1,721,014 research outputs found
MicroRNA Arm selection and arm switching: a sistematic review
No full textMicroRNAs (miRNAs) são pequenas moléculas que regulam a expressão de genes pós-transcricionalmente em organismos multicelulares, reprimindo a expressão de mRNAs alvos. Esses pequenos RNAs de aproximadamente 22 nt têm a capacidade de reconhecer o RNA mensageiro alvo, por complementaridade de bases. Uma região chave do miRNA chamada de região 'seed' reconhece especialmente a região 3’UTR do mRNA alvo e, junto ao RISC (RNA-Induced silencing complex) protagonizado pela enzima argonauta (AGO), reprime o alvo influenciando a expressão fenotípica do organismo. A depender dos processos a que é submetido durante sua biogênese, o precursor hairpin de um miRNA tem um de seus braços selecionados preferencialmente pelo RISC. Cada um destes braços possui sequências distintas, inclusive, uma região 'seed' determinante para identificação de repertório de mRNAs alvos por complementaridade. Arm switching é um fenômeno de troca da prevalência de braços de microRNAs de um mesmo precursor em resposta à mudança contextual celular através de um conjunto mecanismos que interagem entre eles. Este trabalho tem como objetivo mostrar o atual estado da arte do conhecimento sobre os processos moleculares e fatores biológicos que levam a mudança de braços de miRNA (i.e., arm switching) em animais. No presente estudo, os processos foram categorizados em fatores intrínsecos e extrínsecos devido às propriedades químicas dos miRNAs.MicroRNAs (miRNAs) are small molecules that regulate gene expression post-transcriptionally in multicellular organisms by repressing the expression of target mRNAs. These small RNAs of approximately 22 nt can pair with a target messenger RNA (mRNA), due to base complementarity. A key region of the miRNA called the 'seed' primarily pair with 3' UTR of target mRNA and, together with the RISC (RNA-induced silencing complex) carried out by the enzyme Argonaute (AGO), represses the target, influencing the phenotypic expression of the organism.Depending on the processes to which it is subjected during its biogenesis, the hairpin precursor of a miRNA has one of its arms preferentially selected by the RISC. Each of these arms has distinct sequences, including the 'seed' region for identifying a repertoire of target mRNAs through complementarity. Arm switching is defined as the inversion of the prevalence of one microRNA arm from the one of the same precursor in response to cellular contextual change through a set of mechanisms that interact between them. This work aims to show the current state of the art of knowledge about the molecular processes and biological factors that lead to the change of miRNA arms (i.e., arm switching) in animals. In the present study, the processes were categorized into intrinsic and extrinsic factors due to the chemical properties of miRNAs
Aplicação da genética molecular no manejo e conservação de tubarões
No full textMuitas espécies marinhas estão em risco de extinção devido à exploração excessiva e carência de manejo de nossos oceanos. Reduzir a intensidade do impacto das atividades antrópicas sobre o ambiente marinho é uma tarefa complexa, uma vez que grande parte da população mundial reside próximo às áreas costeiras, e por isso, freqüentemente depende dos recursos marinhos para sua subsistência e lazer. Essa dependência dos seres humanos em relação aos oceanos torna crucial o conhecimento dos ecossistemas marinhos para adequado manejo de seus recursos. Hoje em dia, a pesquisa nessa área é ainda bastante limitada, principalmente, devido às dificuldades de se trabalhar nos oceanos. Entretanto as análises de DNA estão contribuindo significativamente para o nosso conhecimento acerca da distribuição e saúde das populações de espécies marinhas criticamente ameaçadas. Dentre as espécies ameaçadas destaca-se o tubarão-martelo Sphyrna lewini cujas populações naturais estão atualmente em acelerada depleção devido à excessiva exploração pela pesca, principalmente para a comercialização de suas valorizadas nadadeiras nos mercados asiáticos. Esta espécie apresenta características relacionadas à sua disribuição e ao seu ciclo de vida que podem conduzir à estruturação em finaescala de suas populações. No presente trabalho foi verificada a existência de estruturação genética de S. lewini no Atlantico entre as populações do Brasil, Golfo do México e Mar do Caribe. Também foi detectada estruturação em fina escala ao longo da costa do Brasil, possivelmente em função do comportamento filopátrico de fêmeas dessa espécie e à existência de áreas de berçários costeiras. Os dados obtidos no presente trabalho evidenciam que as populações de tubarões-martelo do Atlantico Ocidental são geneticamente distintas, mesmo considerando-se curtas...The scalloped hammerhead shark Sphyrna lewini is a cosmopolitan species heavily exploited for fisheries and fin trade. Here we used mitochondrial DNA control region sequences to trace market-derived Sphyrna lewini fins back to their geographical region of origin. We showed that twenty-one percent of these fins were derived from the Western Atlantic, where this species is endangered. We also evaluated the population genetic structure and differentiation of S. lewini along Western Atlantic employing mtDNA and microsatellites. Our mtDNA results indicate strong population subdivision and four distinct genetic stocks along the studied area due to philopatric females with high fidelity to natal region. Contrarily, males facilitate gene flow dispersal and connection among areas as supported by low genetic differentiation verified in the 10 microsatellite loci analysis. We also report the occurrence of a rare cryptic scalloped hammerhead shark species lineage in the Southeastern Atlantic based on the analysis of nuclear (ITS2) and mitochondrial control region (CR) markers. Finally, we also developed a suite of species-specific primers sharks for global identification of sharpnose sharks (genus Rhizoprionodon). These species are morphologically very similar to one another and exhibit life-history characteristics (rapid growth, early maturity, annual reproduction) that suggests that they could be fished in a sustainable manner assuming an investment in monitoring, assessment and careful management. Here we successfully validated an approach that accurately distinguishes sharpnose sharks from a wide range of other sharks (52 species) and can therefore assist in the regulation of coastal shark fisheries around the worldFundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP
Aplicação da genética molecular no manejo e conservação de tubarões
No full textMuitas espécies marinhas estão em risco de extinção devido à exploração excessiva e carência de manejo de nossos oceanos. Reduzir a intensidade do impacto das atividades antrópicas sobre o ambiente marinho é uma tarefa complexa, uma vez que grande parte da população mundial reside próximo às áreas costeiras, e por isso, freqüentemente depende dos recursos marinhos para sua subsistência e lazer. Essa dependência dos seres humanos em relação aos oceanos torna crucial o conhecimento dos ecossistemas marinhos para adequado manejo de seus recursos. Hoje em dia, a pesquisa nessa área é ainda bastante limitada, principalmente, devido às dificuldades de se trabalhar nos oceanos. Entretanto as análises de DNA estão contribuindo significativamente para o nosso conhecimento acerca da distribuição e saúde das populações de espécies marinhas criticamente ameaçadas. Dentre as espécies ameaçadas destaca-se o tubarão-martelo Sphyrna lewini cujas populações naturais estão atualmente em acelerada depleção devido à excessiva exploração pela pesca, principalmente para a comercialização de suas valorizadas nadadeiras nos mercados asiáticos. Esta espécie apresenta características relacionadas à sua disribuição e ao seu ciclo de vida que podem conduzir à estruturação em finaescala de suas populações. No presente trabalho foi verificada a existência de estruturação genética de S. lewini no Atlantico entre as populações do Brasil, Golfo do México e Mar do Caribe. Também foi detectada estruturação em fina escala ao longo da costa do Brasil, possivelmente em função do comportamento filopátrico de fêmeas dessa espécie e à existência de áreas de berçários costeiras. Os dados obtidos no presente trabalho evidenciam que as populações de tubarões-martelo do Atlantico Ocidental são geneticamente distintas, mesmo considerando-se curtas...The scalloped hammerhead shark Sphyrna lewini is a cosmopolitan species heavily exploited for fisheries and fin trade. Here we used mitochondrial DNA control region sequences to trace market-derived Sphyrna lewini fins back to their geographical region of origin. We showed that twenty-one percent of these fins were derived from the Western Atlantic, where this species is endangered. We also evaluated the population genetic structure and differentiation of S. lewini along Western Atlantic employing mtDNA and microsatellites. Our mtDNA results indicate strong population subdivision and four distinct genetic stocks along the studied area due to philopatric females with high fidelity to natal region. Contrarily, males facilitate gene flow dispersal and connection among areas as supported by low genetic differentiation verified in the 10 microsatellite loci analysis. We also report the occurrence of a rare cryptic scalloped hammerhead shark species lineage in the Southeastern Atlantic based on the analysis of nuclear (ITS2) and mitochondrial control region (CR) markers. Finally, we also developed a suite of species-specific primers sharks for global identification of sharpnose sharks (genus Rhizoprionodon). These species are morphologically very similar to one another and exhibit life-history characteristics (rapid growth, early maturity, annual reproduction) that suggests that they could be fished in a sustainable manner assuming an investment in monitoring, assessment and careful management. Here we successfully validated an approach that accurately distinguishes sharpnose sharks from a wide range of other sharks (52 species) and can therefore assist in the regulation of coastal shark fisheries around the worldFundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP
Investigation of genetic mechanisms associated with intermuscular bone formation pathways in Tambaqui (Colossoma macropomum)
No full textDiversas espécies de peixes de importância na aquicultura mundial possuem ossos intermusculares (IBs) ou espinhas, como são popularmente conhecidos. Esses IBs são uma característica comercialmente indesejável por reduzir a palatabilidade dos peixes, sendo necessária sua remoção para a produção do filé, o que resulta em impactos econômicos e de frescor do produto. O tambaqui, Colossoma macropomum, é uma espécie dulcícola neotropical da ordem Characiformes que apresenta grande potencial para a aquicultura, mas que, no entanto, possui a desvantagem de gerar os IBs. Recentemente, numa população cultivada de tambaqui, foram reportados indivíduos com ausência de IBs, sugerindo que variantes genéticas e/ou epigenéticas estejam associadas à geração do fenótipo mutante. O objetivo deste trabalho foi investigar os mecanismos moleculares associados à formação dos ossos intermusculares, de modo a contribuir para a geração de animais com maior valor econômico agregado. Para isso foi analisada a expressão de genes codificadores e genes não codificadores associados às vias de formação dos IBs, além da caracterização temporal de formação dos IBs durante o desenvolvimento. Com base na literatura, foram inicialmente selecionados para estudo três genes candidatos à atuação nas vias de ossificação intramembranosa: bmp4, runx2 e mstn. Estes foram avaliados na F1 quanto à expressão no intervalo de crescimento que compreende desde o início até a completa formação dos IBs, nos comprimentos 18, 20, 23 e 26mm. Inicialmente foi realizada a desova com as matrizes que apresentaram o fenótipo mutante desejado (sem IBs) e um grupo controle (com IBs), seguido do cultivo dos alevinos e monitoramento dos mesmos para determinação do momento de início da ossificação dos IBs ou verificação de ausência destes. Posteriormente foi realizada a coleta de tecidos da região próxima ao pedúnculo caudal seguida da extração de RNA e síntese de cDNA desses indivíduos para subsequente análise de perfis de expressão gênica por qPCR. Concomitantemente, foi realizada a fixação e diafanização de alevinos em diferentes fases do desenvolvimento para a caracterização morfológica dos IBs. O RNA total foi isolado das matrizes mutante e controle para sequenciamento em larga escala de miRNAs (miRNA-Seq). Como resultados verificou-se que os IBs no tambaqui são formados a partir de 15 mm de comprimento total, anterior ao previamente reportado para outros teleósteos. A análise comparativa de expressão do bmp4 revelou diferença significativa entre mutantes e controle, havendo uma diminuição na expressão na F1 dos grupos mutantes, principalmente nos comprimentos considerados de ativa mineralização óssea (i.e., 20 e 23mm). O runx2b também apresentou diferença significativa entre mutantes e controle, porém o pico de diminuição de expressão ocorreu nos animais com 20mm de comprimento. Por outro lado, a mstn apresentou, um aumento significativo de expressão nos mutantes sem IBs na comparação aos animais controle, sugerindo possível envolvimento desses genes nas vias associadas a formação dos IBs. O miRNA-seq revelou a expressão de miRNAs importantes para a regulação de vias de formação óssea, incluindo os atuantes na regulação dos três genes codificantes alvo analisados, além da detecção de novos miRNAs exclusivamente expressos apenas nos tambaquis mutantes sem IBs. Este é um dos primeiros estudos onde avaliou-se a expressão de genes envolvidos na formação óssea em espécie de peixe neotropical, cujos espécimes foram obtidos pelo acasalamento de matrizes mutantes sem IBs. Adicionalmente trata-se da primeira análise do microRNAoma completo para investigação do fenótipo mutante sem ossos intermusculares. Esses dados inéditos gerados fornecem subsídios para trabalhos futuros visando a produção de linhagens de tambaqui sem IBs, com grande potencial para melhoria de produtividade na aquicultura.Several species of fish with importance in aquaculture worldwide have intermuscular bones (IBs) or spines, as they are popularly known. These IBs are a commercially undesirable characteristic because they reduce the palatability of the fish, requiring their removal for production of the fillet, which results in economic and freshness impacts of the product. Tambaqui, Colossoma macropomum, is a neotropical sweet species of the order Characiformes that has great potential for aquaculture, but which has the disadvantage of generating IBs. Recently, in a cultivated population of tambaqui, individuals with absence of IBs have been reported, suggesting that genetic and/or epigenetic variants are associated with the generation of the mutant phenotype. The objective of this work was to investigate the molecular mechanisms associated with the formation of intermuscular bones, in order to contribute to the generation of animals with greater added economic value. For this purpose, the expression of coding genes and non-coding genes associated with the pathways of IBs formation was analyzed, in addition to the temporal characterization of the formation of IBs during development. Based on the literature, three candidate genes were initially selected for study in the intramembranous ossification pathways: bmp4, runx2 and mstn. These were evaluated for expression in the growth interval that comprises from the beginning until the complete formation of the IBs, in lengths 18,20,23 and 26mm. Initially, the spawning was carried out with the matrices that present the desired mutant phenotype (without IBs) and a control group (with IBs), followed by the cultivation of fingerlings and their monitoring to determine the time of ossification beginning of the IBs or absence of these. Subsequently, tissue was collected from the region close to the caudal peduncle followed by RNA extraction and cDNA synthesis of these individuals for subsequent analysis of gene expression profiles by qPCR. Concomitantly, the fixation and diaphanization of fingerlings at different stages of development was carried out for the morphological characterization of IBs. The total RNA was isolated from the mutant and control matrices for large-scale sequencing of miRNAs (miRNA-Seq). As a result, it was found that the IBs in tambaqui are formed from a total length of 15 mm, prior to previously reported. The comparative analysis of bmp4 expression revealed a significant difference between mutants and control, with a decrease in the expression of the mutante groups, mainly in the lengths considered to be active bone mineralization (i.e., 20 and 23mm). Runx2b also showed a significant difference between mutants and control, but the peak of decreased expression occurred in animals with 20mm in length. On the other hand, mstn showed a significant increase in expression in mutants without IBs compared to control animals, suggesting possible involvement of these genes in the pathways associated with the formation of IBS. MiRNA-seq revealed the expression of miRNAs important for the regulation of bone formation pathways, and others potentially active in the regulation of the three coding genes analyzed in RT-qPCR, in addition to the detection of new miRNAs exclusively expressed only in mutant tambaquis without IBs. This is the first study to evaluate the expression of genes involved in bone formation in neotropical species, whose pecimens originated from the mating of mutant matrices without IBs. Additionally, it is the first analysis of the complete microRNAoma to investigate the mutant phenotype without intermuscular bones. These unprecedented data provide subsidies for future work to produce tambaqui strains without IBs, with great potential for improving productivity in aquaculture.Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)FAPESP: 2018/11795-8CAPES: 00
Regulatory action of microRNAs during epimorphic regeneration in zebrafish (Danio rerio) caudal fin
No full textRegeneração é a capacidade de reconstruir partes do corpo e formar uma nova estrutura, idêntica morfológica e funcionalmente àquela perdida. De modo geral, a habilidade de regenerar tecidos, órgãos e membros é evolutivamente conservada nos vertebrados, ainda que envolva a ativação de processos celulares distintos, como desdiferenciação, reorganização e rediferenciação das células adjacentes ao tecido injuriado ou amputado. A regeneração denominada "epimórfica", comum em diversos teleósteos, anfíbios e répteis, caracteriza-se pela formação de um agregado de células desdiferenciadas (blastema) que posteriormente se rediferenciam, proliferam e migram para recompor a estrutura originalmente perdida. Durante a regeneração epimórfica, típica na nadadeira caudal do teleósteo zebrafish (Danio rerio), ocorre extensa desdiferenciação celular de células ósseas (osteoblastos) ativada por mecanismos genéticos ainda não completamente elucidados. Do mesmo modo, pouco se conhece acerca dos mecanismos epigenéticos mediados por microRNAs (miRNAs, pequenos RNAs regulatórios) atuantes no controle da desdiferenciação celular durante a regeneração. Neste contexto, o presente estudo teve por objetivo caracterizar a atividade de microRNAs na regulação de genes alvo importantes nos processos celulares relacionados à regeneração epimórfica da nadadeira caudal no modelo zebrafish. Para isso, realizamos a amputação da nadadeira caudal e coletamos tecidos de 80 zebrafish, subdivididos em 8 grupos experimentais: 0, 12, 24, 36, 48, 72, 96 e 120 horas pós-amputação (hpa). Essas amostras foram subdividas e utilizadas para o sequenciamento em larga escala de microRNAs (miRNA-seq) dos períodos 0, 24 , 48 e 72 hpa e para PCR quantitativo em Tempo Real (qPCR), após etapa prévia de predição in silico para seleção de miRNAs (miR-20a-3p, miR-203a-3p, miR-203a-3p, miR-19a-5p e let-7c-3p) e genes alvo candidatos expressos em células ósseas (sp7, runx2, bglap e spp1) potencialmente atuantes nas vias de interesse do estudo. Também realizamos análises in silico explorando bancos de dados públicos para avaliar se existe conservação evolutiva, nos diferentes grupos de vertebrados, das interações miRNA-alvo preditas. Os dados gerados por miRNA-seq revelaram mais de 600 microRNAs maduros expressos na região da amputação, sendo 37 miRNAs diferencialmente expressos nos 4 períodos pós-amputação analisados, e 14 miRNAs reconhecidos como relevantes nos processos de formação e reparo do tecido ósseo, com base na literatura. Além disso três miRNAs novos, ainda não reportados previamente no zebrafish, tiveram expressão detectada em nosso estudo. Com a análise do perfil de expressão por qPCR, identificamos o pico de expressão dos genes alvo próximo a 12hpa, sugerindo que este se constitui em um período crítico para a ocorrência de desdiferenciação de osteoblastos. A comparação temporal dos perfis de expressão pós-amputação também mostrou expressão negativamente correlacionada entre o gene sp7 e os quatro miRNAs selecionados, indicando uma potencial atividade coordenada na regulação deste e dos demais genes avaliados. As análises evolutivas revelaram que os sítios de interação do gene sp7 (na região 3'UTR do gene) aos miRNAs possuem mutações específicas em suas sequências de DNA nas diferentes espécies estudadas, mostrando que os processos moleculares de regeneração epimórfica não são conservados entre os grupos de vertebrados. Interessantemente, nas espécies de mamíferos, cujas sequências 3'UTR de sp7 são menores e variáveis, não foram detectados sítios de interação para os miRNAs estudados, o que está de acordo com a ausência de ativação da resposta de regeneração epimórfica mediada por blastema observada nesses animais. Juntos, esses resultados evidenciam que a regulação gênica mediada por microRNAs é um mecanismo importante para que haja regeneração epimórfica, particularmente durante a desdiferenciação de osteoblastos induzida pela modulação da atividade de sp7 que culmina na formação do blastema e restauração da estrutura danificada.Regeneration is the ability to regain lost parts, making new structures morphologically and functionally identical to the lost one. Generally, this ability to regenerate tissues, organs and limbs is evolutionarily conserved on vertebrates, even if it involves the activation of distinct cellular processes, such as dedifferentiation, reorganization and redifferentiation of cells around to the injured or amputated tissue. The regeneration so-called “epimorphic”, found in teleost fish, amphibians and reptiles, is characterized by a blastema, a mass of dedifferentiated cells that will differentiate, proliferate and migrate to rebuild the lost structure. During epimorphic regeneration, typically found in the caudal fin of the teleost zebrafish (Danio rerio), there is an huge cell dedifferentiation of osteoblasts (bone cells) activated by genetic mechanism that have not yet been fully elucidated. Likewise, little is known about the epigenetic mechanisms mediated by microRNAs (miRNAs, small regulatory RNAs) acting in the control of cell dedifferentiation during regeneration. In this context, the present study aimed to characterize the activity of microRNAs in the regulation of important target genes in cellular processes related to epimorphic regeneration of the caudal fin in the zebrafish. To do so, we performed the amputation of the caudal fin and from 80 zebrafish and collected its tissue dividing it in 8 experimental groups: 0, 12, 24, 36, 48, 72, 96 and 90 hours post amputation (hpa). These samples were subdivided and used to perform a large-scale sequencing of microRNAs (miRNA-seq) of the periods 0, 24, 48 and 72 hpa and a real time quantitative PCR (qPCR), after a previous in silico prediction to select miRNAs (miR-20a-3p, miR-203a-3p, miR-203a-3p, miR-19a-5p e let-7c-3p) and target genes to be expressed in bone cells (sp7, runx2, bglap e spp1), potentially present on the investigated pathways of this study. We also performed in silico analysis exploring public databases to evaluate the possibility of evolutive conservation of the miRNA-target interactions predicted in different vertebrate groups. Our data from miRNA-seq shown more than 600 mature microRNAs expressed in the amputation site, with 37 of then differentially expressed in the 4 periods post amputation, and 14 miRNAs known as relevant on process of bone tissue repair and formation, based on literature. Also, three new miRNAs, yet not previously reported on zebrafish, had its expression detected on our study. The expression profile by qPCR have shown a peak of target genes expression close to the 12 hpa, suggesting that it is a critic period for the differentiation of osteoblasts. The comparison of post amputation’s temporal expression profile also shown a negative correlated expression between sp7 gene and the four selected miRNAs, evince a potential coordinated activity on the regulation of this and the other genes analysed. The evolutive analyses revealed that the interaction sites of sp7 gene (at the 3’UTR region) for miRNAs have specific mutations in their DNA sequences on all of the studied species, showing that the molecular process of epimorphic regeneration are not conserved between the vertebrate groups. Interestingly, on mammals species, where sp7 3’UTR sequences are smaller and variable, ware not detected interaction sites for the analyzed miRNAs, what agrees with the absence of response activation of epimórfica regeneration mediated by blastema formation in these animals. Altogether, our results evince that the genic regulation mediated by miRNAs is an important mechanism for the epimorphic regeneration to happens, specifically during the dedifferentiation of osteoblasts induced by the sp7’s activity modulation that ends in the blastema formation and restoration of the damaged structure.Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)FAPESP: 2018/05484-
Functional genomics of micrornas in heart of vertebrates: using zebrafish as model organism
No full textNos vertebrados, o coração é o primeiro órgão a se formar e adquirir função no embrião e todos os eventos subsequentes na vida do organismo dependem de sua atividade. Ao longo da evolução desses animais, incluindo o Homo sapies, o coração adquiriu traços morfofuncionais distintos, resultando em fenótipos característicos nas mais variadas espécies viventes. Entretanto a base molecular que sustenta a variação fenotípica permanece pouco conhecida. Uma vez que o genoma desses animais é relativamente conservado quanto à estrutura e função, é plausível pensar que as variações morfofuncionais resultem, em grande parte, da expressão diferencial de genes e seus reguladores. MicroRNAs (miRNAs) são pequenos RNAs não codificantes com importante função na regulação gênica pós-transcricional. Essas moléculas reconhecidamente atuam nosmais variados processos biológicos, incluindo as vias de biogênese e manutenção cardíaca. Contudo, até o momento, são escassos os dados disponíveis que tratam do impacto da atividade de miRNAs no desenvolvimento e evolução do coração de vertebrados. No presente estudo, com o objetivo de gerar novos conhecimentos acerca da base molecular da variabilidade fenotípica do coração, foi realizada a caracterização e análise comparativa das assinaturas de expressãodo conjunto total de miRNAs no coração de espécies representativas dos cinco grandes grupos de vertebrados. Para isso, os transcritos de miRNAs de amostras detecido cardíaco de 13 espécies distintas foram investigados por RNA-seq e detalhadamente analisados por bioinformática. Como resultado, foi verificada a expressão conservada de 32 miRNAs em todas as 13 espécies analisadas, indicando a atuação de forças seletivas mantenedoras sobre essas moléculas reguladoras, cuja importância biológica se manifesta independentemente do tempo de divergência filogenética que separa esses organismos. Adicionalmente, a análise de ontologia gênica revelou que todos os 32 miRNAs conservados possuem funções relacionadas ao desenvolvimento e ritmo cardíaco, características primordiais para explicar a evolução diferencial da morfologia cardíaca. Além disso, analisou-se o papel do miR-129 na regulação da expressão do gene Bmp4, importante para o desenvolvimento cardíaco, verificando-se a potencial interação entre essas moléculas in vivo em embriões de zebrafish. Análises funcionais entre o miR-129 e os fatores Tbx, que estão em andamento, irão contribuir significativamente para a elucidação da participação desse miRNA no tecido cardíaco no genoma de vertebrados.In vertebrates, heart is the first organ to form in the embryo and all subsequent events in the life of an organism depend on its function. Heart has acquired distinct morphological traits during vertebrate evolution, which leaded to distinct morphology traits in the living species. However, the molecular mechanisms that drive the differential morphology among these species remain uncharted. Taking into consideration the higher level of conservation of the genome among these species, we can infer that the differential expression of genes and regulators lead to the distinct pattern of heart morphology. MicroRNAs (miRNAs) are small molecules with an important role upon post-transcriptional regulation. These molecules have been shown essential for several cellular processes in vertebrates, including cardiac biology, but little is known about the roles of these small molecules in the development and evolution process of vertebrate’s heart. In the present study, we characterized the global expression of miRNAs in the heart of species from the five vertebrate groups, (fish, amphibians, reptiles, birds and mammals) and performed an evolutionary comparative analysis of miRNA expression signatures in order to bring novel insights about the molecular basis of heart phenotypic variability. RNA-seq was used to characterize miRNA expression profiles in the heart of 13 vertebrate species and deeply analyzed using bioinformatics. We found 32 miRNAs with conserved expression to all 13 species analyzed, indicating a conserved pathway of these miRNAs despite of the large divergence times isolating these organisms. GO analysis from 32 miRNAs in the human genome revealed that conserved miRNAs has functions on heart development and contraction rate, traits considered crucial for the differential morphology of the heart observed from fish to mammals. Furthermore, we validate the molecular interaction between miR-129 and Bmp4, important gene for the heart development. Moreoever, the functional analysis of interaction between miR-129 and Tbx factors will help elucidate the biological importance of miR-129 along heart development in vertebrates.Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)FAPESP: 2013/06864-
Molecular characterization of heterotic hybrids of the Red Stirling and Chitralada lines of Nile tilapia (Oreochromis niloticus)
No full textA tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus) possui importância econômica na piscicultura mundial. Com a finalidade de atender à demanda do mercado consumidor, foram desenvolvidas várias linhagens com maior viabilidade econômica, dentre elas a Chitralada, que possui rápido crescimento, e a Red Stirling, com filé de cor rosado, mais apreciado pelo consumidor. Com o objetivo de combinar estas características, foi desenvolvido um híbrido, que apresentou heterose. A pesquisa genética em peixes mostrou a interferência direta e indireta de vários genes no desempenho animal, principalmente os genes relacionados ao eixo GH/IGF e a miostatina (MSTN). Além disso, uma classe de RNAs não-codificadores, os microRNAs (miRNAs), possuem papel fundamental na regulação de vários pontos em vias biológicas conhecidas, principalmente na modulação de genes codificadores de proteínas relacionadas ao crescimento. Portanto, o objetivo deste trabalho foi avaliar a expressão gênica dos genes relacionados ao eixo GH/IGF e MSTN; determinar os miRNAs envolvidos e seus alvos; e avaliar o conjunto de proteínas relacionando-as aos respectivos fenótipos. Amostras biológicas foram coletadas das linhagens Chitralada e Red Stirling e do híbrido (7/8 Chitralada). Para a análise de expressão gênica por RT-qPCR, foram coletadas amostras de cérebro, fígado e músculo branco. Para a análise de miRNAs por RNA-seq, foram utilizados pools das amostras de músculo branco, assim como para a análise por ESI-q-TOF e shotgun. Os genes relacionados ao eixo GH/IGF foram super expressos e a MSTN sub expressa no híbrido em relação aos seus parentais. Os dados de expressão dos miRNAs let-7, miR-122, miR-194 e miR-219 corroboram com os dados de expressão dos genes alvos.. Na comparação entre os perfis de expressão de miRNAs e proteínas, verificou-se que proteínas oriundas de genes alvos de miRNAs sub expressos estavam altamente expressas sugerindo atividade regulatória. Conclui-se que existe uma ação dos miRNAs em proteínas associadas às vias metabólicas relacionadas à heterose na tilápia do Nilo.Nile tilapia (Oreochromis niloticus) has great economic importance in world fish farming. To attend the commercial demand, several lines were developed, among them: Chitralada, with fast growth, and Red Stirling, with red color fillet of pink, which is more appreciated by the consumer. With the aim to combine the main characteristic of these lines, a crossbreed was developed, which also showed heterosis. Although crossbreeding between lines, or species, is a common breeding strategy for producing animals with heterosis, the molecular mechanisms that affect gene expression and biological pathways to create this phenotype still understood. Genetic research on fish showed the direct and indirect interference of several genes in animal performance, especially genes related to the GH/IGF axis and myostatin (MSTN). In addition, a class of non-coding RNAs, microRNAs (miRNAs), play a key role in regulating many biologically known pathways, mainly growth-related. Therefore, this study aimed to evaluate the GH/IGF axis genes expression and MSTN; determine the miRNAs involved and their targets; and the protein involved in the heterosis fenotype. Morphometric parameters, such as weight and length, were collected from the 4th to the 6th month of life. Biological samples were also collected from the Chitralada and Red Stirling, and their crossbreed (7/8 Chitralada). For the analysis of gene expression by RT-qPCR, brain, liver and white muscle samples were collected, ; for miRNA analysis, samples of white muscle were used, as well as ESI-q-TOF and shotgun GH/IGF axis genes were sup-regulated and the MSTN downregulated in crossbreed in relation to their parents. Analysis of the miRNAs showed that let-7, miR-122, miR-194 and miR-219 in the crossbreed are associated with the qPCR data. Regarding the comparison of the miRNAs and with the proteins, several miRNAs showed to be sub expressed and consequently there was increase in the expression of the proteins that have targets of these miRNAs in their genes. We conclude that there is an action of miRNAs on proteins associated with the metabolic pathways and may be responsible for heterosis in Nile tilapia.Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)CNPq: 158284/2013-5FAPESP: 2014/03062-
Meta-classificatory evaluation of miRNA target prediction tools and functional enrichment analysis of targets using Homo sapiens as biological model
No full textMicroRNAs (miRNAs) são pequenos RNAs não codificadores que regulam uma ampla gama de vias biológicas. Esta regulação ocorre através do pareamento complementar entre o miRNA e seu RNA mensageiro (mRNA) alvo, gelramente na região 3’UTR, inibindo a síntese proteica. Diversos trabalhos têm buscado determinar as funções biológicas desempenhadas pelos miRNAs por meio da identificação de seus alvos e posterior análise de enriquecimento funcional. Entretanto, as ferramentas de predição de alvos in silico disponíveis atualmente apresentam resultados pouco robustos e não há um consenso sobre a melhor ferramenta e estratégia para análise dos dados. Adicionalmente, a metodologia de enriquecimento funcional atual não leva em conta diversos fatores fundamentais atuantes na regulação dos alvos dos miRNAs, retornando resultados inconsistentes que culminam em experimentos de validação desnecessários e pouco específicos, com consequente desperdício de tempo e recursos. Desta maneira, o presente trabalho tem como objetivos (i) elaborar metodologia de predição de alvos com alta eficiência utilizando as ferramentas de bioiformática disponíveis e (ii) avaliar a regulação dos processos biológicos controlados pelos miRNAs através da análise de enriquecimento funcional, considerando o foldchange de seus mRNA alvo. Para tal, comparou-se as performances das três ferramentas de predição de alvos atualmente mais utilizadas (TargetScan, miRanda-mirSVR, e Pita), assim como testou-se todas as possibilidades de combinação dos dados gerados por cada ferramenta (uniões e/ou intersecções). A metodologia de união das ferramentas TargetScan + miRanda-mirSVR resultou na melhor performance, com o melhor balanço entre sensibilidade e especificidade. Posteriormente, dados de expressão de genes alvos obtidos por microarray após a superexpressão de onze miRNAs foram utilizados para as análises de enriquecimento funcional. Os alvos dos miRNAs foram agrupados manualmente em cinco clusters de acordo com seu fold-change. Os clusters foram então submetidos à análise de enriquecimento funcional. Os processos biológicos enriquecidos por esta análise foram distintos em cada cluster, sugerindo que os miRNAs regulam com intensidade semelhante genes associados a uma mesma função biológica, mas funções biológicas distintas são reguladas com intensidades diferentes. Os resultados obtidos neste projeto aprimoram significativamente a qualidade das análises in silico de predição de alvos, o que permitirá aos pesquisadores obterem resultados mais robustos durante a identificação de alvos dos miRNAs. Adicionalmente, a análise de enriquecimento funcional realizada sugere uma nova complexidade dos miRNAs, podendo justificar o fato de um único miRNA ser capaz de regular processos biológicos distintos com a especificidade demandanda para cada processo dentro de um contexto celular.MicroRNAs (miRNAs) are short non-coding RNAs that regulates a wide range biological pathways. This regulation occurs by the complementary biding between miRNA and its target Messenger RNA (mRNA), mainly at 3’UTR region, blocking the protein sinthesis. Several works tries to identify the biological functions that miRNAs are assign by detecting its mRNA targets and performing functional enrichment analysis using bioinformatic tools. However, in silico target prediction tools available nowadays often return little robust results and there is no consensus about a tool that highlights from the others or if combining the results from more than one tool improves the quality of the analysis. Moreover, the functional enrichment metodology used nowadays do not take in account several important aspects of the regualtion of the miRNA targets, thus generates inconsistent results. This way, the objectives of this project are (i) to elaborate a target prediction method with high efficience using the available tools and (ii) to evaluate the regulation of the biological process controled by the miRNAs by functional analysis considering the fold-change levels of the target mRNAs. To do this, we compared the performances of the three most used target prediction tools (TargetScan, miRanda-mirSVR and Pita), as well as all combinatorial possibilities of these tools (unions and intersections). The union of TargetScan + miRandamirSVR returned the greatest performance, with the bese balance between sensitivity e specificity. After, microarray data from gene expression after super-expression of eleven miRNAs were used for the functional enrichment analysis. The miRNA targets were grouped in five clusters according to their fold-change levels after the superexpression of the miRNAs. The clusters were individually submited to functional enrichment analysis. The enriched biological process were distinct in each cluster, suggesting that miRNAs control genes assign with one function with similar intensity, but distinct biological process are controled with distinct intensities. The results obtained in this project improved the quality of in silico target prediction analysis, which can help researchers obtaining results with more quality when performing miRNA target prediction. Moreover, the funcional enrichment analysis suggests a new complexity of miRNAs, and could jusity the fact of an unique miRNA be capable of control several bilogical process with the specificity required for each one within the celular context.Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)CNPq: 131265/2015-
Identification and characterization of the long non-coding RNAs (lncRNAs) involved in the intermuscular bone formation in tambaqui (Colossoma macropomum)
No full textA produção e a qualidade dos alimentos produzidos, assim como a sustentabilidade ambiental e a crise humanitária atual são alguns dos desafios a serem transpostos nas próximas décadas e a aquicultura é um dos setores de produção de alimentos emergentes. No Brasil, a produção de peixes apresenta taxas de crescimento anuais e dentre as espécies produzidas, o tambaqui (Colossoma macropomum) constitui-se na espécie nativa mais cultivada e consumida, entretanto apresenta uma característica indesejável, que é a presença de espinhas, também denominadas ossos intermusculares. Em termos funcionais, falta consenso sobre o exato papel desempenhado desses ossos, além de diversas espécies serem naturalmente desprovidas, sem que haja quaisquer indícios de perda de funcionalidade. Embora existam estudos descrevendo os processos biológicos associados ao desenvolvimento do tambaqui, detalhes das vias moleculares acabam sendo não resolutivos a ponto de elucidar a via de formação dos ossos intermusculares e transcritos codificantes e não-codificantes reguladores chave atuantes, cuja modulação poderia levar à redução numérica ou mesmo à eliminação dos ossos intermusculares em peixes. O objetivo é a identificação e caracterização de RNA não-codificantes de cadeia longa potencialmente envolvidos no processo de formação de ossos intermusculares do Colossoma macroporum, que estejam diferencialmente expressos entre os grupos de interesse CY (com espinhas intermusculares) e SY (sem espinhas intermusculares). Amostras dos grupos de interesse foram coletadas e submetidas a sequenciamento de transcriptoma total (WTS). Em seguida, os dados foram processados com técnicas de bioinformática para a identificação dos transcritos, onde um total de 68 moléculas de lncRNA diferencialmente expressos foram identificadas, indicando que esses transcritos podem possuir um papel na formação das espinhas intermusculares do tambaqui. Foi possível caracterizar algumas das moléculas encontradas pela inferência de funções putativas por meio do mapeamento destas moléculas com o genoma anotado de Colossoma macropomum, onde encontramos potenciais alvos de regulação destas moléculas, como os genes vWA, COL6A3, pfam01391 e FN3, que possuem papéis importantes no desenvolvimento, diferenciação celular e formação de fibras de colágeno, funções associadas à formação de espinhas.Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)FAPESP: 22/03353-
Perfil de expressão e organização genômica de micrornas músculo-específicos na tilápia-do-nilo (Oreochromis nicoticus)
No full textMicroRNAs são pequenas moléculas de RNA que regulam pós-transcricionalmente a expressão gênica em diversas vias celulares específicas. Recentemente, alguns miRNAs de ação músculo-específica, especialmente aqueles expressos no músculo estriado esquelético, têm sido associados à regulação da biologia muscular, com papel fundamental no controle de eventos como miogênese e crescimento muscular hipertrófico e hiperplásico, além de constituírem vias metabólicas extremamente conservadas entre os vertebrados. A tilápia do Nilo é considerada um excelente modelo biológico para o estudo de miRNAs em vertebrados devido à sua importância econômica e por apresentar o genoma completo sequenciado. Contudo, pouco é conhecido a respeito da dinâmica evolutiva de miRNAs e sua potencial atuação na regulação dos mecanismos moleculares promotores do desenvolvimento do tecido muscular na espécie. Assim, foram realizados dois estudos direcionados para a (i) avaliação do perfil de expressão de miRNAs músculo-específicos e seus alvos no tecido muscular de adultos da tilápia do Nilo, e para (ii) analisar o padrão de organização genômica desses miRNAs em diferentes espécies de peixes e estabelecer comparações com outros grupos de vertebrados. Os principais resultados obtidos na análise do perfil de expressão no tecido muscular esquelético de cinco miRNAs músculo-específicos (miR-1, -133a, -133b, -206 e -499) evidenciaram um alto nível de expressão do miR-499 no músculo vermelho em comparação aos níveis observados no músculo branco. Esses dados, corroborados pela hibridação in situ e análise da expressão de genes alvo do miR-499, sugerem sua participação como elemento central na regulação de vias metabólicas particularmente ativas no músculo de contração lenta (vermelho) na tilápia do Nilo. De modo geral, as análises genômicas...MicroRNAs are small RNA molecules that post-transcriptionally regulate gene expression in various specific cell pathways. Recently, some miRNAs have been described to have a muscle-specific action and has been associated with regulation of muscle biology with fundamental roles in myogenesis. The Nile tilapia is considered an excellent biological model for the study of miRNAs in vertebrates due to their economic importance and to present the complete genome sequenced. However, little is known about the evolutionary dynamics of miRNAs and their potential role in regulating the molecular mechanisms that promote the muscle development on Nile tilapia. Thus, two studies were conducted: (i) a study to evaluate the expression pattern of muscle-specific miRNAs and their targets in different skeletal muscle types in adults of Nile tilapia, and (ii) a study to analyze the comparative evolutionary dynamics and genomic organization of these miRNAs in fish genomes. Our expression analysis by qPCR and in situ hybridization, carried out on five muscle-specific miRNAs (miR-1, -133a, -133b, -206 and -499), revealed a highly differential expression of miR-499 in red skeletal muscle (slow-twitch). These data evidenced the key role played by the miR-499 in the maintenance of the slow-twitch muscle type in Nile tilapia. The comparative genomic analysis performed on six species of fish showed a conserved dynamism for the muscle-specific miRNAs analyzed (miR-1-1/-133a-2, miR-1-2/133a-1, miR-206/133b, miR-214 e miR-499). However, a copy of miR-214 was detected in the genome of five species belonging to the superorder Acanthopterygii. Interestingly, this copy also has a high level of synteny over the species when it was detected. Thus, the obtained data may assist in the understanding of the role of muscle-specific miRNAs in muscle biological pathways... (Complete abstract click electronic access below)Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES
- …
