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Proteasi nexina-1: produzione e caratterizzazione funzionale della proteina ricombinante, e studi strutturali mediante "molecular modelling".
No full textProtease Nexin-1 (PN-1) is a member of the serpin superfamily which mainly inhibits Thrombin; this inhibition is enhanced by the interaction with heparin. This protein is involved in embryogenesis of the nervous system and of the sexual organs and probably exherts a role in a variety of pathologies such as Alzheimer disease and scleroderma. Even though this protein can be obtained by the media of different cell lines and different systems to obtain recombinant PN-1 have been developed, the yields are in general rather low. For this reason in our lab we have tried to develop a method to produce recombinant PN-1 and obtain higher yields compared to the ones previously reported to be able to perform a structural study of this protein. Two different expression systems have been used: hamster BHK cells and E. coli. Both systems have given satisfactory yields but the one in E. coli,because of slightly higher yields of expressed PN-1 and because of the easier preparation resulted as best. At the end of the process of purification the total yield was of 0.2-0.15 mg/L of bacterial colture. Recombinant PN-1 has been characterized for its inhibitory and cellular activities. Recombinant PN-1 correctly inhibits Thrombin: this interaction is, as for the native protein, enhanced by heparin. Furthermore Thrombin mutants, previously produced in our lab, correctly recognise and cleave PN-1 only if still enzimatically active. We have also characterized the binding of PN-1 to heparin determining the equilibrium interaction constant (Kd=31nM). The cellular activity of PN-1 has been tested by analysing its ability to cause stellation in neural cells. We used Nb2A mouse nuroblastoma cells, and a recombinant PN-1 concentration of 50 nM has been able to cause complete stellation. We have also employed the technique of molecular modelling to perform a structural analysis of PN-1 using two serpins, PAI-1 and ATIII as models. First of all we localised the heparin binding site on the structure helix D and the site responsable for Thrombin-PN-1 complexes clearance on the loop connecting helices A and B. We also showed that presumably the interaction with heparin does not cause, for PN-1, the same structural activation of ATIII. These results show how it has been possible to develop a method to produce a recombinant PN-1 and that this protein is active both as an inhibitor and on cells. This protein will be used to confirm and widen the structural data obtained by molecular modelling. The recombinant PN-1 so obtained could also be used to invetigate the phisiological and pathological activities that have been connected to this serpin in the past few years
Traffico molecolare citoplasma-nucleo: trasporto nel nucleo ed accumulo nucleolare della proteina ribosomale umana L7a.
No full textStudio della correlazione tra attività proteolitica e attività cellulari della trombina mediante la costruzione di mutanti con alterata funzione enzimatica.
No full textProcedimento per la preparazione di antitrombina III umana, vettori e cellule eucariotiche modificati impiegabili nel procedimento, ed usi della glicoproteina ricombinante cosi' ottenibile
No full textDESCRIZIONE DELL'INVENZIONE INDUSTRIALE DAL TITOLO: "PROCEDIMENTO PER LA PREPARAZIONE DI ANTITROMBINA III UMANA, VETTORI E CELLULE EUCARIOTICHE
MODIFICATI IMPIEGABILI NEL PROCEDIMENTO, ED USI DELLA GLICOPROTEINA RICOMBINANTE COSI' OTTENIBILE" DELL'ENTE ITALIANO MINISTERO DELL'UNIVERSITA' E
DELLA RICERCA SCIENTIFICA E TECNOLOGICA, CON SEDE IN ROMA (ITALIA
Interazione fisica e funzionale del repressore IkB-alfa di NF-kB con il transattivatore TAT di HIV-1.
No full textFIK7, un nuovo "partner" proteico per il fattore di trascrizione neurospecifico mKLF7.
No full textmKLF 7 é un fattore di trascrizione murino appartenente alla famiglia "Kruppel like", proteine con sequenza omologa al prodotto proteico del gene "Kruppel" di Drosophila. Esperimenti di ibridazione in situ hanno mostrato che mKLF 7 presenta un caratteristico profilo di espressione durante l'embriogenesi, che segue quello del gene neurospecifico Neuro D. In particolare, il profilo di espressione di mKLF 7 sembra coinvolgere questo fattore di trascrizione nella regolazione della differenziazione dei nuroblasti e della funzionalità dei neuroni mediante il mantenimento di un fenotipo post-mitotico. In questo progetto di ricerca l'obiettivo era quello di isolare un nuovo/i "partner" proteico per mKLF 7 che fosse coinvolto nella regolazione del suo ruolo di fattore di trascrizione neurospecico. A tale scopo é stata analizzata una libreria di espressione preparata da mRNA neuronale mediante il sistema del doppio ibrido nel lievito. Da questa analisi é stato isolato l'amminoterminale di una nuova proteina. Un frammento più esteso dell'amminoterminale é stato isolato mediante l'analisi di una libreria fagica di cDNA embrionale, mentre mediante l'analisi di una banca dati EST murina é stato isolata la restante porzione carbossiterminale. Per la presenza all'amminoterminale di un dominio proteico altamente conservato chiamato F-box, questa nuova proteina é stata chiamata FIK7, proteina F-box Interagente con mKLF 7. Le proteine F-box sono una famiglia di recettori solubili che reclutano substrati fosforilati al complesso proteico Ubiquitina-Ligasi. In questo lavoro é stato caratterizzato il profilo di espessione di FIK7 mediante esperimenti di Northern Blot ed inbridazione in situ. FIK7 é una proteina particolarmlente espressa in linee cellulari poco differenziate ed altamente proliferanti come le cellule delle cripte a livello intestinale e gli spermatogoni a livello dei tubuli seminiferi. Inoltre, esperimenti di "pull down" e co-immunoprecipitazione nelle cellule, realizzati con diversi mutanti di delezione dell'amminoterminale di FIK7 hanno dimostrato che i dominii proteici compresi tra gli aminoacidi 1-99 e 150-350 sono direttamente coinvolti nell'interazione con mKLF 7. I dati biochimici di interazione proteica con mKLF 7 insieme con il classico profilo di espressione di FIK7 suggeriscono fortemente la possibilità di un ruolo per questa proteina F-box di coregolatore negativo per mKLF 7. Questa ipotesi é avvalorata dalla presenza nella sequenza proteica di mKLF 7 di un dominio P.E.S.T., un segnale proteolitico condizionale che implica il coinvolgimento della via degradativa ubiquitino-dipendente. Questa via, quindi, potrebbe risultare uno dei sistemi di regolazione più importanti della attività trascrizionale di mKLF 7, che garantirebbe l'uscita delle cellule dalla fase G1 e/o il mantenimento di un fenotipo indifferenziato sia durante lo sviluppo del SNC e del SNP che durante la vita adulta
Post-transcriptional regulatory strategies and extraribosomal functions of human rpL3
No full textrpL3 gene produces in addition to canonical mRNA isoform normally translated in protein, an alternative isoform, containing a PTC (premature termination codon) degraded by NMD (Nonsense mediated mRNA decay).
Moreover, overexpression of rpL3 causes an increase of alternative isoform level, unproductive, which results in rpL3 decrease. This negative feedback loop triggered by the accumulation of ribosomal protein, is a strategy that finely regulates the amount of ribosomal protein to an appropriate level, especially relevant to any extra-ribosomal functions of rpL3.
hnRNP H1, NPM and KHSRP are involved with different roles in the post-transcriptional regulation of rpL3 gene and we hypothesize a model of regulation that provides a sequence of interactions between these proteins and rpL3 transcript.
This post-transcriptional regulation, that provides the association of alternative splicing and NMD, can be very important to finely modulate the rpL3 amount available to extra-ribosomal functions
Extended interactions with prothrombinase enforce affinity and specificity for its macromolecular substrate
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Extended interactions with prothrombinase enforce affinity and specificity for its macromolecular substrate
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