exon
skipping, but only few have been targeted for therapeutic purposes. We developed ExSpeU1s targeting
non-conserved intronic sequences downstream of the donor site (5′ss) and proved that a unique
ExSpeU1 can correct different exon-skipping mutations. Since even small increase in FIX levels (>2%)
can be estimated in a quantitative manner, and result in significant amelioration of the clinical phenotype,
HB is a preferred model to investigate innovative therapeutic approaches.
Research design and methods
We will focus on a panel of model exon-skipping mutations occurring at 3', 5' splice sites or within the
exon 5 of F9 gene, and causing HB. All mutations were corrected in vitro by the first generation of
ExSpeU1s. Through mechanistic studies in cellular models we will create optimized ExSpeU1s. HB
mouse models will be created by liver-restricted expression of the splicing-competent human FIX
cassettes in FIX knock-out mice. Long-term FIX expression will be obtained either i) via
AdenoAssociated virus (AAV) vectors serotype 8 or ii) by the Sleeping Beauty transposon technology.
The most active ExSpeU1s will be delivered in HB mice through AAV5 to assess restoration of FIX levels
and amelioration of the bleeding phenotype.
Anticipated output
To establish the in vivo efficacy of a unique ExSpeU1 for a panel of different F9 exon-skipping mutations,
and extend the therapeutic potential of this RNA-based strategy
PIATTAFORMA PER RICERCA E SVILUPPO DI PROFARMACI BIOTECNOLOGICI INNOVATIVI PER LA CURA DI MALATTIE GENETICHE RARE
No full textL’obiettivo finale del progetto è quello di creare una piattaforma tecnologica in grado di identificare e sviluppare profarmaci biotecnologici innovativi per la cura di patologie ereditarie nell’uomo.
Progetto di Ricerca finanziato dal Ministero dell'Università e della Ricerca al fine di promuovere la creazione di nuove realtà imprenditoriali. Ciò a permesso la nascita dello spin-off accademico dell'Università di Ferrara dal nome di RareSplice.sr
Altered mRNA processing and FVIII biosynthesis/function as determinants of phenotype variability in the frequent Arg2016Trp Haemophilia A patients.
No full textThe relationship between the molecular defect, the coagulation and the clinical phenotype in Haemophilia is often unclear. While the association of the so-called “null mutations” with severe forms is well-established, that of missense mutations, frequent in Haemophilia A (HA) and largely predominant in Haemophilia B (HB), with the phenotype is elusive. Missense mutations are candidate to affect protein biosynthesis/function but might also impair pre-mRNA splicing, an emerging mechanism whose pathophysiological impact is still poorly investigated. The interplay between these mechanisms might concur to factor VIII/IX levels and to HA/HB severity.
As an ideal model to investigate this issue, we propose the frequent F8 c.6046C>T mutation that has been found in severe and moderate HA patients with different degrees of bleeding tendency. The mutation is candidate to affect FVIII protein biology, and preliminary data suggest it alters F8 pre-mRNA splicing.
Aim
To elucidate the pathogenic mechanisms of the frequent F8 p.Arg2016Trp (c.6046C>T) mutation and define the underlying residual factor VIII levels, thus identifying determinants of phenotypic variability of Haemophilia A.
Expected results
By investigation at the protein and mRNA level in several p.Arg2016Trp patients and with recombinant FVIII variants we expect to define the contribution of impaired mRNA splicing and/or protein biosynthesis/function to FVIII expression. This will provide insights into a poorly known, and largely underestimated feature of missense mutations, which are frequent cause of Haemophilia and of the other rare coagulation factor disorders, and could boost the investigation of mRNA splicing patterns in patients with missense mutations to help interpretation of the related coagulation and clinical phenotypes.
We believe that our findings on the frequent F8 c.6046C>T mutation could help clinicians in the patient’s diagnosis and treatment
Molecola di U1snRNA umano modificato, gene codificante per la molecola di U1snRNA umano modificato, vettore di espressione includente il gene, e loro uso in terapia genica
No full textLa presente invenzione riguarda molecole di snRNA umano modificate atte ad essere impiegate in procedimenti di terapia genica. In particolare l’invenzione riguarda molecole di snRNA capaci di correggere processi di splicing aberranti causati da mutazioni geniche ed correlati con patologie umane con quadri clinici diversi, sovente di intensa gravità
Molecular genetics and biology of congenital hemorrhagic diseases
No full textCoagulation deficiences causing bleeding are X-linked or
autosomally inherited, the latter being the most rare, with
an estimated prevalence in the general population from
about 1:500,000 (FVII deficiency) to 1:2,000,000 (prothrombin
deficiency). Increased frequency of homozygotes
is observed in those countries where consanguineous
marriages are relatively common. Gene size and specific
mutational mechanisms, as C to T transition in CpG sites
and illegitimate recombination, shape the frequency of
mutations and deficiencies. The molecular genetic defects
have been extensively investigated and characterized for
frequent and rare coagulation deficiencies. Analysis of
gene mutations highlights their extreme heterogeneity
with a majority of causative missense changes. The
expression of selected mutants is useful to test residual
antigen, function or mRNA of coagulation factors, and to
evaluate the contribution of mutation to the clinical phenotype.
The comparison of FVII deficiency with haemophilia
B provides a valuable model for evaluation of
mutation spectra in autosomal or X-linked homologous
genes. FVII and FX deficiencies show extensive similarity in their mutational patterns, with potentially null mutations
less represented in FVII than FIX gene. A few coagulation
factors circulate as multisubunit proteins (FXIII,
fibrinogen, FXI and von Willebrand factor). This implies
that heterozygous mutations can cause severe quantitative
deficiencies (dominant negative effect) through formation
of mutant and wild-type polypeptide heterodimers.
This mechanism has been suggested for von Willebrand
disease and also for factor XI deficiency. Several studies
indicate the presence of genetic and acquired factors
modulating the clinical expression of deficiencies.
Genetic factors have been found to have a major effect on
plasma concentrations of haemostatic proteins. In particular
for FVII, they account for 57-63% of level variations.
Intragenic polymorphisms strongly contribute to
FVII levels in normal subjects and up to 5-fold differences
in FVIIa values are associated to different genotypes.
Combination of polymorphisms and gene mutations
could contribute to clinical variability. Several studies
have highlighted the biosynthetic pathways of coagulation
factors, which include several post-translational
modifications required for factor secretion and function.
Alterations in genes, which participate in the protein
maturation process, are candidate to produce or modulate
coagulation deficiencies, and might contribute to explain
their large variability in the clinical expression. A good
example is offered by combined deficiency of coagulation
factors V and VIII, in which most of the patients have
mutations in genes involved in the intracellular transport
of both factors. Other candidates are suggested by combined
deficiency of all vitamin K-dependent coagulation
factors, a rare bleeding disorder caused by mutations in
the genes coding for the g-glutamyl carboxylase and for
the enzymes involved in the recycling of the reduced
form of vitamin K. Further complexity in the understanding
of genotype-phenotype relationships is represented
by the delicate balance between coagulation/anticoagulation
that ultimately produces the haemostatic phenotype.
Key coagulation factors, like thrombin and FV, have procoagulant
as well as anticoagulant functions.
Coinheritance of FV Leiden leads to enhanced thrombin
generation and can mitigate clinical course in patients
with severe FVII deficiency due to homozygosity for a
splicing mutation, indicating that abnormalities could
counterbalance each other. The knowledge of mechanisms
underlying the phenotypic diversity of the coagulation
deficiencies could improve genetic counselling and
provide elements for individually oriented
prophylaxis/therapy approaches
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