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Crosstalk between FGF and Notch signaling pathways during the collective migration of parapineal cells in the left right asymmetric zebrafish brain
No full textLors du développement de l'asymétrie gauche droite dans le cerveau du poisson zèbre, un petit groupe de cellules, le parapinéale, migre collectivement depuis la ligne médiane vers la partie gauche de l'épithalamus. Cette migration est défectueuse dans des mutants pour le gène fgf8, indiquant que le facteur Fgf8 (Fibroblast Growth Factor 8), sécrété de part et d'autre de la ligne médiane, est requis pour la migration. Cependant, l'orientation gauche de la migration dépend de l'activation, plus précocement dans l'épithalamus gauche, de la voie de signalisation Nodal/TGFb (Transforming Growth Factor). Par conséquent, la parapinéale est un modèle de choix pour comprendre comment les cellules migrent collectivement en réponse aux Fgf et pour étudier comment d'autres voies de signalisation modulent ce processus. L'imagerie en temps réel d'un transgène rapporteur de la signalisation FGF a révélé que la voie FGF est activée préférentiellement dans quelques cellules de tête, c'est à dire localisées au front de migration. L'expression globale d'un récepteur aux Fgf activé de façon constitutive (CA-FgfR1) interfère avec la migration de la parapinéale en contexte sauvage mais est capable de restaurer à la fois la migration de la parapinéale et l'activation focale de la voie FGF au front de migration dans les mutants fgf8-/-. De plus, l'activation focale de la voie FGF dans seulement quelques cellules de parapinéale est suffisante pour restaurer la migration de tout le collectif dans les mutants fgf8-/-. Finalement, nos données montrent que la signalisation Nodal contribue à restreindre et à biaiser l'activation de la voie FGF afin d'orienter la migration de la parapinéale vers le côté gauche (Manuscript n°1). Par la suite, mes travaux de thèse ont visé à comprendre comment l'activation de la voie FGF est restreinte à quelques cellules, bien que toutes les cellules de parapinéale semblent compétentes pour activer la voie. Nos résultats montrent que la signalisation Notch est capable de restreindre l'activation de la voie FGF. La perte ou le gain de fonction de la voie Notch entrainent respectivement une augmentation ou une diminution de l'activité FGF, associés à des défauts de migration de la parapinéale dans les deux contextes. De plus, la diminution ou l'augmentation artificielle du niveau d'activation de la voie FGF peut respectivement restaurer la migration de la parapinéale ou aggraver les défauts de migration en absence d'activité Notch. Nos données indiquent que la signalisation Notch restreint l'activation de la voie FGF au sein des cellules de parapinéale pour permettre la migration du collectif (Manuscript n°2). La voie Notch est également requise pour la spécification d'un nombre correct de cellules de parapinéale, indépendamment de la voie FGF. En parallèle, nous avons analysé la fonction de MMP2 (Matrix Metalloprotease 2), une protéine exprimée mosaïquement dans la parapinéale et candidate pour moduler la signalisation FGF. Cependant, nous n'avons observé aucun défaut de spécification ou de migration de la parapinéale dans les embryons mutants pour le gène mmp2 -/- (Manuscript n°3). Mon travail de thèse révèle un rôle de la voie Notch pour restreindre l'activation de la signalisation FGF dans quelques cellules de parapinéale, un processus qui est biaisé par la voie Nodal afin d'orienter la migration du collectif vers la gauche. Ces données pourraient permettre de mieux comprendre les interactions entre les voies de signalisation FGF, Notch et Nodal dans d'autres modèles de migration cellulaire collective comme, par exemple, la migration des cellules cancéreuses.During the establishment of left-right asymmetry in the zebrafish brain, a small group of cells, the parapineal, collectively migrates from the dorsal midline of the epithalamus to the left in most wild-type embryos. Parapineal migration requires Fibroblastic Growth Factor 8 (Fgf8), a secreted signal expressed bilaterally in epithalamic tissues surrounding the parapineal. The left bias in the orientation of parapineal migration depends on the activity of Cyclops, a secreted factor of the Nodal/TGFß family that is transiently expressed in the left epithalamus prior to parapineal migration. Therefore, the parapineal provides a powerful new model to understand FGF dependent collective cell migration and to study how other signaling pathways modulate this process. Live imaging of an FGF reporter transgene revealed that the FGF pathway is activated in only few parapineal cells that are usually located at the leading edge of migration. Global expression of a constitutively activated Fgf receptor (CA-FGFR) delays migration in wild-type, while it partially restores both parapineal migration and focal activation of the FGF reporter transgene in fgf8-/- mutant embryos. Importantly, focal activation of FGF signaling in few parapineal cells is sufficient to restore collective migration in fgf8-/- mutants. Finally, Nodal asymmetry contributes to restrict and left-bias the activation of the FGF pathway (Manuscript n°1). Following this work, my thesis project aimed at understanding how the activation of the FGF pathway is restricted to few cells, despite all parapineal cells apparently being competent to activate the pathway. We showed that Notch signaling is able to restrict FGF activity. Loss or gain of function of the Notch pathway respectively triggers an increase or decrease in FGF activity, which correlate with PP migration defects. Moreover, decreasing or increasing FGF activity levels respectively rescues or aggravates parapineal migration defects in Notch loss-of-function context. Our data indicate that Notch signaling restricts the activation of the FGF pathway within parapineal cells to promote their collective migration (Manuscript n°2). We also found that Notch pathway is required for the specification of a correct number of parapineal cells, independently of FGF pathway. In parallel, we analysed the function of MMP2 (Matrix Metalloprotease 2), a protein mosaïcally expressed in the parapineal and a candidate to modulate FGF signaling. However, we found no significant defects in the specification or migration of parapineal cells in mmp2-/- mutant embryos (Manuscript n°3). My PhD work reveals a role for Notch signaling in restricting the activation of FGF signaling within few parapineal cells, a process that is biased by Nodal pathway to the left and required for the migration of the entire parapineal. These data provide insights into the interaction of FGF, Notch and Nodal/TGFb signaling pathways that may be applicable to other models of collective cell migration, such as cancer cells migration for instance
Role of atypical photoreceptors as mediators of the direct and circadian effects of light in a diurnal vertebrate
No full textLa lumière exerce une influence majeure sur la physiologie et le comportement de la plupart des organismes. En particulier, elle synchronise les rythmes circadiens par un processus appelé photoentrainement. Chez les mammifères, le photoentrainement dépend de la rétine, et plus particulièrement d'une classe de cellules ganglionnaires de la rétine (RGCs) exprimant le photopigment mélanopsine (opn4). Ces RGCs sont intrinsèquement sensibles à la lumière bleue et sont appelés ipRGCs pour "intrinsically photosensitives RGCs". Les ipRGCs intègrent l'information lumineuse médiée par la mélanopsine avec celle provenant des photorécepteurs classiques pour contrôler le photoentrainement mais aussi le masking, un effet direct de suppression ou d'élévation de l'activité locomotrice par la lumière. Bien que les ipRGCs soient les médiateurs des effets circadiens et directs de la lumière sur le comportement des mammifères, leurs rôles chez les vertébrés non mammifères ne sont pas élucidés. Grâce à son développement externe rapide, à sa transparence et à sa capacité de manipulation génétique facile et d'analyse comportementale à haut débit, le poisson zèbre (PZ) est apparu comme un puissant modèle de vertébré diurne non mammifère pour la chronobiologie. Contrairement aux mammifères, la rétine n'est pas la seule structure photosensible chez le PZ. En particulier chez cette espèce, la glande pinéale contient des photorécepteurs et des neurones de projection (PNs, équivalent des RGCs) et peut donc recevoir une information lumineuse et la transmettre au cerveau. De plus, tous les organes adultes du PZ testés, y compris la glande pinéale, sont directement photoentraînables lorsqu'ils sont placés en culture. Il reste donc à déterminer quels sont les rôles respectifs de la photodétection périphérique (au niveau de tous les organes) et de la photodétection centrale (au niveau de structures spécialisées telles que la rétine et la glande pinéale) dans le photoentraînement. Nous nous sommes intéressé.e.s aux rôles des gènes de mélanopsine et des cellules les exprimant chez le PZ. Parmi les 5 gènes de mélanopsine présents chez cette espèce, opn4xa et opn4b sont exprimés dans les RGCs larvaires. De plus, nous avons montré qu'opn4xa est exprimé dans une sous-population de PNs. Ainsi, opn4xa définit une nouvelle population de PNs présentant une photosensibilité à la lumière bleue et verte dépendante d'opn4xa et qui fonctionne en mode LIGHT ON (Publications 1,2). Dans un second temps, nous avons cherché à comprendre la fonction des RGCs (opn4xa+ et opn4xa- - mutant lakritz -) et de la photosensibilité intrinsèque des RGCs et PN opn4xa+ (mutant opn4xa) dans l'influence directe et circadienne de la lumière sur l'activité locomotrice chez la larve de PZ. Nous avons trouvé que les RGCs sont impliqués dans le masking et la réponse locomotrice aux transitions lumineuses, mais indépendamment de la photosensibilité pilotée par opn4xa. Enfin, les mutants opn4xa-/-, lakritz-/- et opn4xa -/- ; lakritz -/- n'ont montré aucun défaut de photoentraînement à un pulse de lumière blanche administré au début de la nuit suggérant que la photodétection de la rétine (y compris celle des ipRGCs) et la photodétection pilotée par la mélanopsine opn4xa ne sont pas nécessaires au photoentraînement chez la larve de PZ (Publication 2). Ces résultats soulèvent des différences majeures dans le photoentrainement circadien chez les mammifères et le poisson zèbre.Light has a profound influence on the physiology and behaviour of living organisms. In particular, light synchronize circadian rhythms through a process referred to as photoentrainment. In mammals, photoentrainment depends on the retina, and more particularly on a specific subtype of Retinal Ganglion Cells (RGCs) expressing the photopigment melanopsin (opn4). These RGCs are intrinsically sensitive to blue light and are hence referred to as ipRGCs for "intrinsically photosensitive RGCs". ipRGCs function as a hub which integrate photic information from melanopsin-evoked responses with rod and cone photoreceptor influences to control, among other things, photoentrainment and masking, a direct suppressive or elevating effect of light on locomotor activity. While ipRGCs mediate circadian and direct effects of light on behaviour in mammals, it is unclear if these roles are conserved in non-mammalian species. Due to its fast external development, transparency and capacity for easy genetic manipulation and high-throughput behavioural analysis, the zebrafish has emerged as a powerful non-mammalian diurnal vertebrate model for chronobiology. In contrast to mammals, the retina is not the only photosensitive structure: in particular, the zebrafish pineal gland contains photoreceptors and projection neurons (PNs, equivalent of RGCs) and thus can receive and transmit light information. In addition, all zebrafish adult organs tested, including the pineal gland, are directly photoentrainable when placed in culture. It therefore remains to be determined what are the respective roles of peripheral (at the organ level) versus central photodetection (from specialized structures such as the retina and pineal gland) for photoentrainment. We thus ought to determine the function of melanopsin genes and melanopsin expressing cells in the zebrafish. Among the 5 zebrafish melanopsin genes, opn4xa and opn4b are expressed in larval RGCs. We furthermore showed that opn4xa is expressed in a subpopulation of PNs. Therefore, opn4xa defines a novel population of PN exhibiting an opn4xa-dependant photosensitivity to blue and green light in a LIGHT ON mode (Publications 1,2). With different mutant lines, we then tested the role of RGCs (opn4xa+ and opn4xa- RGCs - lakritz mutant -) and of the intrinsic photosensibility of opn4xa+ RGCs and PN (opn4xa mutant) in the direct and circadian influence of light on locomotor activity in zebrafish larvae. We found RGCs to be involved in masking and the locomotor response to light transitions, but regardless of their opn4xa+ driven photosensibility. Finally, both opn4xa-/-, lakritz-/- and opn4xa-/-; lakritz-/- mutants did not show any defect of photoentrainment to a white pulse of light administered at the beginning of the night (Publication 2). Thus both the photodetection from the retina, (including ipRGCs) and the photodetection driven by the melanopsin opn4xa seem dispensable for circadian photoentrainment in zebrafish larvae. This highlights further differences between the organization of the mammalian and zebrafish circadian system and more particularly on the structure(s) involved in photoentrainment
Détermination de la fonction de Cxc112a pendant la morphogénèse de l'épithélium olfactif chez l'embryon de poisson zèbre à l'aide d'un modèle mathématique
No full textLe bon fonctionnement d'un organe nécessite une régulation fine de la position spatiale et temporelle, du nombre et de l'identité de chaque cellule qui le compose. Bien que l'altération d'un seul paramètre contribue au développement de nombreuses pathologies, la façon dont ces paramètres se coordonnent pour participer à l'homéostasie tissulaire reste mal comprise. Nous utilisons la formation de l'épithélium olfactif (OE) chez l'embryon de poisson zèbre comme paradigme pour comprendre ces mécanismes. A 12 heures après la fécondation (hpf), les cellules de la placode olfactive appelées neurones olfactifs précoces (EONs) subissent un mouvement de convergence le long de l'axe antéro-postérieur (AP) pour se disposer en amas ellipsoïdaux de part et d'autre du cerveau antérieur, le télencéphale, et formeront l'OE à 24 hpf qui sera plus tard capable de détecter les odeurs. Ce processus morphométrique est facilement observable dans l'embryon transparent de poisson zèbre et quantifiable par imagerie microscopique haute résolution en temps réel, mais il reste encore mal caractérisé. Au cours de ce processus, nous savons que la migration des EONs est perturbée en l'absence soit du chimio-attractant cxcl12a, dont l'ARNm est exprimé dans tout le télencéphale, soit de son récepteur cxcr4b, exprimé par les EONs. Dans les embryons mutants pour cxcr4b ou cxcl12a, la trajectoire des EONs antérieurs est perturbée comme la morphogenèse de l'OE. Cependant, le patron d'expression de Cxcl12a dans ce système ainsi que l'activation de cette voie dans les EONs sont encore inconnues, et leur caractérisation a fait l'objet de ma thèse. Pour avoir une vue intégrée de cette signalisation dans la morphogenèse de l'OE, nous avons développé en collaboration un modèle mathématique de ce processus basé sur quatre paramètres initialement définis : l'interaction cellule-cellule, l'interaction cellule-matrice extracellulaire, la chimiotaxie (chem) et la motilité cellulaire. Pour mettre au point les paramètres du modèle mathématique, nous avons utilisé le phénotype des embryons en situation contrôle et en absence du ligand cxcl12a (chem = cxcl12a) en tenant compte de deux marqueurs de la morphogenèse de l'OE : 1) la position des cellules et le changement de forme du tissus (l'ensemble des cellules) d'un arc de cercle autour du télencéphale à deux clusters et 2) la compaction des cellules le long de l'axe AP. Le modèle permet de générer des prédictions sur la formation de l'OE en fonction de la localisation de la source de chimiotaxie dans la matrice (mimant le télencéphale). Par conséquent, au cours de ma thèse, j'ai mis au point une technique innovante d'activation de l'activation de l'expression de Cxcl12a grâce à un promoteur sensible à la chaleur par un opérateur de gêne évoqué par laser infrarouge (IR-LEGO). Ceci m'a permis de moduler l'expression de Cxcl12a in vivo dans le temps et l'espace selon l'axe AP dans le télencéphale pour reproduire les conditions du modèle. Mes résultats indiquent qu'une position postérieure ou centrale de Cxcl12a permet de restaurer la morphogenèse de l'OE, dans le modèle comme dans un mutant cxcl12a. Contrairement à une position antérieure qui phénocopie la morphogenèse en condition mutante pour cxcl12a. Pour clarifier ceci, j'ai utilisé des outils génétiques, l'imagerie in vivo, l'analyse et la quantification d'images pour découvrir la dynamique d'activation de Cxcr4b/Cxcl12a pendant la formation de l'OE. Nous avons découvert que la dynamique d'activation de Cxcr4b dans les OE en réponse à Cxcl12a est hétérochronique et mosaïque. En conclusion, le va-et-vient entre la biologie expérimentale, l'analyse d'images et un modèle, nous a permis de suggérer l'existence de différents niveaux d'activation du récepteur Cxcr4b par son ligand Cxcl12a lors de la morphogenèse d'un tissu. Et de générer des hypothèses sur la modulation de cette voie de chimiotaxie (forme du gradient) via d'autres interacteurs pour donner sa forme à un organe.The proper functioning of an organ requires fine regulation of the spatial and temporal position, number and identity of each cell that composes it. Although the alteration of a single parameter contributes to the development of many pathologies, the way these parameters coordinate to participate in tissue homeostasis remains poorly understood. We use the formation of the olfactory epithelium (OE) in the zebrafish embryo as a paradigm to understand these mechanisms. At 12 hours post-fertilization (hpf), cells of the olfactory placode called early olfactory neurons (EONs) undergo a convergence movement along the anterior-posterior (AP) axis to arrange themselves in ellipsoidal clusters on either side of the forebrain, the telencephalon, and will form the OE at 24 hpf that will later be capable of detecting odors. This morphometric process is easily observable in the transparent zebrafish embryo and quantifiable by high-resolution microscopic imaging in real time, but remains poorly characterized. During this process, we know that EONs migration is disrupted in the absence of either the chemoattractant cxcl12a, whose mRNA is expressed throughout the telencephalon, or its receptor cxcr4b, expressed by EONs. In embryos mutant for cxcr4b or cxcl12a, the trajectory of anterior EONs is disrupted as is OE morphogenesis. However, the expression pattern of cxcl12a in this system as well as the activation of this pathway in EONs are still unknown, and their characterization was the subject of my thesis. To have an integrated view of this signalling in OE morphogenesis, we collaboratively developed a mathematical model of this process based on four initially defined parameters: cell-cell interaction, cell-extracellular matrix interaction, chemotaxis (chem) and cell motility. To develop the parameters of the mathematical model, we used the phenotype of embryos in control and in the absence of the ligand cxcl12a (chem = cxcl12a) taking into account two markers of OE morphogenesis: 1) the position of the cells and the change in shape of the tissue (the set of cells) from a horseshoe around the telencephalon to two clusters and 2) the compaction of cells along the AP axis. The model is able to generate predictions about OE formation based on the location of the chemotaxis source in the matrix (mimicking the telencephalon). Therefore, during my thesis, I developed a novel technique to activate cxcl12a expression using a heat-sensitive promoter by an infrared laser evoked gene operator (IR-LEGO). This allowed me to modulate cxcl12a expression in vivo in time and space along the AP axis in the telencephalon to mimic model conditions. My results indicate that a posterior or central position of Cxcl12a restores OE morphogenesis, both in the model and in a cxcl12a mutant. In contrast to an anterior position which phenocopies morphogenesis in the cxcl12a mutant condition. To clarify this, I used genetic tools, in vivo imaging, image analysis and quantification to uncover the activation dynamics of Cxcr4b/Cxcl12a during OE formation. We found that the activation dynamics of Cxcr4b in OE in response to Cxcl12a is heterochronic and mosaic. In conclusion, the back and forth between experimental biology, image analysis and a model, allowed us to suggest the existence of different levels of activation of the Cxcr4b receptor by its Cxcl12a ligand during the morphogenesis of a tissue. And to generate hypotheses on the modulation of this chemotaxis pathway via other interactors to give an organ its shape
Evolution of the mechanisms of habenular asymmetry formation in gnathostomes : the catshark, Scyliorhinus canicula as reference
No full textLes habénulas sont des structures épithalamiques bilatérales, retrouvées chez tous les vertébrés. Une de leurs particularités est qu'elles présentent des asymétries marquées entre la droite et la gauche chez un grand nombre d'espèces, ce qui en fait un modèle de référence pour l'étude des asymétries du système nerveux central des vertébrés. Jusqu'ici, la nature des asymétries habénulaires et les mécanismes responsables de leur formation ont été étudiés principalement chez le poisson-zèbre. Mon projet de thèse a visé à caractériser ces asymétries ainsi que leurs mécanismes de formation chez un chondrichtyen, la petite roussette Scyliorhinus canicula, puis à utiliser ces données comme référence pour préciser leur évolution chez les gnathostomes. La stratégie expérimentale a reposé sur trois approches complémentaires, (1) une caractérisation moléculaire des habénulas de roussette au cours de leur développement par étude de gènes candidats, (2) une analyse transcriptomique des asymétries, complétée par des études d'expression in situ, et (3) des analyses expérimentales des mécanismes impliqués dans leur formation. J'ai ensuite utilisé ces données pour une étude comparée, à la fois expérimentale et bibliographique, des asymétries habénulaires chez un spectre large de gnathostomes, comprenant les modèles génétiques traditionnels, souris et poisson-zèbre, mais également des espèces non conventionnelles choisies pour leur position phylogénétique, le xénope, X. tropicalis, deux actinoptérygiens, Erpetoichthys calabaricus et Lepisosteus oculatus, et un holocéphale Callorhinchus milii. Ce travail met en évidence des asymétries neurogénétiques très marquées dans les habénulas embryonnaires de roussette, ainsi qu'une organisation en sous-domaines fortement asymétrique de l'organe différencié. L'analyse des mécanismes impliqués met en évidence une régulation temporelle asymétrique de la neurogenèse et des choix de différenciation neuronale, impliquant les voies Nodal et Wnt canonique. La comparaison de ces données à l'échelle des gnathostomes permet de préciser le mode d'évolution des asymétries habénulaires, et suggère des pertes indépendantes chez les actinoptérygiens et les sarcoptérygiens. Ces diversifications pourraient être liées à une implication conservée de la voie Wnt dans l'élaboration des identités neuronales dans l'épithalamus et des variations de la régulation de cette activité dans le temps et l'espace.Habenulae are bilateral epithalamic structures found in all vertebrates. One of their specificities is that they exhibit marked asymmetries along the left/right axis in many species, which makes them a reference model for the study of asymmetries in the vertebrate central nervous system. So far, the nature of habenular asymmetries and the mechanisms responsible for their formation have been primarily investigated in the zebrafish. My thesis project aimed at a characterisation of these asymmetries and their formation mechanisms in a chondrichthyan, the catshark Scyliorhinus canicula, and the exploitation of these data as a reference to gain insight into their mode of evolution in gnathostomes. The experimental strategy relied on three complementary approaches, (1) a molecular description of developing catshark habenulae by a candidate gene analysis, (2) a transcriptomic characterisation of asymmetries, complemented by in situ expression studies, and (3) experimental analyses of the mechanisms involved in their formation. I then used these data for a comparative study, both experimental and bibliographic, of habenular asymmetries in a broad range of gnathostomes, including traditional genetic models, such as the mouse, and zebrafish, as well as unconventional species chosen for their phylogenetic position, the xenopus, Xenopus tropicalis, two actinopterygians, Erpetoichthys calabaricus and Lepisosteus oculatus, and a holocephalan, Callorhinchus milii. This work highlights the presence of marked neurogenetic asymmetries in the catshark embryonic habenulae, as well as a highly asymmetrical subdomain organisation of the differentiated organ. Analysis of underlying mechanisms reveals an asymmetric temporal regulation of neurogenesis and of neuronal differentiation choices, involving Nodal and canonical Wnt pathways. Comparisons across gnathostomes provide new insights into the mode of evolution of habenular asymmetries, suggesting independent losses in actinopterygians and sarcopterygians. These diversifications could be related to a conserved involvement of Wnt pathway in the elaboration of neuronal identities in the epithalamus, and to variations in the regulation of this activity in time and space
Identification and characterization of candidate genes to gain new mechanistic insight into Diamond-Blackfan Anemia pathophysiology
No full textDes mutations dans les gènes codant les protéines impliquées dans la biogenèse des ribosomes provoquent des maladies spécifiques chez l'homme, les ribosomopathies. L'une d'entre elles, l'Anémie de Blackfan-Diamond (ABD) se caractérise par une perte importante de cellules érythroïdes dans la moelle osseuse qui entraîne une anémie sévère et dans certains cas d'autres anomalies comme des malformations cranio-faciales. Bien que les mutations soient connues pour une vingtaine de gènes représentant environ 3/4 des patients atteints d'ABD, l'identification des gènes mutés dans les cas restants présente un enjeu majeur afin d'améliorer le diagnostic de la maladie et de découvrir de nouvelles cibles thérapeutiques. Le but de ma thèse a été de générer des modèles d'ABD chez le poisson-zèbre en utilisant la technique d'édition du génome CRISPR/Cas9 sur la base de nouveaux gènes candidats récemment identifiés par séquençage d'exomes chez les patients ABD Français. Mes résultats montrent que seuls les embryons homozygotes mutants pour l'un des gènes développent des phénotypes en lien avec l'ABD: une anémie sévère associée à des défauts généraux de développement comme un retard de croissance, une microcéphalie et l'absence de mâchoire. Quant aux deux autres gènes, bien que les embryons homozygotes mutants présentent des phénotypes développementaux, les résultats n'ont pas mis en évidence de défauts en lien avec la pathologie. Les mécanismes moléculaires à l'origine des symptômes observés chez les patients restent néanmoins à être caractérisés. La littérature et mes résultats montrent que les modèles intégrés actuels de l'ABD, ne reproduisent pas fidèlement la situation observée chez les patients. En effet, chez le poisson-zèbre les mutants dans les gènes ABD développent des phénotypes qui ne se limitent pas aux tissus affectés dans la pathologie humaine. Cela peut s'expliquer par le fait que chez l'homme les gènes responsables de l'ABD sont haploinsuffisants, alors que chez le poisson-zèbre, ils ont un comportement Mendélien récessif. Ainsi, parallèlement à mon travail de validation de nouveaux gènes de l'ABD, j'ai développé un système intégré vertébré modélisant l'ABD sur la base d'un gène causal préalablement identifié: TSR2 (20S rRNA maturation factor). Ce gène est localisé sur le chromosome X et la mutation faux-sens identifiée chez les patients se comporte comme un allèle récessif puisque seulement des patients garçons sont affectés. Cette particularité fait de ce gène un candidat idéal pour générer un modèle animal reflétant au mieux la génétique des patients ABD. J'ai généré une lignée mutante chez le poisson-zèbre, pour laquelle les embryons homozygotes mutants développent spécifiquement des défauts observés chez les patients: une anémie tardive ainsi que des défauts de mise en place des os de la mâchoire. [...]Mutations in genes encoding proteins involved in ribosome biogenesis cause specific diseases in humans, called ribosomopathies. One of these, Diamond-Blackfan Anaemia (DBA), is characterized by a significant loss of erythroid cells in the bone marrow leading to severe anaemia and in some cases other abnormalities such as cranio-facial malformations. Until now, mutations are known for about 20 genes representing about 3/4 of patients with DBA, identifying the mutated genes in the remaining cases presents a major challenge in order to improve the diagnosis of the disease and discover new therapeutic targets. The aim of my thesis was to generate DBA models in zebrafish using the CRISPR/Cas9 genome editing technique on the basis of new candidate genes recently identified by exome sequencing in French DBA patients. My results show that homozygous embryos mutant for only one of these genes develop phenotypes that begin to resemble DBA, including severe anaemia associated with general developmental defects including growth retardation, microcephaly and lack of jaw; for the other two genes homozygous mutant embryos show developmental phenotypes unrelated to the pathology. The molecular mechanisms at the origin of the symptoms observed in the patients remain to be completely understood. The literature and my results show that the current integrated models of DBA do not satifyingly reproduce the physiopathology of patients. Indeed, in zebrafish, mutants in the DBA genes develop phenotypes that are not limited to the tissues affected in human pathology. This can be explained by the fact that in humans the genes responsible for DBA are haploinsufficient, whereas in zebrafish they have a recessive Mendelian behaviour. Thus, in parallel with my work to validate new DBA genes, I have established an integrated vertebrate model based on a previously identified causal gene: TSR2 (20S rRNA maturation factor). This gene is localized on the X chromosome and the missense mutation identified in patients behaves as a recessive allele since only male patients are affected. This particularity allows this gene to be an ideal candidate to generate an animal model that best reflects the genetics of DBA patients. I generated a tsr2 mutant in which the homozygous mutant embryos develop defects observed in patients: late anaemia and jaw bone placement defects. We also observed that, as described in DBA patients, adult heterozygous fish mutant for tsr2 are predisposed to developing cancers. This model could not only be used to understand how the dysfunction of a ubiquitous process such as ribosome biogenesis leads to specific defects, but also to explain the paradox of the transition from a hypo-proliferative state with phenotypes of bone marrow failure and anaemia, to a hyper-proliferative state leading to high cancer risks later in life. In the future, this model may improve the diagnosis of patients and lead to the emergence of new therapeutic targets by offering the possibility of performing pharmacological screening for the development of new treatments
Deciphering olfactory epithelium development : from cell type diversity to morphogenesis
No full textLa formation d'un organe repose sur la coordination spatio-temporelle du positionnement et de la différenciation de progéniteurs. La finalité de ces évènements permet la constitution structurelle de l'organe et la production de la diversité cellulaire nécessaire pour assurer ses fonctions. L'épithélium olfactif de l'embryon de poisson-zèbre est issu de la migration de progéniteurs qui vont générer entre autres les neurones olfactifs. Au cours de ma thèse je me suis intéressé aux bases génétiques et moléculaires de la coordination de la morphogenèse et de la neurogenèse de cet épithélium tout en étudiant l'origine de la diversité des types cellulaires olfactifs. L'imagerie en temps réel m'a permis de caractériser la migration de ces progéniteurs en générant une carte morphométrique de leur déplacement. Mon travail de thèse révèle que le proneural Neurog1 régule directement l'expression de cxcr4b, un récepteur au chimiokine, dans les progéniteurs olfactifs assurant leur positionnement. Ainsi, Neurog1 coordonnerait la position et l'identité des progéniteurs olfactifs via ses cibles transcriptionnelles. Au sein de l'épithélium olfactif dans l'embryon, deux populations cellulaires (neurones à GnRH et neurones à microvillosités) ont été décrites comme provenant des crêtes neurales céphaliques (CNC). J'ai pu montrer que l'expression de marqueurs spécifiques de ces populations n'est pas affectée dans un contexte d'absence de différenciation des CNCs (sox10-/-) suggérant que ces types cellulaires ne dérivent pas de ce territoire. Afin d'identifier leur territoire d'origine, j'ai développé une méthode d'imagerie en temps réel, le backtracking, qui m'a permis de déterminer que la région de la placode olfactive, et non les crêtes neurales, génère ces deux types cellulaires. Ainsi j'ai pu définir la source de ces deux populations neuronales tout en minimisant la contribution des crêtes neurales. En conclusion mes résultats suggèrent que la diversité des neurones olfactifs serait produite localement et ceci conjointement à la morphogenèse de l'épithélium.The correct development of sensory organs relies on the coordination between changes in progenitor positioning over time and the differentiation/specification of different neural subtypes. The outcome of this coordination is proper organ shape and cell diversity, which are required for functionality. The zebrafish embryonic olfactory epithelium arises from progenitor migration and differentiation. During my PhD, I studied the genetic and molecular basis of morphogenesis in this tissue, and how this is coordinated with neurogenesis, as well as revisiting the origin of olfactory cell type diversity.First, I generated a morphometric map of olfactory progenitors through the characterization of their migration in live embryos. Next, I showed that the proneural transcription factor Neurog1 directly regulates cxcr4b expression, a chemokine receptor that has already been shown to govern olfactory progenitor positioning. Thus, Neurog1 orchestrates olfactory progenitor position and the generation of olfactory neurons via distinct transcriptional targets. Secondly, I addressed the origin of olfactory neuron diversity. Within the embryonic olfactory epithelium, two cell populations (GnRH neurons and microvillous neurons) have been described as cephalic neural crest (CNC) derivatives. I found, however, that the expression of specific markers of both populations is unaffected in a genetic context blocking CNC differentiation. To revisit the lineage assignment of these cell types, I developed a backtracking approach through time-lapse live imaging. I found that both populations are derived from classical olfactory placode progenitor and not the CNC. In conclusion, my results indicate that heterogeneity of olfactory cell-types is locally generated, and concomitant with morphogenesis of the placode
Nonsense-mediated decay machinery in Plasmodium falciparum is inefficient and non-essential
No full textNonsense-mediated decay (NMD) is a conserved mRNA quality control process that eliminates transcripts bearing a premature termination codon. In addition to its role in removing erroneous transcripts, NMD is involved in post-transcriptional regulation of gene expression via programmed intron retention in metazoans. The apicomplexan parasite Plasmodium falciparum shows relatively high levels of intron retention, but it is unclear whether these variant transcripts are functional targets of NMD. In this study, we use CRISPR-Cas9 to disrupt and epitope-tag the P. falciparum orthologs of two core NMD components: PfUPF1 (PF3D7_1005500) and PfUPF2 (PF3D7_0925800). We localize both PfUPF1 and PfUPF2 to puncta within the parasite cytoplasm and show that these proteins interact with each other and other mRNA-binding proteins. Using RNA-seq, we find that although these core NMD orthologs are expressed and interact in P. falciparum, they are not required for degradation of nonsense transcripts. Furthermore, our work suggests that the majority of intron retention in P. falciparum has no functional role and that NMD is not required for parasite growth ex vivo. IMPORTANCE In many organisms, the process of destroying nonsense transcripts is dependent on a small set of highly conserved proteins. We show that in the malaria parasite, these proteins do not impact the abundance of nonsense transcripts. Furthermore, we demonstrate efficient CRISPR-Cas9 editing of the malaria parasite using commercial Cas9 nuclease and synthetic guide RNA, streamlining genomic modifications in this genetically intractable organism
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