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The role of dimerisation in the cellular trafficking of G-protein-coupled receptors
No full textThe concept that G-protein-coupled receptors can exist as homomeric and/or heteromeric complexes is now well established. Despite this, how dynamic such interactions are and if this may be modulated during receptor trafficking remain topics of debate. Use of endoplasmic reticulum trapping strategies and the generation of asymmetric homomers have started to provide information on the contribution of protein–protein interactions to receptor maturation, cell surface delivery and ligand-mediated endocytosis. Although dimer/oligomer formation appears to be essential for cell surface delivery of class A and class C GPCRs, this may not be the case for class B receptors
The sushi domains and their role in GABA(B) receptor compartmentalization
No full textGABAB receptors are G protein-coupled receptors fo
Proline-rich tyrosine kinase 2 mediates gonadotropin-releasing hormone signaling to a specific extracellularly regulated kinase-sensitive transcriptional locus in the luteinizing hormone beta-subunit gene
No full textG protein-coupled receptor regulation of gene transcription primarily occurs through the phosphorylation of transcription factors by MAPKs. This requires transduction of an activating signal via scaffold proteins that can ultimately determine the outcome by binding signaling kinases and adapter proteins with effects on the target transcription factor and locus of activation. By investigating these mechanisms, we have elucidated how pituitary gonadotrope cells decode an input GnRH signal into coherent transcriptional output from the LH beta-subunit gene promoter. We show that GnRH activates c-Src and multiple members of the MAPK family, c-Jun NH2-terminal kinase 1/2, p38MAPK, and ERK1/2. Using dominant-negative point mutations and chemical inhibitors, we identified that calcium-dependent proline-rich tyrosine kinase 2 specifically acts as a scaffold for a focal adhesion/cytoskeleton-dependent complex comprised of c-Src, Grb2, and mSos that translocates an ERK-activating signal to the nucleus. The locus of action of ERK was specifically mapped to early growth response-1 (Egr-1) DNA binding sites within the LH beta-subunit gene proximal promoter, which was also activated by p38MAPK, but not c-Jun NH2-terminal kinase 1/2. Egr-1 was confirmed as the transcription factor target of ERK and p38MAPK by blockade of protein expression, transcriptional activity, and DNA binding. We have identified a novel GnRH-activated proline-rich tyrosine kinase 2-dependent ERK-mediated signal transduction pathway that specifically regulates Egr-1 activation of the LH beta-subunit proximal gene promoter, and thus provide insight into the molecular mechanisms required for differential regulation of gonadotropin gene expression
Lag time (min) plotted over molecular weight (g/mol).
No full textLag time (min) plotted over molecular weight (g/mol).</p
Purification and characterization of heterologously produced cannabinoid receptor 1 and G proteins
No full textG protein coupled receptors form the largest group of transmembrane proteins, which are involved in signal transduction and are targeted directly or indirectly by 40-50% of the drugs in the market. Even though a lot of biochemical and pharmacological information was acquired for these receptors in the past decades, structural information is still insufficient. G protein coupled receptors are expressed in a very minute scale in the tissues. Purification of G protein coupled receptors, in amounts needed for structural studies, from native tissue is tedious and almost impossible. To overcome this first hurdle of insufficient protein, several heterologous protein expression systems are being used. Another difficulty in structural determination of a G protein coupled receptor is that it is a membrane protein. Membrane proteins are difficult targets for structural studies. One of the possible reasons is the little hydrophilic surface area on the membrane protein, reducing the chances of crystal contact between the molecules. The present work is an attempt to investigate possible ways to overcome these problems. Aim of the project was to use G proteins to increase the hydrophilic area of the G protein coupled receptor. G protein is a physiological partner to the G protein coupled receptor which makes the complex functionally relevant. In the present work five G alpha proteins were purified to homogeneity by a two step purification using metal affinity and ion-exchange chromatography. The G alpha subunits purified were tested for their detergent susceptibility. It was found that only some G proteins were active in the presence of detergent. Observation from contemporary reports also suggest that the G alpha proteins expressed in Escherichia coli, alone may not be sufficient to bind to the G protein coupled receptors in solution. So the project was extended towards expressing a G protein coupled receptor which was reported to exist in a complex with the G proteins, in the cells. Purifying such a functional complex could be more beneficial to use for crystallization. Cannabinoid receptors were chosen for heterologous expression and purification. Production of recombinant cannabinoid receptor 2 was investigated in Pichia pastoris. The protein obtained was highly heterogenous. There were several oligomeric forms as well as degradation products in the cell membranes. Most of the protein was lost in the purification steps leading to a poor yield. Several oligomeric forms and other impurities were still present in the protein sample after purification. Alternatively, a baculovirus mediated insect cell expression system was investigated, to produce the receptors. Cannabinoid receptor 1 was investigated in insect cell expression system because of its better biochemical understanding and pharmacological importance than cannabinoid receptor 2. Cannabinoid receptor 1 was produced in two forms, a full length and a distal carboxy terminal truncated version. All the several gene constructs made could be expressed in the Spodoptera frugiperda (Sf9) insect cells. Expression levels (Bmax) for the constructs with a decahistidine tag at the amino terminus and Strep-tagII at the carboxy terminus were 40 pmol/mg and 53 pmol/mg respectively, for full length and truncated versions. These expression levels are 2 fold higher than the levels reported till now in the literature. As was quite evident from previous experiences of other research groups, purification of this receptor was a challenge. Protein purified from immobilized metal affinity chromatography (Ni-nitrilo tri acetate)(Ni-NTA) was not even 50% pure. A second purification by immobilized monomeric avidin or Streptactin agarose, making use of Biotag and StreptagII respectively, drastically reduced the protein recovery. Later on, purification of receptor was investigated on different metal chelating resins. His-Select, a Ni-NTA based matrix from Sigma, with much lesser density than Ni-NTA from Qiagen, showed a better purification profile. Purification was optimized to get 80% homogeneity but with low yield (20%). Further efforts are needed to improve the yield and purity of the receptor, to use it for crystallization. Cannabinoid receptors are known to exist in a precoupled form to G proteins in the cells. The existence of such precoupled forms of the receptor was investigated using the fluorescence techniques. Guanosine-5-triphosphate binding assay on the cell membranes, in the absence of agonists confirmed the active precoupled form of the receptor. It was found that it is possible to co-immunoprecipitate the complex. These results show that the truncated cannabinoid receptor can be produced in functional form in insect cells in much higher yields than reported. This receptor exists as a complex with G proteins even in the absence of ligands. It was also shown that the receptor/G protein complex can be coimmunoprecipitated. Further work is required to investigate the possibility of purifying this complex to use it for co-crystallization.G-Protein gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) bilden die größte Hauptklasse innerhalb jener Gruppe von Transmembranproteinen, die ein extrazelluläres Signal in eine spezifische intrazelluläre Reaktion (Signaltransduktion) umwandeln. Etwa 3% des humanen Genoms codieren für GPCRs, wobei diese wiederum den Angriffspunkt für 40-50% der zurzeit auf dem Markt befindlichen Pharmaka bilden. Diese Angaben unterstreichen die Wichtigkeit der GPCR-Superfamilie und verdeutlichen die Notwendigkeit für ein tief greifendes Verständnis ihrer Funktionsweise. Die externen Stimuli, die über GPCRs eine spezifische intrazelluläre Reaktion auslösen können, sind sehr vielfältig. Sie reichen von Licht, Geruchs- und Geschmacksstoffen über Amine, Peptide, Lipiden und Nukleotiden bis hin zu Ionen wie etwa Ca2+. Die ligandeninduzierte Konformationsänderung des Rezeptors überträgt das Signal auf ein cytosolisches Guanin-Nukleotide bindendes Protein (GProtein), das daraufhin seinerseits eine Kaskade zellulärer Reaktionen startet. Während in den letzten Jahrzehnten vielfältigste biochemische und pharmakologische Daten über diese Proteinfamilie gesammelt werden konnten, sind die vorhandenen Strukturinformationen immer noch sehr ungenügend. Die einzige für diese Proteinsuperfamilie bisher verfügbare dreidimensionale Struktur hoher Auflösung ist die des bovinen Rhodopsins. Einer der Hauptgründe für die Schwierigkeit der Stukturaufklärung bei GPCRs ist die mangelnde Verfügbarkeit des Zielproteins selbst: In ihren nativen Geweben werden GPCRs üblicherweise nur in verschwindend geringen Mengen exprimiert. Daher ist die Reinigung der für Strukturuntersuchungen benötigten Mengen aus nativen Geweben stets sehr zeitaufwendig und in vielen Fällen gar nicht möglich. Um diese erste Hürde auf dem Weg der Strukturaufklärung zu überwinden, wurde eine Vielzahl heterologer Expressionssysteme etabliert. Eine weitere Schwierigkeit bei der Strukturbestimmung von GPCRs liegt in der Tatsache begründet, dass es sich bei dieser Proteinfamilie um integrale Membranproteine handelt, und bei diesen eine Strukturbestimmung generell eine große Herausforderung darstellt. Während zurzeit bei den löslichen Proteinen bereits mehr als 13000 hochauflösende Strukturen zur Verfügung stehen, sind es bei den Membranproteinen gerade einmal etwa 120. Einer der Gründe für dieses dramatische Ungleichgewicht dürften die nur recht kleinen hydrophilen Oberflächenbereiche der Membranproteine sein, da hierdurch die Möglichkeiten für Kristallkontakte zwischen den einzelnen Proteinmolekülen einschränkt wird. Bei GPCRs letztlich werden die einzigen hydrophilen Bereiche von den die Transmembranhelices verbindenden intra- und extrazellulären Schleifen sowie den N- und C-Termini gebildet. Die genannten Bereiche sind sowohl relativ klein als auch strukturell eher flexibel, was eine Kristallisation weiter erschwert. Die vorliegende Arbeit ist ein Versuch, Wege zur Lösung der oben genannten Probleme aufzuzeigen. Ziel des Projektes war die Verwendung von G-Proteinen, um zusammen mit einem GPCR einen Komplex zu schaffen, dessen hydrophiele Beireiche stark vergrößert sind. Es handelt sich hierbei um einen der Protein-Kokristallisation mit Fv-Antikörperfragmenten entsprechenden Ansatz. Da es sich bei G-Proteinen zudem um den physiologischen Bindungs- und Interaktionspartner der GPCRs handelt, wäre die Struktur eines solchen Komplexes zudem von besonderem Interesse. Bei G-Proteinen handelt es sich um heterotrimere Proteine, mit je einer alpha-, beta- und gamma-Untereinheit, wobei der alpha-Untereinheit (G alpha) bei der Wechselwirkung mit dem GPCR die größte Bedeutung zukommt. Im humanen Genom wurden 21 verschiedenartige alpha-Untereinheiten identifiziert, wobei es sich jedoch bei einigen von ihnen um Splice-Varianten handelt. In der vorliegenden Arbeit wurden insgesamt 16 verschiedene G-alpha-Untereinheiten unter Verwendung des GATEWAY®-Systems in den Vektor pDEST14 kloniert und in Escherichia coli expremiert. Zur Bestimmung der optimalen Induktionsbedingungen und -zeiten kam ein Hochdurchsatz-Screen auf Dotblot-Basis zum Einsatz. Bei fünf der in E. coli exprimierten G-alpha-Untereinheiten war es möglich, diese mittels einer Kombination aus Immobilisierter Metallchelat-Affinitätschromatographie (IMAC) und Ionenaustausch-Chromatographie rein darzustellen. Die Bemühungen, auch die G-beta- und G-gamma-Untereinheiten in E. coli herzustellen, waren hingegen nicht erfolgreich. G-alpha-q, das zu jenen G-alpha-Untereinheiten zählt, die sich nicht in E. coli expremieren ließen, wurde erfolgreich in der methylotrophen Hefe Pichia Pastoris produziert. Das aus P. pastoris gereinigte G-alpha-q-Protein konnte für Kristallisationsansätze genutzt werden. Unter einer Bedingung wurden Kristalle erhalten, die eine Röntgenbeugung bis 6,5 Å zeigten. Zurzeit besteht ein Problem bei der Produktion dieser Untereinheit, das noch der Klärung bedarf. Die G-alpha-Untereinheiten, die rein dargestellt werden konnten, wurden hinsichtlich ihrer Aktivität in Detergenz analysiert. Hierbei zeigte sich, dass die Mitglieder der G-alpha-s-Subklasse (stimulieren die Adenylat-Cyclase) in Detergenz keinerlei Aktivität aufwiesen. Die Mitglieder der G-alpha-i-Subklasse (inhibieren die Adenylat-Cyclase) behielten hingegen in den meisten der getesteten Detergenzien ihre Fähigkeit der Guanosintriphosphat(GTP)-Bindung bei. Aus diesen Ergebnissen folgt, dass die Kokristallisation eines GPCRs mit G-alpha-s wohl nicht sinnvoll ist, da bei solchen Ansätzen aufgrund des Rezeptors stets Detergenz anwesend sein muss. Zu diesem Zeitpunkt des Projektes standen in unserem Institut nur wenige an G-alpha-i koppelnde GPCRs zur Verfügung, die in ausreichenden Mengen rein dargestellt werden konnten um die G-alpha-i-Bindung zu studieren. Des Weiteren legten andere Veröffentlichungen nahe, dass in E. coli produzierte G-alpha-Untereinheiten alleine nicht in der Lage sind, an GPCRs zu binden. Aus diesen Gründen wurde das Projekt dahingehend erweitert, einen jener GPCRs zu gewinnen, von denen berichtet wurde, sie lägen in der Zelle bereits ohne gebundenen Liganden in einem Komplex mit ihrem G-Protein vor. Von der Reinigung eines solchen physiologischen Komplexes wurden sich erhebliche Vorteile für die Kristallisation versprochen. Für die heterologe Produktion und anschließende Reinigung unter oben genanntem Aspekt wurden die Cannabinoid-Rezeptoren ausgewählt. Zurzeit unterscheidet man zwei Subtypen von Cannabinoid-Rezeptoren. Zum einen den Cannabinoid-Rezeptor 1, der vornehmlich im zentralen und peripheren Nervensystem vorkommt und zum anderen den Cannabinoid-Rezeptor 2, welcher in Immunzellen gefunden wird. Beide Subtypen koppeln an G-alpha-i/o. Aus ihrer histologischen Verteilung wurde gefolgert, dass der Cannabinoid-Rezeptor 1 vermutlich eine neuroprotektive Funktion hat, während der Cannabinoid-Rezeptor 2 immunosuppressiv wirkt. Die Cannabinoid-Rezeptoren sind zudem der Angriffspunkt der Inhaltsstoffe von Cannabis (Marihuana, Haschisch), der am weitesten verbreiteten Rauschmittel. Die Verwendung von Marihuana geht jedoch über die eines bloßen Rauschmittels hinaus, da es bereits seit 2000 vor Christus zur Behandlung einer Reihe von Krankheiten eingesetzt wird. Der Pflanzenextrakt aus Cannabis sativa war z.B. dafür bekannt, Schmerzen zu lindern, Übelkeit zu unterdrücken und den Appetit zu fördern. Nach wissenschaftlicher Analyse des Cannabis sativa-Extraktes konnte delta-9-Tetrahydrocannabinol als hauptsächlicher aktiver Bestandteil identifiziert werden. Der Pflanzenextrakt enthält jedoch etwa 50 weitere, diesem verwandte Verbindungen, die mit unterschiedlichen Affinitäten an die Cannabinoid-Rezeptoren binden und eventuell eigene pharmakologische Wirkungen entfalten. Weitreichende Forschungen während der letzten Jahrzehnte haben demonstriert, dass es sich bei den Cannabinoid-Rezeptoren um viel versprechende Zielproteine bei der Bekämpfung einer Vielzahl von Krankheitssymptomen handelt. Die Produktion des Cannabinoid-Rezeptors 2 wurde zunächst im Pichia pastoris Expressionssystem untersucht. Das Expressionskonstrukt beinhaltete ein N-terminales Dekahistidin-Anhängsel sowie C-terminal die Biotinylierungsdomäne der Transcarboxylase aus Propionibacterium shermanii (Biotag). Leider stellte sich das produzierte Protein als ausgesprochen heterogen heraus, in den Zellmembranen waren mehrere oligomere Formen vorhanden, sowie verschiedene Degradationsprodukte. Versuche zur Reinigung des Proteins erwiesen sich sowohl hinsichtlich der erreichten Reinheit als auch der Ausbeute als ungenügend. Zudem zeigte die analytische Gelfiltrations-Chromatographie, dass der Großteil des Proteins aggregiert war. Als alternatives Expressionssystem wurde daher die Bakulovirus-vermittelte Expression in Insektenzellen untersucht. Hierbei lag der Fokus mehr auf der heterologen Produktion des Cannabinoid-Rezeptors 1, da bei diesem zum einen detaillierteres Verständnis der biochemischen Vorgänge vorliegt und er zum anderen die größere pharmakologische Wichtigkeit besitzt. Für die heterologe Produktion wurde sowohl eine Vollängenversion des Rezeptors als auch eine Version mit deletiertem C-Terminus verwendet. Zur Reinigung mittels Affinitätschromatographie wurden von beiden Versionen Konstrukte erstellt, die mit einem N-terminalen Polyhistidin-Anhängsel versehen waren und C-terminal entweder das Strep II-Anhängsel oder das Biotag trugen. Bei sämtlichen getesteten Konstrukten war eine Überproduktion in Spodoptera frugiperda (Sf9) Zellen zu beobachten. Mit N-terminalem Decahistidin-Anhängsel und C-terminalem Strep II-Anhängsel betrug das Produktionsniveau (Bmax) für das Vollängenkonstrukt 40 pmol/mg und 53 pmol/mg für die verkürzte Version. Diese Mengen sind gut doppelt so hoch wie die besten bis jetzt veröffentlichten Angaben und bilden eine gute Grundlage für eine nachfolgende Reinigung des Rezeptors. Die Charakterisierung des Rezeptors mittels Radioligandenbindung zeigte, dass die Agonistenbindung des Cannabinoid-Rezeptors 1 von der Anwesenheit von Magnesiumionen abhängig war, während die Antagonistenbinung Mg2+-unabhängig erfolgte. Ferner führten hohe Natriumchlorid-Konzentrationen im Reaktionspuffer zu einer verminderten Agonisten-Bindung, während sie die Antagonisten-Bindung nicht beeinflussten. Im Gegensatz zu anderen GPCRs konnte für den Cannabinoid- Rezeptors 1 auch dann noch Ligandenbindung gemessen werden, wenn 1,4-Dithiothreit (DTT) in höheren Konzentrationen (10 mM) anwesend war. Andererseits führte die Mehrzahl der getesteten Detergenzien zu einer Verringerung der Ligandenbindung. Aufgrund hoher unspezifischer Bindung des Radioliganden war ein Nachweis der Ligandenbindung für den solubilisierten sowie für den gereinigten Rezeptor bisher nicht erfolgreich. Wie den bereits vorliegenden Publikationen anderer Gruppen zu entnehmen war, stellte die reine Darstellung dieses Rezeptors eine erhebliche Herausforderung dar. Die nach Reinigung mittels IMAC vorliegende Präparation wies dann auch eine Reinheit von bestenfalls 50% auf. Eine nachfolgende zweite Affinitätschromatographie unter Verwendung von monomerer Avidin-Matrix (Biotag) oder Strep-Tactin-Agarose (Strep IIAnhängsel) führte zu einer drastischen Verringerung der Ausbeute. Im Falle der Strep-Tactin-Agarose erfolgte die Bindung des rekombinanten Rezeptors mit nur geringer Effizienz, während die Bindung an die monomere Avidin-Matrix überwiegend irreversibel war. Auch nach der zweiten Affinitätschromatographie wies die Präparation noch verschiedene Verunreinigungen auf und Variationen der Waschbedingungen konnten keine Verbesserung herbeiführen. Daraufhin wurde die Reinigung des Rezeptors mittels verschiedener IMAC-Matrices erprobt. Unter Verwendung einer von der Firma Sigma vertriebenen Ni-NTA-Matrix mit der Bezeichnung His-Select konnte ein deutlich verbessertes Reinigungsprofil erhalten werden. Unter optimierten Bedingungen wurde zwar eine Reinheit von etwa 80% erreicht, die Ausbeute lag hierbei allerdings lediglich bei 20% und war damit für den Beginn von Strukturuntersuchungen nicht genügend. Das Gelfiltrationsprofil des gereinigten Rezeptors war zudem inhomogen und deutete auf verschiedene oligomere Formen in der Präparation hin. Hier sind noch weitere Bemühungen erforderlich, um sowohl die Ausbeute als auch die Reinheit/Homogenität der Rezeptor-Präparationen so weit zu steigern, dass Kristallisationsversuche unternommen werden können. Von den Cannabinoid-Rezeptoren ist bekannt, dass sie in der Zelle auch ohne gebundenen Liganden bereits in einem Komplex mit dem G-Protein vorliegen (GPCR/GProtein-Komplex). Diese Eigenschaft könnte für die Kristallisation durchaus von großem Nutzen sein. Der GPCR/G-Protein-Komplex existiert sowohl in einer aktiven als auch einer inaktiven Form. Während der aktive GPCR/G-Protein-Komplex die konstitutiv aktive Form des Rezeptors darstellt, sind beide Formen an der G-Protein Sequestrierung in der Zelle beteiligt. Die Existenz beider genanter GPCR/G-Protein-Komplex wurde in dieser Arbeit mittels Fluoreszenztechniken untersucht. Durch Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (FRET)-Messungen konnte gezeigt werden, dass der Cannabinoid-Rezeptor 1 in dem beschriebenen Komplex mit Gi1 vorliegt. Für den C-terminal verkürzten Cannabinoid-Rezeptor 1 in Fusion mit dem gelb fluoreszierenden Protein (CB1-417-YFP) und Gi1 in Fusion mit dem cyan fluoreszierenden Protein (Gil-CFP) konnte die Kolokalisation innerhalb der Zelle auch bei Abwesenheit eines Liganden nachgewiesen werden. Mit einem Guanosintriphosphat-Bindungsassay an Zellmembranen konnte ferner nachgewiesen werden, dass der aktive GPCR/G-Protein-Komplex auch in der Abwesenheit eines Agonisten vorliegt. In einem weiteren Experiment wurden die Membranen von Zellen, die das verkürzte Rezeptorkonstrukt mit N-terminalem Flag-Anhängsel und das heterotrimere G-Protein koexprimierten solubilisiert und erfolgreich eine Koimmunopräzipitation des Rezeptor/G-Protein-Komplexes mittels Anti-Flag M2-Agarose durchgeführt. Die in der vorliegenden Arbeit erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass die C-terminal verkürzte Form des Cannabinoid-Rezeptors 1 in Insektenzellen funktionell produziert werden konnte, wobei die erreichten Produktionsniveaus weit über denen in bisherigen Veröffentlichungen liegen. Ferner konnte durch FRET-Experimente gezeigt werden, dass dieser Rezeptor auch in Abwesenheit eines Liganden in einem Komplex mit dem G-Protein vorliegt. Diese Ergebnisse wurden durch die erfolgreiche Koimmunopräzipitaion des Rezeptor/G-Protein-Komplexes bestätigt. Weiterführende Untersuchungen sind erforderlich, um zu überprüfen, in wie weit dieser Rezeptor/G-Protein-Komplexe gereinigt und eventuell für die Kokristallisation eingesetzt werden kann
Evolution of the G+C content frontier in the rat cytomegalovirus genome
No full textWithin the 230138 bp of the rat cytomegalovirus (RCMV) genome, the G+C content changes abruptly at position 142644, constituting a G+C content frontier. To the left of this point, overall G+C content is 69.2%, and to the right it is only 47.6%. A region of extremely low G+C content (33.8%) is found in the 5 kb immediately to the right of the frontier, in which there are no predicted coding sequences. To the right of position 147501, the G+C content rises and predicted coding sequences reappear. However, these genes are much shorter (average 848bp, 50% G+C) than those in the left two-thirds of the genome (average 1462bp, 70% G+C). Whole genome alignment of several viruses indicates that the initial ultra-low G+C region appeared in the common ancestor of the genera Cytomegalovirus and Muromegalovirus, and that the lowering of G+C in the right third has been a subsequent process in the lineage leading to RCMV. The left two-thirds of RCMV has stop codon occurrences at 67.5% of their expected level, based on a modified Markov chain model of stop codon distribution, and the corresponding figure for the right third is 78%. Therefore, despite heavy mutation pressure, selective constraint has operated in the right third of the RCMV genome to maintain a degree of gene length unusual for such low G+C sequences
The regulator of G protein signaling domain of axin selectively interacts with G?12 but not G?13
No full text10.1124/mol.106.023705Molecular Pharmacology7041461-146
The PKC, HOG and Ca2+ signalling pathways co-ordinately regulate chitin synthesis in Candida albicans
No full textOpen Access via PMC2649417Peer reviewe
The microcalorimetry study on the complexation of lead ion with metallothionein
No full textIsothermal titration calorimetry was firstly applied to investigate the metal-binding properties of metallothionein. Thermodynamic data of the replacement of metallothionein (Zn7MT) and the reconstitution of thionein (apoMT) with Pb(II) ion at pH 4.70 have been examined. The UV and CD spectrometries were also used to identify the products. The product of the reaction of Pb2+ with Zn7MT (reaction 1), Pb7MT, has a similar structure with Zn7MT, while a new lead-MT complex, Pb7MT', is formed in the case of reconstitution of apoMT (reaction 2). The thermodynamic parameters of the reactions for MT binding each mole of lead(II), Delta H-1=-25.2 kJ mol(-1), Delta G(1)=-28.7 kJ mol(-1), K-1=1.3x10(5), Delta S-1=11.6 J mol(-1) K-1 and Delta H-2=-17.8 kJ mol(-1), Delta G(2)=-32.4 kJ mol(-1), K-2=5.3x10(5), Delta S-2=48.8 J mol(-1) K-1, demonstrate that both reactions are spontaneous, exothermic, and entropy-increasing precesses. The contributions of relative interactions in both reactions to enthalpy and entropy changes are discussed. (C) 2000 Elsevier Science B.V. All rights reserved.Chemistry, AnalyticalChemistry, PhysicalSCI(E)CPCI-S(ISTP)
The interaction of Class B G protein-coupled receptors with their hormones
No full textIn common with many G protein-coupled receptors, dysfunction in members of the Class B or glucagon-like receptors can elicit a wide spectrum of disease related activities. Consequently, they an potential targets in many different areas of pharmacological research. Unlike the class A or rhodopsin-like receptors, for which at least some structural similarity to bacteriorhodopsin has been detected, absolutely no structural information is available for the Class B G protein-coupled receptors,We present a computational study that exploits the experimental work performed by evolution to indicate residues that are potentially involved in ligand binding in the Class B G protein-coupled receptors.We perform an analysis of mutations that occurred in a correlated fashion between the receptors and their peptidic ligands, The inference that the residues detected in this manner are involved in a direct interaction between the receptor and the ligand is in good agreement with the mutation studies that have already been published.European Mol Biol Lab, D-69117 Heidelberg, GermanyNovo Nordisk AS, Dept Biostruct, Malov 2760, DenmarkForschungsinst Mol Pharmakol, D-10315 Berlin, GermanySolvay Duphar Med Chem, NL-1380 DA Weesp, NetherlandsEscola Paulista Med, Dept Biofis, BR-04034 Sao Paulo, BrazilEuropean Bioinformat Inst, Cambridge CB10 1SD, EnglandEscola Paulista Med, Dept Biofis, BR-04034 Sao Paulo, BrazilWeb of Scienc
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