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Role of endocannabinoids in regulating drug dependence
No full textDaniela Parolaro, Daniela Vigano’, Natalia Realini, Tiziana RubinoNeuroscience Center, DBSF, University of Insubria, Busto Arsizio, ItalyAbstract: This review will discuss the latest knowledge of how the endocannabinoid system might be involved in treating addiction to the most common illicit drugs. Experimental models are providing increasing evidence for the pharmacological management of endocannabinoid signaling not only to block the direct reinforcing effects of cannabis, opioids, nicotine and ethanol, but also for preventing relapse to the various drugs of abuse, including opioids, cocaine, nicotine, alcohol and metamphetamine. Preclinical and clinical studies suggest that the endocannabinoid system can be manipulated by the CB1 receptor antagonist SR141716A, that might constitute a new generation of compounds for treating addiction across different classes of abused drugs.Keywords: Endocannabinoids, drug dependence, opioids, nicotine, alcohol, psychostimulant
Effetti comportamentali, biochimici e molecolari indotti dalla somministrazione acuta e cronica di cannabinoidi endogeni ed esogeni nel ratto
No full textLa ricerca si propone di approfondire sia il ruolo svolto dal recettore CB1 nei diversi effetti centrali della cannabis, (mediante la strategia degli antisenso, l'aspetto comportamentale e molecolare quale il recettore, sistema di trasduzione e secondi messaggeri) sia si caratterizzare la sindrome astinenziale scatenata in animali tolleranti ai cannabinoidi endogeni ed esogeni utilizzando anche in questo caso sia l'analisi comportamentale che quella cellulare molecolar
Ruolo emergente del sistema degli endocannabinoidi nelle malattie neuropsichiatriche
No full textIl sistema degli endocannabinoidi (ECS) è un sistema neuromodulatorio di recente scoperta costituito da recettori (CB1, CB2), dai loro ligandi endogeni
(endocannabinoidi (eCB), i principali anandamide, AEA, e 2-arachidonoilglicerolo, 2-AG) e dalle proteine che ne regolano la sintesi, il trasporto e la degradazione.
Tra le linee di ricerca più promettenti alcune suggeriscono che l'ECS sia coinvolto nella eziopatogenesi di disordini neuropsichiatrici ancora privi di una terapia
efficace, quali la malattia di Alzheimer (AD), la sclerosi multipla (MS), la schizofrenia, i deficit cognitivi associati a fobie e al disturbo post-traumatico da stress
(PTSD), la depressione ed i disturbi dell'alimentazione. Rilevante in questo contesto è la recente dimostrazione che gli acidi grassi assunti con la dieta, in particolare
gli acidi grassi polinsaturi (PUFA), sono in grado di modulare le concentrazioni degli eCB nel sistema nervoso centrale (Banni e Di Marzo, 2010), suggerendo la
presenza di un interessante interazione tra specifici regimi alimentari e la funzionalità dell'ECS.
In accordo, Brown et al. (2010) hanno dimostrato che un derivato dall'acido docosaesanoico (DHA), un n-3 PUFA, la docosaesaenoil etanolamina (DHEA) lega ed
attiva i recettori CB1 e CB2 , individuando così una classe di “nuovi” eCB derivati dagli n-3 PUFA. Una carenza di n-3 PUFA nella dieta può provocare
disfunzioni nell'ECS, come un aumento dei livelli di 2-AG nel cervello di topo (Watanabe et al, 2003) e ad una desensitizzazione del recettore CB1 nella corteccia
prefrontale di ratto (Lafourcade et al, 2011). Si apre quindi l'ipotesi dell'esistenza di un nuovo triangolo in cui l'alimentazione, l'ECS ed alcuni disordini del CNS
sono collegati tra loro e l'equilibrio tra i vertici sembra essere fondamentale per il mantenimento del benessere e dell'omeostasi del cervello.
Il primo scopo del presente progetto sarà quello di delineare un quadro dettagliato delle disfunzioni dell'ECS coinvolte nello sviluppo delle sopracitate patologie. Per
ciascuna patologia verranno utilizzati modelli animali atti ad indurre il fenotipo comportamentale patologico e in specifiche aree cerebrali correlabili con il fenotipo
considerato, si valuterà la presenza di alterazioni dell'ECS, comprese alterazioni a carico dei nuovi eCB. In caso di riscontro positivo, verrà testata l'efficacia di
farmaci attivi sul ECS (agonisti, antagonisti, agonisti inversi , inibitori del metabolismo degli eCB) nel normalizzare sia l'aspetto comportamentale che l'alterazione
ad essa associata.
Per l'AD e la MS un importante valore aggiunto sarà la possibilità di verificare nel plasma e/o nel liquido cerebrospinale di pazienti, la presenza di correlazione tra
alterazioni a carico dell'ECS (in termini di attività enzimatica e/o espressione genica di specifici componenti), ed il rischio di sviluppare la patologia, la disabilità ad
essa correlata e il sottotipo clinico. Nuovi marcatori biologici all'interno dell'ECS utilizzabili come strumenti diagnostici potrebbero venir individuati.
Il secondo obiettivo sarà quello di esplorare se specifici regimi alimentari in grado di alterare l'ECS sono di per sè possibili fattori di rischio per lo sviluppo delle
patologie o, in alternativa, possono essere utilizzati come intervento preventivo. Negli animali verrà valutato l'effetto di diete carenti o arricchite in n-3 PUFA in
paragone con una dieta isocalorica bilanciata in n-3/n-6 PUFA. Se non diversamente specificato, le diverse diete verranno somministrate alle madri durante la gestazione e l'allattamento e, dopo lo svezzamento, la progenie verrà nutrita con lo stesso regime dietetico della madre per mantenere lo stesso regime nutrizionale.
Verrà indagata la capacità dei diversi regimi alimentari di indurre alterazioni comportamentali patologiche e variazioni di specifici componenti dell'ECS ad esse
correlabili. Il quadro così ottenuto permetterà di chiarire se appropriati regimi dietetici sono utili per prevenire l'insorgenza delle patologie esaminate o alleviarne i
sintomi.
In sintesi i due principali obbiettivi di questo progetto sono:
a) chiarire il ruolo dell'ECS nello sviluppo di alcune delle più rilevanti patologie del CNS, stabilendo una correlazione tra alterazioni a carico di specifici componenti
dell'ECS ed insorgenza delle stesse ;identificare nell'ECS possibili marcatori biologici utilizzabili per la diagnosi; proporre la modulazione farmacologica dell'ECS
come nuovo target terapeutico.
b) chiarire la rilevanza di un corretto contenuto di n-3 PUFA nella dieta per la prevenzione di patologie ed il mantenimento della corretta funzionalità dell'ECS.
Abbracciando il programma Horizon 2020, in cui la salute rappresenta uno degli obiettivi principali, questo progetto fornirà nuovi target terapeutici per la cura di
patologie neuropsichiatriche e metterà in luce l'importanza di un corretto regime alimentare per il benessere e la prevenzione
Stdio della funzionalità e della trasduzione del segnale del recettore cannabico CB1 in diversi modelli sperimentali di schizofrenia
No full textSulla base degli interessanti ma ancora confusi risultati presenti in letteratura riguardo la relazione tra il sistema cannabico e la
schizofrenia, scopo del presente studio è quello di investigare il ruolo del recettore cannabico centrale CB1 e della trasduzione del
segnale ad esso associata in differenti modelli sperimentali di schizofrenia. In particolare si utilizzeranno il modello di "isolamento
sociale" post-svezzamento nel ratto, modello che analizza le conseguenze a lungo termine dello stress sullo sviluppo cerebrale e sulle
risposte comportamentali nel ratto adulto, ed un modello farmacologico basato su iniezioni acute e/o ripetute di un antagonista non
competitivo del recettore NMDA, quale la fenciclidina (PCP). Infine dettagliati studi strutturali e ultrastrutturali hanno rilevato che
i cervelli provenienti da pazienti schizofrenici mostrano anomalie nello sviluppo neuronale che potrebbero almeno in parte essere
spiegate da alterazioni dei fattori neurotrofici sia a livello proteico che genico. Pertanto, poiché l'attivazione del recettore CB1
potrebbe modulare la sintesi delle neurotrofine attraverso la cascata dell'AMP ciclico e/o quella di ERK, sarà interessante
verificare se nel sistema nervoso centrale di ratti isolati compaiano alterazioni nella famiglia NGF (come NGF e BDNF) che
potrebbero essere correlate con comportamenti di tipo schizofrenico. Allo stesso modo, l'autosomministrazione di cannabinoidi
potrebbe produrre cambiamenti in questi fattori che potrebbero rendere i ratti più vulnerabili alla schizofrenia
Neurobiologia dei composti cannabici: aspetti comportamentali e cellulari
No full textSebbene esistano precise caratterizzazioni strutturali e molecolari dei recettori cannabici presenti nel sistema nervoso centrale e la scoperta dei ligandi endogeni per tali recettori (anandamidi) faccia supporre l’esistenza di un nuovo sistema neurochimico, la definizione della sua funzione e delle sue relazioni con altri sistemi, nonchè gli eventi cellulari ed intracellulari legati alla sua attivazione cronica sono ancora da definire chiaramente.
La presente ricerca si propone di approfondire mediante test comportamentali il ruolo del sistema cannabico nei complessi circuiti neuronali che stanno alla base dei comportamenti motivazionali siano essi di gratificazione e/o di aversione; di estendere ulteriormente l’analisi dei meccanismi cellulari che stanno alla base della tolleranza e dipendenza ai cannabinoidi e, da ultimo, di esaminare sia a livello comportamentale che cellulare l’esistenza di una interazione tra i cannabinoidi e gli oppioidi, con particolare attenzione ai trattamenti cronici.
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Alterazioni cellulari indotte da farmaci d'abuso e da stimoli avversivi non evitabili nel sistema nervoso centrale di ratto
No full textIl lavoro dell’unità operativa sarà orientato a caratterizzare le alterazioni di parametri cellulari e molecolari indotte dall’esposizione a farmaci d’abuso e a stimoli avversivi non evitabili. Più specificatamente, le modificazioni indotte dalle droghe verranno valutate in modelli di sensitizzazione a due tra i più diffusi farmaci d’abuso, quali la morfina ed il delta-9-tetraidrocannabinolo, mentre per quanto concerne le alterazioni indotte da gli stimoli avversivi non evitabili ci avvarremo dei modelli comportamentali messi a punto dalle altre unità partecipanti alla ricerca (Prof. Tagliamonte). Infine, per convalidare il possibile coinvolgimento di specifiche cascate intracellulari nei sopracitati processi ci avvarremo di topi geneticamente mutati che sotto- o sovra-esprimono la proteina di interesse.
A tale scopo verranno allestiti i seguenti saggi:
1. binding in autoradiografia per i recettori cannabici e i diversi sottotipi di recettori oppiacei eventualmente seguiti da saggi condotti su membrane delle aree cerebrali trovate positive, per meglio specificare i valori di Kd e Bmax;
2. binding in autoradiografia del [35S]GTPgammaS per valutare l’efficienza di accoppiamento recettore/G proteine, eventualmente seguiti da saggi condotti su membrane delle aree cerebrali trovate positive, per specificare i parametri meccanicistici di tale interazione in termini di Kd, Bmax, EC50 e Emax;
3. valutazione in specifiche aree cerebrali delle variazioni a carico della cascata del cAMP in termini di livelli di cAMP, attività della PKA e induzione dei fattori di trascrizione cAMP correlati (CRE);
4. valutazione in specifiche aree cerebrali della cascata delle MAP Kinasi in termini sia di livelli che di attività, prendendo in considerazione sia ERK1, che ERK2, p38 e JNK. In parallelo, verrà anche studiata l’attivazione dei più comuni fattori di trascrizione ad essi correlati;
5. studio della risposta comportamentale basale, di quella indotta dall’esposizione alle droghe, nonchè dell’apprendimento dell’avversione condizionata al gusto in animali knock out o iperesprimenti Ras-GRF1, fattore attivante di Ras in maniera tirosinkinasi-indipendente e cruciale per la trasduzione mediata da ERK.
Testo ingles
Alterazioni cellulari e molecolari presenti nel sistema nervoso centrale durante i processi di sensitizzazione a lungo termine indotti da diversi farmaci d'abuso
No full textil lavoro dell'unità operativa sarà orientato ad indagare le modifiche cellulari e molecolari presenti nel sistema nervoso centrale di ratti sensitizzati alla morfina , alla cocaina, all'anfetamina e ai cannabinoidi, nel tentativo di individuare somiglianze e differenze con quelle presenti durante la tolleranza e l'astinenza. Più specificatamente, utilizzando l'esperienza che il gruppo ha accumulato negli anni, cercheremo di caratterizzare la cascata intracellulare che potrebbe culminare in una modifica dell'espressione genica importante per il fenomeno della sensitizzazione. Quando possibile gli studi verranno condotti utilizzando metodiche autoradiografiche nel tentativo di meglio correlare le modifiche cellulari con il ruolo anatomo-fuzionale dell'area cerebrale in cui esse si verificano. La nostra attenzione si focalizzerà sui seguenti punti:
1)valutazione della presenza di alterazioni a carico del recettore della droga sensitizzante (in particolare per gli oppiacei e i cannabinoidi) sia in termini di densità che di affinità .
2)valutazione delle alterazioni nell'efficienza del sistema di trasduzione accoppiato al recettore mediante la tcenica del binding del 35S-GTP-gamma-S condotto sia in autoradiografia che su preparati di membrane cerebrali.
3)valutazione delle alterazione a carico delle G proteine e della loro espressione
4)valutazione delle alterazioni a carico dei secondi messaggeri con particolare riguardo al sistema dell'AMP ciclico, all'attività della PKA e delle MAP kinasi.
5)valutazione delle alterazioni a carico dei principali fattori di trascrizione e delle relative proteine.
6)valutazione del ruolo delle neurotrofine (BDNF e Neurotrofina-3) nel fenomeno della sensitizzazione sia mediante somministrazione esogena delle stesse che mediante valutazione delle alterazione a carico dei loro messaggeri e/o dei messaggeri dei loro recettori (trkB e trkC).
Per lo svolgimento dei punti sopraindicati, il gruppo si avvarrà di un ampio spettro di tecniche molecolari che vanno dal binding in autoradiografia alla ibridazione in situ, alla northern blot, western blot,ec
Interazione tra cannabinoidi ed oppioidi nel sistema nervoso centrale di ratto: correlati neurochimici ed elettrofisiologici
No full textI meccanismi della modulazione crociata tra cannabinoidi ed oppioidi, che rappresentano il punto centrale di questo progetto, rivestono una particolare rilevanza sociale e medica se associati alle interazioni comportamentali esistenti tra i due cammini neurochimici, che possono essere studiate solo in modelli integrati di neurofarmacologia, cioè nell’animale dopo esposizione in vivo ad entrambe le droghe. Mentre queste risposte comportamentali crociate sono già oggetto di estesi studi, rimane ancora da chiarire il fine meccanismo cellulare e molecolare di questo cross-talk. La domanda a cui si vorrebbe dare risposta è infatti la seguente: i due recettori maggiormente implicati (cioè i recettori mu per gli oppiacei ed i recettori CB1 per i cannabinoidi) danno origine ad una modulazione reciproca solo sfruttando punti convergenti dei loro cammini neuronali o sono in grado di modulare lo stato di attivazione l’uno dell’altro a livello di meccanismi di trasduzione, modifiche posttraduzionali e/o regolazione di espressione?
La nostra unità si propone di rispondere a questo interrogativo utilizzando approcci sperimentali neurochimici ed ellettrofisiologici.
Per quanto concerne il primo punto, utilizzando modelli sperimentali presenti in letteratura per indurre lo stato di “addiction” ai cannabinoidi e agli oppioidi, verrano sviluppate le seguenti indagini:
1) valutazione in differenti aree cerebrali di animali esposti cronicamente a cannabinoidi od oppioidi delle reciproche modificazioni recettoriali, in termini di espressione, densità ed affinità dei recettori. A tale scopo verranno allestiti saggi di binding recettoriale sia autoradiografici che su membrane cerebrali.
2) valutazione delle reciproche alterazioni nell’efficienza dell’accoppiamento recettore/G proteine mediante il saggio del legame del GTPgammaS condotto sia in autoradiografia che su membrane.
3) valutazione della responsività ai cannabinoidi o agli oppioidi dei più noti cammini intracellulari associati all’attivazione dei rispettivi recettori, con particolare riguardo alla cascata del cAMP e delle MAP kinasi, in aree cerebrali di animali trattati rispettivamente con gli oppioidi ed i cannabinoidi
Ruolo della via Ras-ERK nella dipendenza ai cannabinoidi
No full textin un recente lavoro Valjent e collaboratori (Valjent E. et al. 2001 Eur. J. Neurosci. 14, 342-352) hanno dimostrato che la somministrazione di THC nel topo induce una transiente attivazione di ERK localizzata nello striato dorsale e nel nucleo accumbens. Tale effetto è strettamente dipendente dall’attivazione del recettore CB1 come evidenziato dalla sua sensibilità all’antagonista selettivo SR141716A. Inoltre il THC induce la fosforilazione del fattore di trascrizione Elk-1, il quale rappresenta il maggior target nucleare di ERK e tale effetto risulta bloccato dalla somministrazione in vivo del composto SL327, un inibitore specifico delle MAPK/ERK kinasi. Queste prime evidenze sperimentali suggeriscono un ruolo importante per la via di MAP/ERK kinasi nella mediazione degli effetti dei cannabinoidi, ma nulla al momento è conosciuto sul ruolo di tale cammino nei processi di esposizione a lungo termine alla droga.
Scopo principale del progetto della presente unità operativa è quello di indagare il ruolo della via Ras-ERK kinasi nei fenomeni di tolleranza, dipendenza fisica e sensitizzazione ai cannabinoidi.
La possibilità di eseguire studi su topi geneticamente modificati nella loro capacità di attivare la via ras-ERK fornitici dall’unità coordinata dalla Prof.ssa Zippel, rappresenta un valido strumento per definire l’importanza di tale cammino intracellulare. In particolare ci avvarremo di topi knock out per il gene ras-GRF1 che codifica per lo scambiatore deputato all’attivazione delle proteine ras che a loro volta rappresentano l’interruttore molecolare che porta all’attivazione sequenziale dei membri appartenenti alla cascata della via MAP/ERK kinasi. Tale scambiatore è specificatamente attivato dai recettori accoppiati a G proteine a cui il recettore cannabico CB1 appartiene.
Più dettagliatamente, il lavoro della presente unità operativa sarà così sviluppato:
1) analisi dell’effetto della somministrazione di dosi crescenti di THC e/o di CP-55,940 per via sottocutanea in topi ras-GRF1 knock out e wild type mediante valutazione di due classici effetti cannabici, quali l’analgesia e la riduzione dell’attività locomotoria, testati rispettivamente mediante il test del tail flick e l’uso di una gabbia di attività locomotoria.
2) Studio della cinetica dello sviluppo della tolleranza agli effetti analgesici e di riduzione dell’attività locomotoria dopo somministrazione ripetuta di THC e/o CP-55,940 in topi wild type e knock out.
3) valutazione della sindrome astinenziale precipitata mediante somministrazione dell’antagonista del recettore cannabico centrale CB1 SR141716 in topi knock out e wild type trattati cronicamente con THC e/o CP-55,940. A tale scopo verrà utilizzato un protocollo di analisi comportamentale precedentemente messo a punto per la sindrome astinenziale da cannabinoidi (Aceto et al. J. Pharmacol. Exp. Ther. 278, 1290-1295, 1996).
4) valutazione della presenza del fenomeno della sensitizzazione comportamentale al THC e/o al CP-55,940 in topi knock out e wild type. A tale scopo topi trattati cronicamente con i cannabinoidi verranno riesposti ad una dose soglia di THC e/o CP-55,940 dopo un lungo intervallo di sospensione dalla droga stessa e sottoposti ad analisi comportamentale verificando la presenza di comportamenti specifici della sensitizzazione da cannabinoidi (stereotipie, attività esplorativa).
5) studio in topi wild type dell’effetto della somministrazione in vivo di SL327, inibitore selettivo di MAPK/ERK kinasi sullo sviluppo delle sopracitate risposte acute e croniche ai cannabinoidi.
6) valutazione dell’attivazione dei più comuni fattori di trascrizione correlati alla fosforilazione di ERK e/o attivati dal signalling del recettore cannabico nelle diverse aree cerebrali di topi knock out e wild type dopo trattamento acuto e cronico. In particolare i cervelli verranno rapidamente prelevati dagli animali trattati e le aree cerebrali dissezionate seguendo le coordinate stereotassiche dell’atlante di Franklin and Paxinos ("The mouse brain in stereotaxic coordinates", New York, Academic Press,1996)al fine di preparare estratti nucleari in cui valutare l’attività di fattori di trascrizione quali cfos, fos B, c-jun, Elk-1 e CREB. A tale scopo verranno impiegati kit ELISA disponibili commercialmente che utilizzano specifici anticorpi diretti contro la forma fosforilata (attivata) di tali fattori e identificabili mediante anticorpi secondari coniugati con perossidasi di rafano (HRP) che permette una reazione colorimetrica facilmente quantificabile tramite l’uso di uno spettrofotometr
Adolescent cannabis consumption and schizophrenia: epidemiological and experimental evidencers
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