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"THE GENE TARGETING APPROACH OF SMALL FRAGMENT HOMOLOGOUS REPLACEMENT: INFLUENCE OF EPIGENETICS, DNA REPAIR AND CELL CYCLE"
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Influenza del pattern mutazionale del gene CFTR sul test genetico e sulla relazione genotipo-fenotipo in diverse forme di fibrosi cistica.
No full textLa Fibrosi Cistica (FC; OMIM 219700) può originare da oltre 1800 variazioni di sequenza del gene CFTR (Cystic Fibrosis
Transmembrane Conductance Regulator). Le manifestazioni cliniche sono estremamente variabili, con una relazione tra genotipo e fenotipo spesso poco chiara. La ricerca mutazionale non è inoltre sempre in grado di rilevare tutte le mutazioni.
Abbiamo studiato 610 pazienti classificati in 4 popolazioni: 1) FC con insufficienza pancreatica (FC-PI, n =354); 2) FC con sufficienza pancreatica (C-PS, n=138); 3) forme mono-oligo-sintomatiche di F C (CFTR-RD, n=71); 4) assenza bilaterale congenita dei vasi deferenti (CBAVD, n =47). La ricerca mutazionale nel CFTR è stata condotta con un approccio multistep volto all'analisi di: a) 32 mutazioni più frequenti al mondo (saggio CF-OLA, Abbott); b) 14 mutazioni più frequenti nell'area geografica specifica (mediante un saggio di primer extension); c) tratto variante (TG)mTn (mediante sequenziamento); d) regione 5'–prossimale, tutti gli esoni e zone introniche adiacenti (mediante sequenziamento): e) 7 macro-delezioni più frequenti al mondo (saggio FC-DEL, Nuclear Laser Medicine).
Abbiamo evidenziato 130 diversi alleli mutati (tra i quali 11 nuovi e 10 con più di una mutazione in cis) e 228 diversi genotipi. Sono state riscontrate differenze significative (p <0.0001) tra i pattern mutazionali delle 4 popolazioni analizzate. Questa eterogeneità influenza la detection rate (DR, proporzione di alleli mutati identificati) dei singoli step della ricerca mutazionale. Ad esempio, gli step di ricerca di pannelli mutazionali (a+b) risultano avere una elevata DR in FC-Pl (0.890), un valore intermedio in FC-PS (0.725), ma valori bassi in CFTR-RD (0.535) e CBAVD (0.255). Aggiungendo gli altri step di ricerca mutazionale (c+d+e) si ottiene un notevole incremento nella DR in FC-PI (0.993), FC-PS (0.967) e CFTR-RD (0.965), ma un valore comunque limitato in CBAVD (0.585). Oltre a ciò,19 diversi genotipi mutati sono stati trovati in almeno 2 diverse popolazioni, evidenziando la complessità del rapporto tra genotipo e fenotipo.
Questi risultati hanno importanti ricadute sull'organizzazione e interpretazione del test genetico in FC, nonché per la comprensione della relazione tra genotipo e fenotipo
The Gene Targeting Approach of Small Fragment Homologous Replacement (SFHR) Alters the Expression Patterns of DNA Repair and Cell Cycle Control Genes
Full text linkCellular responses and molecular mechanisms activated by exogenous DNA that invades cells are only partially understood. This limits the practical use of gene targeting strategies. Small fragment homologous replacement (SFHR) uses a small exogenous wild-type DNA fragment to restore the endogenous wild-type sequence; unfortunately, this mechanism has a low frequency of correction. In this study, we used a mouse embryonic fibroblast cell line with a stably integrated mutated gene for enhanced green fluorescence protein. The restoration of a wild-type sequence can be detected by flow cytometry analysis. We quantitatively analyzed the expression of 84 DNA repair genes and 84 cell cycle control genes. Peculiar temporal gene expression patterns were observed for both pathways. Different DNA repair pathways, not only homologous recombination, as well as the three main cell cycle checkpoints appeared to mediate the cellular response. Eighteen genes were selected as highly significant target/effectors of SFHR. We identified a wide interconnection between SFHR, DNA repair, and cell cycle control. Our results increase the knowledge of the molecular mechanisms involved in cell invasion by exogenous DNA and SFHR. Specific molecular targets of both the cell cycle and DNA repair machineries were selected for manipulation to enhance the practical application of SFHR
Parametrizzazione del software SeqScape per l’analisi mutazionale dei dati di sequenza del gene CFTR
No full textThe genetics of CFTR: genotype – phenotype relationship, diagnostic challenge and therapeutic implications
Full text linkNon
Il pattern mutazionale del gene CFTR in diverse forme di fibrosi cistica influenza le caratteriastiche operative del test genetico.
No full textLa Fibrosi Cistica ( FC; OMIM 219700) può originare da oltre 1800 diverse variazioni di sequenza del gene CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator). Le manifestazioni cliniche sono estremamente variabili, con una relazione tra genotipo e fenotipo spesso poco chiara. L a ricerca mutazionale non è inoltre sempre in grado di rilevare tutte le mutazioni presenti. L'obiettivo specifico di questo lavoro è valutare se le caratteristiche operative del test genetico per FC siano influenzate dalla metodologia di indagine mutazionale eventualmente applicata a diverse forme cliniche di FC.
Abbiamo studiato 610 pazienti classificati in 4 popolazioni: 1) FC con insufficienza pancreatica (FC-PI, 354 pazienti); 2) FC con sufficienza pancreatica (FC-PS, 138 pazienti); 3) forme atipiche e/o mono- od oligo-sintomatiche di FC (nel complesso identificate come CFTR-RD, 71 pazienti); 4) assenza bilaterale congenita dei vasi deferenti, quale unica manifestazione clinica monosintomatica (CBAVD, 47 pazienti). La ricerca mutazionale nel CFTR è stata condotta con un approccio multistep volto all'analisi: a) delle 32 mutazioni più frequenti al mondo (saggio CF-OLA, Abbott); b) delle 14 mutazioni più frequenti nell'area geografica specifica (mediante un nostro saggio di primer extension); c) del tratto variante (TG)mTn (mediante un nostro saggio di sequenziamento); d) della regione 5'-prossimale, di tutti gli esoni e delle zone introniche adiacenti (mediante un nostro saggio di sequenziamento); e) delle 7 macro-delezioni più frequenti al mondo (saggio FC-DEL, Nuclear Laser Medicine).
Abbiamo evidenziato 125 diversi alleli mutati (tra i quali 11 nuovi e 10 complessi con più di una mutazione in cis), suddivisi in 225 diversi genotipi. Sono state riscontrate differenze significative (chi-quadrato, p<0.0001) tra i pattem mutazionali delle 4 popolazioni analizzate. Questa eterogeneità influenza la detection rate (DR) sia allelica (DRa = proporzione di alleli mutati identificati) che genotipica (DRe = proporzione di genotipi completamente caratterizzati con 2 alleli mutati) dei singoli step della ricerca mutazionale. Ad esempio, gli step di ricerca di pannelli mutazionali (a+b) risultano avere, da soli, un'elevata DRa in FC-PI (0.890), un valore intermedio in FC-PS (0.725), ma valori piuttosto bassi di DRa in CFTR-RD (0.535) e CBAVD (0.255). Aggiungendo gli altri step di ricerca mutazionale (c+d+e) si ottiene un notevole incremento nella DRa in FC-PI (0.993), FC-PS (0.967) e CFTR-RD (0.965), ma un valore di DRa
totale comunque limitato in CBAVD (0.564). Non risulta possibile individuare un unico pannello mutazionale che massimizzi la DRa in tutte le popolazioni. Inoltre, solo per la popolazione CF-PI appare possibile individuare un pannello con un numero limitato di mutazioni ed elevata DR. Per ottenere un'elevata DR nelle altre popolazioni è necessaria l'indagine di un elevato numero di mutazioni, anche rare e/o individuali. Oltre a ciò, 19 diversi genotipi mutati sono stati trovati in almeno 2 diverse popolazioni, evidenziando la complessità del rapporto tra genotipo e fenotipo.
Questi risultati hanno importanti ricadute sull'organizzazione e interpretazione del test genetico in FC, in particolare per il test del portatore, nonché per la comprensione della relazione tra genotipo e fenotipo
Caratterizzazione genetica di soggetti affetti da fibrosi cistica mediante metodi semiautomatizzati di analisi mutazionale ad elevata sensibilità
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