1,721,047 research outputs found
Apolipoprotein E Gen Polimorfizmlerinin Prostat Kanseri İle İlişkisi
No full textLocated right below the bladder, prostate is an organ which weighs approximately 18-20 gr and produces secretion. The prostate gland, which surrounds male urethras and ascends to the bladder neck, is a compressed and inverted conical structure measuring 2.5 cm. Prostate is the most common tissue in male body that is afflicted with benign or malign neoplasia. Benign growth of prostate gland is known as benign prostate hyperplasia (BPH). Prostate cancer is malign growth of organ volume caused by disrupted balance between cell proliferation and cell death in prostate gland. Prostate cancer is one of the most common cancer types in males in developed Western countries. In contrast to the high incidence rate of prostate cancer, molecular and genetic incidents in its development have yet to be enlightened. Today, it has been determined that 5-10% of prostate cancer is hereditary. Similar to Alzheimer s disease, prostate cancer has an increased incidence rate with advanced age as well.Prostat, mesanenin hemen altında 18-20 gr ağırlığında salgılama yapan bir organdır. Erkek üretrasını saran ve mesane boynu ile devam eden prostat bezi, 2.5 cm uzunluğunda, sıkıştırılmış ve ters yüz edilmiş konik bir yapı şeklindedir. Prostat, erkekte benign ya da malign en sık değişime uğrayan dokudur. Prostat bezinin iyi huylu büyümesi, benign prostat hiperplazisi (BPH) olarak adlandırılır. Prostat kanseri ise, prostat bezindeki hücre proliferasyonu ve hücre ölümü arasındaki dengenin bozularak, organ hacminin malign büyümesidir. Prostat kanseri, gelişmiş batı ülkelerinde erkeklerde en sık görülen kanser çeşitlerinden biridir. Prostat kanserinin yüksek insidansına rağmen oluşumundaki moleküler ve genetik olaylar tam olarak aydınlatılamamıştır. Günümüzde prostat kanserlerinin %5-10 unun ailesel olduğu saptanmıştır. Prostat kanserinin de tıpkı Alzheimer Hastalığı gibi ilerleyen yaşla birlikte görülme sıklığı artmaktadır
Diabetes İnsipidus’lu Hastaların Aqp2 Geninde Tanımlanan Mutasyonların Fonksiyonel Analizleri
No full textABSTRACT
FUNCTIONAL ANALYSIS OF MUTATIONS FOUND IN AQP2 GENE OF PATIENTS WITH DIABETES INSIPIDUS
TUĞÇE KARADUMAN
Master of Philosophy, Department of Biology
Supervisor: Prof. Dr. Hatice MERGEN
June 2018, 111 pages
The water homeostasis in the body is provided by balancing water loss and intake. Arginine vasopressin (AVP, ADH, antidiuretic hormone) is a hormone synthesized in the hypothalamus region of the brain and stored in the posterior part of the pituitary gland to be secreted when stimulated. In Diabetes Insipidus (DI) patients, production and activity of this hormone is reduced. This hormone regulates a vital function by increasing the reabsorption of water in the kidney collecting channel. Once the AVP hormone is secreted, AVP bounds to the arginine vasopressin receptor 2 (AVPR2) which is a transmembrane protein localized on the basolateral membrane of polarized epithelial cells of kidney nephron. AVPR2 is a G protein bound receptor (GPCR). Thus, G protein becomes active and activates adenylate cyclase. As a result, produced cAMP stimulates protein kinase A. Protein kinase A phosphorylates the aquaporin (AQP2) proteins which are present in the cell to enable localization of these proteins in apical membrane in tetramers. Absorption of water from the urine to the kidney cells is ensured through these channels. When the water reabsorption stimulus is over, AQP2 is removed from the membrane by endocytosis. Any pathology that may occur within this control system causes impairment of water homeostasis of the body and generation of DI.
AQP2 is a homotetrameric water channel responsible for the reabsorption of water in the kidney's main collecting duct cells. Mutations in AQP2 gene induce nephrogenic DI (NDI), a pathogenic condition in maintaining body water homeostasis, causing excess volume of urine to be produced. There are several hypotheses that have been proven by clinical and experimental observations in the literature regarding the role of these mutations in the pathogenesis of NDI. It has been proven that AQP2 gene mutations generally lead to misfolding of mutant protein or misleading of this protein; It has also been reported that nonfunctional water channels indicate correct membrane targeting.
The purpose of this study is to perform functional analysis of A45T, R85X and A147T mutations identified in the AQP2 gene in NDI patients. It is aimed to contribute to the treatment approaches for the development of pharmacological agents which can be more effective in the treatment of the disease through the evaluation of the results obtained from the experimental studies in correlation with the clinical information of the patients.
For the purposes of this study; expression vector carrying the wild-type coding AQP2 sequence was provided and appropriate expression vectors containing mutant AQP2 gene sequences were prepared using the site-directed mutagenesis method. Following this process, stable transfection of wild-type and mutant vectors into MDCK cells was performed. Deglycosylation experiments were conducted to investigate the intracellular maturation process of mutant proteins by expression of the vectors in MDCK cells. Cycloheximide analysis was also performed to determine the half-lives of the proteins and the results of both the deglycosylation experiments and the cyclohexamide experiments were evaluated by immunoblot analysis. Immunocytochemical analyses were performed to determine the intracellular traffic of mutant AQP2 proteins.
Within the framework of functional analysis studies performed on the Xenopus laevis oocyte expression system of AQP2 gene mutations, oocyte expression vectors containing wild type and mutation were injected into oocyte cells and total membrane and plasma membranes were isolated in order to determine the expression levels of AQP2 protein in oocytes; wild type protein and mutant proteins membrane ratios were compared through immunoblot analysis. To determine the effects of mutant AQP2 proteins on water uptake mechanism, oocyte cells were tested for water permeability.
As a result, within the framework of this thesis, all mutant AQP2 proteins showed alteration of function compared to the wild type AQP2.
Keywords: Diabetes insipidus, AQP2, functional analysisİÇİNDEKİLER
Sayfa
ÖZET i
ABSTRACT iv
TEŞEKKÜR vii
İÇİNDEKİLER ix
ÇİZELGELER DİZİNİ xiii
ŞEKİLLER DİZİNİ xiiii
SİMGELER VE KISALTMALAR xvii
1. GİRİŞ 1
2. GENEL BİLGİ 3
2.1. Vücut Su Dengesi ve Böbrek Su Kanalları 3
2.1.1. Böbrek Su Kanalları 3
2.1.2. Vücuttaki Su Dengesinin Vazopressin ile Regülasyonu 6
2.1.3. Renal AQP2’nin Vazopressin ile Regülasyonu 6
2.1.4. AQP2 Regülasyonunun Hücresel ve Moleküler Mekanizması 8
2.2. Diabetes İnsipidus 11
2.2.1. Nefrojenik Diabetes İnsipidus 13
2.2.2. Konjenital NDI 14
2.2.2.1. X-Bağlantılı NDI ve AVPR2 mutasyonları 16
2.2.2.2. AQP2 Mutasyonları 18
2.2.2.3. Otozomal Çekinik NDI 20
2.2.2.4. Otozomal Baskın NDI 23
2.3. Nefrojenik Diabetes İnsipidus’da Genetik Test Değerlendirmesi 25
2.4. Nefrojenik Diabetes İnsipidus’da AQP2-Temelli Terapötik Yaklaşımlar 25
2.4.1. Fosfodiesteraz İnhibitörleri 25
2.4.1.1. Siklik GMP (cGMP) Yolak Aktivasyonu 25
2.4.1.2. Siklik AMP (cAMP) Yolak Aktivasyonu 26
2.4.2. Statinler 26
2.4.3. Prostaglandinler 27
2.4.4. Isı şoku proteini (Hsp90) 27
3. MATERYAL ve YÖNTEM 28
3.1. Fonksiyon Analizi Gerçekleştirilecek Olan Mutasyonların Belirlenmesi 29
3.2. Hücre Kültürü Çalışmalarında Kullanılan Mutant AQP2 Genini İçeren İfade Vektörlerinin Site-Directed Mutagenez Yöntemi ile Hazırlanması 31
3.2.1. AQP2 Geni Taşıyan İfade Vektörünün Temin Edilmesi 31
3.2.2. Yabanıl AQP2 cDNA Dizisinde Site-Directed Mutagenez Yöntemi ile Çalışılacak Olan Mutasyonların Oluşturulması, Oluşturulan Dizilerin İfade Vektörlerine Aktarılması ve DNA Dizi Analizi Yöntemi ile Doğrulanması 33
3.3. MDCK Hücre Hattı ile Gerçekleştirilen Hücre Kültürü Çalışmaları 43
3.3.1. MDCK Hücrelerinin Üretilmesi 44
3.3.2. Dondurulmuş Hücrelerin Açılması 44
3.3.3. Hücrelerin Pasajlanması 45
3.3.4. Hücrelerin Dondurulması 45
3.3.5. Yabanıl Tip ve Mutant AQP2 Dizilerini İçeren İfade Vektörlerinin MDCK Hücrelerine Stabil Transfeksiyon Protokolü 46
3.4. Forskolin Uygulaması 49
3.5. Deglikozilasyon Deneyleri 50
3.6. Siklohekzimid Analizi 52
3.7. İmmünblot Analizi 53
3.8. Yabanıl ve Mutant Tip Hücrelerde İmmünsitokimyasal Analiz 54
3.9. Xenopus laevis Oosit İfade Sistemi Çalışmaları 56
3.9.1. Xenopus laevis Oosit İfade Sistemi Çalışmalarında Kullanılacak Olan Yabanıl Tip ve Mutant pT7TS-AQP2 Vektörlerinin Hazırlanması 59
3.9.2. Xenopus laevis Oositlerine Enjeksiyonu Gerçekleştirilecek Yabanıl Tip ve Mutant cRNA’ların in vitro Eldesi için Yapılan Çalışmalar 60
3.9.2.1. Yabanıl ve Mutant Tip Oosit İfade Vektörlerinin Doğrusal Hale Getirilmesi (Linearizasyonu) 60
3.9.2.2. Yabanıl ve Mutant Tip Lineer Oosit İfade Vektörlerinin Pürifikasyonu 61
3.9.2.3. Yabanıl ve Mutant Tip cRNA’ların Eldesi/Ekstraksiyonu 62
3.9.3. Xenopus laevis Oositlerinin ve İlgili Besiyerlerinin Temini 64
3.9.4. Xenopus laevis Oositlerine Yabanıl Tip ve Mutant pT7TS-AQP2 Vektörlerinden in vitro Olarak Elde Edilen cRNA’ların Enjeksiyonun Yapılması 64
3.9.5. İmmünblot Analizleri/Xenopus laevis Oositlerinden Total ve Plazma Membranlarının İzole Edilerek, Yabanıl ve Mutant Protein Miktarlarının Karşılaştırılması 66
3.9.6. Su Geçirgenlik Testinin Uygulanması 70
4. SONUÇLAR VE TARTIŞMA 72
4.1. Hücre Kültürü Çalışmalarında Kullanılacak Mutant AQP2 İçeren İfade Vektörlerinin Site-Directed Mutagenez Yöntemi ile Hazırlanması 72
4.1.1. AQP2 Geni Taşıyan İfade Vektörü İzolasyonu 72
4.1.2. Yabanıl AQP2 cDNA Dizisinde Site-Directed Mutagenez ile Çalışılacak Olan Mutasyonların Oluşturulması, Oluşturulan Dizilerin İfade Vektörlerine Aktarılması ve Doğrulanması 73
4.2. MDCK Hücre Hattı ile Gerçekleştirilen Hücre Kültürü Çalışmalarına İlişkin Sonuçlar 76
4.2.1. Stabil Transfeksiyon Protokolü Uygulanarak Elde Edilen Hücre Hatlarına İlişkin Görüntüler 76
4.2.2. Yabanıl ve mutant AQP2 protein ifadelerinin, stabil MDCK hücre hattı ve Xenopus laevis ifade sisteminde immünblot analiz sonuçlarının değerlendirilmesinde ön bilgi 78
4.2.3. Forskolin Uygulaması Sonuçları 78
4.2.3.1. Forskolin Uygulama Sonuçlarının Değerlendirilmesi 79
4.2.4. Deglikozilasyon Deney Sonuçları 80
4.2.4.1. Deglikozilasyon Deney Sonuçlarının Değerlendirilmesi 80
4.2.5. Siklohekzimid Analizi Sonuçları 81
4.2.5.1. Siklohekzimid Analizi Sonuçlarının Değerlendirilmesi 83
4.2.6. Yabanıl ve Mutant Tip Hücrelerde İmmünsitokimyasal Analiz Sonuçları 83
4.2.6.1. Yabanıl ve Mutant Tip Hücrelerde İmmünsitokimyasal Analiz Sonuçlarının Değerlendirilmesi 84
4.3. Xenopus laevis Oosit İfade Sistemi Çalışmalarında Kullanılacak Olan Yabanıl Tip ve Mutant pT7TS-AQP2 Vektörlerinin Hazırlanmasına İlişkin Sonuçlar 85
4.4. Xenopus laevis Oositlerine İnjeksiyonu Gerçekleştirilecek Yabanıl Tip ve Mutant cRNA’ların in vitro Eldesi için Yapılan Çalışma Sonuçları 88
4.4.1. Yabanıl ve Mutant Tip Oosit İfade Vektörlerinin Linearizasyon Sonuçları 88
4.4.2. Yabanıl ve Mutant Tip cRNA’ların Eldesi/Ekstraksiyonu 88
4.4.3. İmmunblot Analiz Sonuçları/Xenopus laevis Oositlerinden Total ve Plazma Membranlarının İzole Edilerek, Yabanıl ve Mutant Protein Miktarlarının Karşılaştırılmasına İlişkin Veriler 89
4.4.3.1. Xenopus laevis Oosit İfade Sistemi İmmunblot Analiz Sonuçlarının Değerlendirilmesi 91
4.4.4. Su Geçirgenlik Testine İlişkin Sonuçlar 91
4.4.4.1. Su Geçirgenlik Testine İlişkin Sonuçların Değerlendirilmesi 94
KAYNAKLAR 100
ÖZGEÇMİŞ 112ÖZET
DİABETES İNSİPİDUS’LU HASTALARIN AQP2 GENİNDE TANIMLANAN MUTASYONLARIN FONKSİYONEL ANALİZLERİ
Tuğçe KARADUMAN
Doktora, Biyoloji Anabilim Dalı
Tez Danışmanı: Prof. Dr. Hatice MERGEN
Haziran 2018, 111 sayfa
Vücutta su homeostazı, su alımı ve kaybının dengede olması ile sağlanır. Diabetes insipidus (DI) hastalarında yapımı ve etkisi azalmış olan arjinin vazopressin, (AVP, ADH, antidiüretik hormon) beynin hipotalamus bölgesinde sentezlenen ve hipofiz bezinin arka bölümünde depolanarak uyarılma durumunda salgılanan bir hormondur. Bu hormon, böbrek toplama kanalındaki suyun geri emilimini artırarak, hayati fonksiyona sahip olan bir düzenleme gerçekleştirmektedir. AVP hormonu salgılandıktan sonra, böbrek nefronlarının polarize epitel hücrelerinin bazolateral membranında lokalize bir transmembran protein olan arjinin vazopressin reseptör 2’ye (AVPR2) bağlanır. AVPR2, bir G protein bağlı reseptördür (GPCR). Bu şekilde G proteini aktive olur ve adenilat siklazı aktive eder. Sonuçta, oluşan cAMP, protein kinaz A’yı stimüle eder. Protein kinaz A, hücre içerisinde bulunan aquaporin su kanalı (AQP2) proteinlerini fosforilleyerek onların tetramerler halinde apikal membrana yerleşimlerini sağlar. Bu kanallar vasıtasıyla suyun idrardan böbrek hücrelerine geçişi sağlanır. Su geri emilimi uyarısı sona erdiğinde, AQP2 endositoz ile membrandan uzaklaştırılır. Bu kontrol sistemi içerisinde oluşabilecek herhangi bir patoloji vücudun su homeostazının bozulmasına ve DI gelişimine neden olur.
AQP2, böbrek ana toplayıcı kanal hücrelerinde, suyun geri emiliminden sorumlu olan homotetramerik bir su kanalıdır. AQP2 genindeki mutasyonlar, fazla hacimde idrar üretilmesine neden olarak, vücut su homeostazının sağlanma sürecinde patojenik bir durum olan nefrojenik DI’yi (NDI) indüklemektedir. Bu mutasyonların NDI patogenezindeki rolü için literatürde yer alan klinik ve deneysel gözlemlerle kanıtlanmış çeşitli hipotezler vardır. AQP2 gen mutasyonlarının genelde mutant proteinin yanlış katlanmasına ya da bu proteinin yanlış hedeflenmesine yol açtığı tespit edilmiş olmakla birlikte; işlevsel olmayan su kanallarının, doğru membran hedeflemesi gösterdiği de bildirilmiştir.
Bu çalışmanın amacı, NDI tanısı konmuş hastaların AQP2 geninde grubumuz tarafından tanımlanmış olan A45T, R85X ve A147T mutasyonlarının fonksiyon analizlerini gerçekleştirmektir.
Bu amaç kapsamında yapılan deneysel çalışmalarda; yabanıl tip kodlayıcı AQP2 dizisi taşıyan ifade vektörü temin edilmiş, site-directed mutagenez yöntemi kullanılarak mutant AQP2 gen dizilerini içeren uygun ifade vektörleri hazırlanmıştır. Bu süreci takiben, yabanıl tip ve mutant vektörlerin MDCK hücrelerine stabil transfeksiyonu gerçekleştirilmiştir. Vektörlerin MDCK hücrelerinde ifadesi sağlanarak, mutant proteinlerin hücre içi olgunlaşma sürecinin karakterizasyonun araştırılması için deglikozilasyon deneyleri gerçekleştirilmiştir. Ayrıca proteinlerin yarı-ömürlerinin belirlenmesi amacıyla, siklohekzimid analizi yapılmış ve hem deglikozilasyon deneyleri hem de siklohekzimid deneylerine ait sonuçlar immünblot analizi ile değerlendirilmiştir. Mutant AQP2 proteinlerinin hücre içi trafiğinin belirlenmesi için immünsitokimyasal analizler gerçekleştirilmiştir.
AQP2 gen mutasyonlarının Xenopus laevis oosit ifade sisteminde gerçekleştirilecek fonksiyon analiz çalışmaları kapsamında ise, yabanıl tip ve mutasyonu bulunduran oosit ifade vektörlerinden elde edilen cRNA’ların oosit hücrelerine injeksiyonu gerçekleştirilerek, AQP2 proteininin oositlerde ifade düzeylerini tespit edebilmek için total membran ve plazma membranları izole edilmiş, yabanıl tip protein ile mutant proteinlerin membranlardaki oranları immünblot analizi ile karşılaştırılmıştır. Mutant AQP2 proteinlerinin su alım mekanizması üzerine etkilerinin belirlenmesi için oosit hücrelerine su geçirgenliği testi uygulanmıştır.
Sonuç olarak tez kapsamında, çalışılan tüm mutant proteinlerin MDCK hücreleri ve Xenopus laevis oosit ifade sisteminde yabanıl tipe göre farklı oranlarda fonksiyon değişikliği gösterdiği belirlenmiştir.
Anahtar kelimeler: Diabetes insipidus, AQP2, Fonksiyonel anali
Functıonal Analyses of Mutatıons Found in Avp-Npıı Gene of Patıents Dıagnosed Wıth Dıabetes Insıpıdus
No full textIn healthy individuals, blood osmolality is kept within certain limits through mechanisms that regulate body water balance. Thirst is stimulated by sending signals to the kidneys for water protection with an increase in plasma osmolality or a decrease in blood volume. As a result of this stimulation, the arginine vasopressin hormone (AVP, ADH, antidiuretic hormone) which is stored in the posterior pituitary, is released into the blood. The AVP hormone reaches to the kidneys through the bloodstream and binds to arginine vasopressin receptor 2 (AVPR2) in the collection duct cells. The binding of AVP to the AVPR2 leads to the aquaporin 2 water channel proteins (AQP2) to be phosphorylated and settle in the apical membrane. The reabsorption of the required water takes place through the AQP2 water channel, thus the water balance in the body is reestablished. Any malfunction that may occur within this mechanism causes disruption of the body's water balance and the development of Diabetes insipidus (DI) disease, which is characterized by polyuria and polydipsia.
DI can be either central type (CDI) due to inadequate synthesis and/or release of AVP hormone or nephrogenic type (NDI) due to inadequate response of the kidney to AVP. CDI can be either acquired by damage to the neurohypophysis region as a result of head injuries, brain tumors, surgical operations or various diseases or can be congenital due to mutations in the vasopressin-neurophysin II (AVP-NPII) gene. In many studies concerning AVP-NPII, it has been found that the precursor hormone fails during proper folding and processing due to mutations in the AVP-NPII gene. As a consequence, the mutant protein accumulates in the endoplasmic reticulum (ER), generates protein aggregations and leads to the death of magnocellular nerve cells by preventing the regular processing of other essential proteins.
The aim of this thesis is to perform functional analyzes of G45C, 207_209delGGC and G88V mutations defined in the AVP-NPII gene of patients diagnosed with DI, which are not included in the literature. In the experimental studies, the relevant mutations on the expression vector containing the wild-type AVP-NPII gene were created using the site-directed mutagenesis method and transient transfection of these vectors to Neuro2A cells was performed. The amount of wild type and mutant AVP that were released into the medium by Neuro2A cells were determined by two separate methods, namely radioimmunoassay (RIA) and Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA). Fluorescence imaging studies were performed to determine the differences in the intracellular traffic of wild-type and mutant precursor hormones. In addition, since the RIA method used in determining the amount of AVP is a difficult and long-lasting method, the usability of the ELISA method, which provides faster results and is easy to perform as an alternative method for RIA, was evaluated by the Bland-Altman method, which is a statistical analysis.
As a result of the study, it was determined that G45C and G88V mutant proteins were significantly reduced in the cell culture medium compared to wild type AVP-NPII protein and were trapped in the ER in the cell. However, it was observed that the amount of 207_209delGGC mutant protein is similar to the wild type protein in the cell culture medium and was distributed in intracellular compartments by not being trapped in ER, likewise the wild type. It has been concluded that G45C and G88V mutations have significant effects in processes such as the proper folding, gain of three-dimensional structure, processing, or intracellular traffic of the precursor hormone, and the 207_209delGGC mutation does not have any significant effect in these processes. In addition, it was determined that ELISA method can be used as an alternative method instead of RIA method in determining the amount of AVP.Sağlıklı bireylerde kan ozmolalitesi, vücut su dengesini ayarlayan mekanizmalar aracılığıyla belirli sınırlar içerisinde tutulmaktadır. Plazma ozmolalitesindeki artış veya kan hacmindeki azalma ile böbreklere suyu koruması için sinyal gönderilerek susuzluk uyarılmaktadır. Bu uyarılma sonucu, arka hipofizde depolanmakta olan arjinin vazopressin hormonu (AVP, ADH, antidiüretik hormon) kana salınmaktadır. AVP hormonu, kan dolaşımı yoluyla böbreklere gelerek toplama kanalı hücrelerindeki arjinin vazopressin reseptör 2 (AVPR2)’ye bağlanmaktadır. AVP’nin AVPR2’ye bağlanması, hücre içerisinde bulunan akuaporin 2 su kanal proteinlerinin (AQP2) fosforillenerek apikal membrana yerleşmelerini sağlamaktadır. AQP2 su kanalı aracılığıyla ihtiyaç duyulan suyun geri emilimi gerçekleşmekte ve böylece vücuttaki su dengesi tekrar kurulmaktadır. Bu mekanizma içerisinde oluşabilecek herhangi bir aksaklık vücudun su dengesinin bozulmasına ve poliüri, polidipsi ile karakterize olan Diabetes insipidus (DI) hastalığının gelişimine neden olmaktadır.
DI, AVP hormonun yetersiz sentezi ve/veya salınımına bağlı olarak santral tip (CDI) veya böbreklerde AVP’ye karşı yetersiz cevap oluşmasına bağlı olarak nefrojenik tipte (NDI) olabilmektedir. CDI, kafa travmaları, beyin tümörleri, cerrahi operasyonlar veya çeşitli hastalıklar sonucu nörohipofiz bölgesinin hasarı nedeniyle sonradan meydana gelebileceği gibi, arjinin vazopressin-nörofizin II (AVP-NPII) geninde bulunan mutasyonlar nedeniyle kalıtsal olarak da oluşabilmektedir. AVP-NPII geni ile ilgili yapılan çalışmalarda, gendeki mutasyonlar nedeniyle öncül hormonun düzgün bir şekilde katlanması ve işlenmesinde başarısızlık olduğu bulunmuştur. Bunun sonucunda mutant proteinin endoplazmik retikulum (ER) içerisinde birikerek protein agregasyonları oluşturduğu ve diğer esansiyel proteinlerin düzenli işlenmesini engelleyerek magnoselüler sinir hücrelerinin ölümüne yol açtığı tespit edilmiştir.
Bu tez çalışmasının amacı, DI tanısı konmuş hastaların AVP-NPII geninde tanımlanmış G45C, 207_209delGGC ve G88V mutasyonlarına ilişkin literatürde yer almayan fonksiyonel analizlerinin gerçekleştirilmesidir. Bu amaçla yapılan deneysel çalışmalarda, yabanıl tip AVP-NPII geni içeren ifade vektörü üzerinde ilgili mutasyonlar bölgeye yönelik mutagenez yöntemi kullanılarak oluşturulmuş ve vektörlerin Neuro2A hücrelerine geçici transfeksiyonu gerçekleştirilmiştir. Neuro2A hücreleri tarafından besiyerine salınan yabanıl tip ve mutant AVP miktarları radyoimmün analiz (RIA) ve enzim-bağlı immünosorbent analiz (ELISA) yöntemleri olmak üzere iki ayrı yöntem ile belirlenmiştir. Yabanıl tip ve mutant öncül hormonların hücre içi trafiklerindeki farklılıkları belirleyebilmek için floresan görüntüleme çalışmaları gerçekleştirilmiştir. Ayrıca, AVP miktarının belirlenmesinde kullanılan RIA yönteminin gerçekleştirilmesi zor ve uzun süren bir yöntem olmasından dolayı, yerine alternatif bir yöntem olarak daha hızlı sonuç veren ve gerçekleştirilmesi kolay olan ELISA yönteminin kullanılabilirliği istatiksel bir analiz olan Bland-Altman yöntemi ile değerlendirilmiştir.
Çalışmanın sonucunda G45C ve G88V mutant proteinlerin yabanıl tip AVP-NPII proteinine göre hücre kültürü ortamında önemli ölçüde azalmış miktarda bulunduğu ve hücrede ER içerisinde takılı kaldığı belirlenmiştir. Bununla birlikte, 207_209delGGC mutant proteinin ise, hücre kültürü ortamında yabanıl tip proteine yakın miktarda bulunduğu ve yabanıl tip ile benzer şekilde ER’de takılı kalmayarak hücre içi kompartmanlara dağıldığı gözlenmiştir. G45C ve G88V mutasyonlarının öncül hormonun düzgün katlanması, üç boyutlu yapısını kazanması, işlenmesi veya hücre içi trafiği gibi süreçlerde önemli etkilere sahip olduğu, 207_209delGGC mutasyonunun ise bu süreçlerde herhangi bir önemli etkiye sahip olmadığı sonucuna varılmıştır. Ayrıca AVP miktarının belirlenmesinde, ELISA yönteminin RIA yöntemi yerine alternatif bir yöntem olarak kullanılabilceği belirlenmiştir
Investıgatıon of Half-Lıfe and Glycosylatıon Propertıes of Mutant Avpr2 Proteıns Under in Vıtro Condıtıons
No full textDiabetes insipidus (DI) is a disease characterized by excessive urine formation (polyuria) and excessive thirst (polydipsia). DI is classified into gestational DI, primary polydipsia, Nephrogenic DI (NDI), and Central DI (CDI), according to their causes. Hereditary NDI is caused by mutations in the AVPR2 gene on the X chromosome (Xq28) with a rate of 90%. A mutation in the 371 amino acid-encoded DNA of the AVPR2 protein causes the emergence of this disease, which can be observed in different symptoms. Because of these mutations, the AVPR2 protein is misfolded and directed to degradation. This changes the half-life of the protein.
The half-life of the intracellular proteome varies from a few minutes to several months. The reason for this change is that the protein degradation rate varies depending on the cellular response given in cell cycles and various environmental/physiological conditions. The increase or decrease in the rate of degradation caused by the mutation is related to the glycosylation modifications the protein undergoes.
The purpose of this thesis is to reveal the half-life times and glycosylation modifications of the G12E, H80Y, V88M, V88L, R106C, V215M, and L219P mutations occurring in the AVPR2 gene which were previously defined by our group. In the experimental studies carried out in this context, expression vectors containing the related mutant AVPR2 gene sequences were prepared by using site-directed mutagenesis method with the expression vector carrying the wild-type coding AVPR2 sequence. Deglycosylation experiments were carried out to investigate the characterization of the intracellular maturation process of mutant proteins expressed in COS-7 cells. In addition, in order to determine the half-lives of proteins, cycloheximide analysis was performed and the results of both deglycosylation experiments and cycloheximide experiments were evaluated by immunoblot analysis. Thus, the relationship between the degradation state of mutant proteins and the glycosylation modifications they undergo was revealed.
As a result, it is seen that each mutant is trapped in the ER at different levels. It is thought that the half-life times are not directly related to the functionality of the protein and the signal response it generates, and have meaning when evaluated together with glycosylation modifications. Comparisons between mutants and wild type for half-life values were statistically significant for each mutant. According to the results obtained, L219P mutant protein has the lowest half-life value and when evaluated with the deglycosylation results, it was seen that most of it were trapped in the ER. It has been observed that the half-life value of the R106C mutant increases and it has been suggested that this may be related to the inhibition of degradation mechanisms. Although the H80Y mutant protein has the longest half-life, when evaluated by deglycosylation analysis, it was observed that most of it remained stuck in the ER. The fact that the half-life length is close to the wild type has been associated with the resistance of the mutant protein to exit from the ER and degradation. These mutations, which occur at different points of the AVPR2 protein and with different amino acid changes, have different mechanisms of action, and this may help explain the symptoms of hereditary NDI that vary between patients.Diabetes insipidus (DI), aşırı miktarda idrar oluşumu (poliüri) ve aşırı miktarda susama (polidipsi) ile karakterize olmuş bir hastalıktır. Sebeplerine göre Gestasyonel DI, primer polidipsi, Nefrojenik DI (NDI) ve Santral DI (CDI) olmak üzere sınıflara ayrılır. NDI hastalığı kazanılmış veya kalıtsal olabilir. Kalıtsal NDI, %90 oranla X kromozomu (Xq28) üzerinde bulunun AVPR2 genindeki mutasyonlardan kaynaklıdır. AVPR2 proteinin 371 amino asitlik kodlanan DNA’sında gerçekleşen bir mutasyon, farklı semptomlarla gözlemlenebilen bu hastalığın ortaya çıkmasına neden olur. Ortaya çıkan bu mutasyonlar nedeniyle, AVPR2 proteini yanlış katlanır ve degradasyona yönlendirilir. Bu durum, proteinin yarı ömrünü değiştirmektedir.
Hücre içi proteomun yarı ömrü, birkaç dakika ile birkaç ay arasında değişiklik gösterir. Bu değişikliğin sebebi ise hücre döngülerinde ve çeşitli çevresel/fizyolojik durumlarda verilen hücresel cevaba bağlı olarak protein degradasyon oranının farklılık göstermesinden kaynaklanmaktadır. Mutasyon sebebiyle gerçekleşen degradasyon hızının artışı veya azalışı ise proteinin geçirdiği glikozilasyon modifikasyonlarıyla bağlantılıdır.
AVPR2 geninde meydana gelen, grubumuz tarafından tanımlanan G12E, H80Y, V88M, V88L, R106C, V215M ve L219P mutasyonlarına ait yarı ömür zamanlarını ve glikozilasyon modifikasyonlarını ortaya koymak, yapılan bu tezin amacıdır. Bu kapsamda yapılan deneysel çalışmalarda, yabanıl tip kodlayıcı AVPR2 dizisi taşıyan ifade vektörü kullanılarak, site-directed mutagenez yöntemi ile ilgili mutant AVPR2 gen dizilerini içeren ifade vektörleri hazırlanmıştır. COS-7 hücrelerinde ifade olması sağlanan mutant proteinlerin hücre içi olgunlaşma sürecinin karakterizasyonun araştırılması için deglikozilasyon deneyleri gerçekleştirilmiştir. Ayrıca proteinlerin yarı ömürlerinin belirlenmesi amacıyla, siklohekzimid analizi yapılmış ve hem deglikozilasyon deneyleri hem de siklohekzimid deneylerine ait sonuçlar immünblot analizi ile değerlendirilmiştir. Böylece mutant proteinlerin degradasyon durumları ve geçirdiği glikozilasyon modifikasyonları arasındaki ilişki ortaya koyulmuştur.
Sonuç olarak her mutantın, ER’de farklı düzeylerde takılı kaldığı görülmektedir. Yarı ömür zamanlarının, direkt olarak proteinin işlevselliği ve oluşturduğu sinyal cevabı ile ilişkili olmadığı ve glikozilasyon modifikasyonlarıyla birlikte değerlendirildiğinde bir anlam taşıdığı düşünülmektedir. Yarı ömür değerleri için mutantlar ile yabanıl tip karşılaştırmaları, her mutant için istatistiksel olarak anlamlı bulunmuştur. Elde edilen sonuçlara göre L219P en düşük yarı ömür değerine sahiptir ve deglikozilasyon sonuçları ile değerlendirildiğinde büyük bir kısmının ER’de takılı kaldığı görülmüştür. R106C mutantına ait yarı ömür değerinin arttığı ve bu durumun degradasyon mekanizmalarının inhibisyonu ile ilişkili olabileceği önerilmiştir. H80Y mutant proteinin ise en uzun yarı ömür uzunluğuna sahip olmasına rağmen, deglikozilasyon analizi ile değerlendirildiğinde büyük bir kısmının ER’de takılı kaldığı gözlemlenmiştir. Yarı ömür uzunluğunun yabanıl tipe yakınlık göstermesi ise mutant proteinin ER’den çıkışa ve degradasyona direnç göstermesiyle ilişkilendirilmiştir. AVPR2 proteininin farklı noktalarında ve farklı amino asit değişimleriyle meydana gelen bu mutasyonlar, farklı etki mekanizmalarına sahip olup bu durum, kalıtsal NDI’nın, hastalar arasında değişim gösteren semptomlarını açıklamaya yardımcı olabilecektir
V2 Reseptör Fonksiyonu Üzerine H80Y, V88L, V215M ve L219P Mutasyonlarının Etkilerinin Araştırılması
No full textDiabetes insipidus (DI) is a rare disease that is characterized by significantly high urine
production (polyuria) and excessive water consumption (polydypsia). This disease
generally prevents concentration mechanism of urine. Dehydration tests are applied for
confirming the diagnosis of DI. The purpose of dehydration test is to observe the patient’s
ability to concentrate urine and to evaluate the patient’s reaction to arginine vasopressin
(vasopressin, antidiuretic hormone, ADH, AVP). In case of late diagnosis, DI can result
in serious hypernatremia and dehydration. DI is treated with desmopressin (DDAVP).
Variations of DI can occur either as a hereditary or an acquired disease. Mutations of
arginine vasopressin receptor 2 (V2 receptor, V2R, AVPR2) and its coding genes as well
as mutations of aquaporin 2 channels (AQP2) and its coding genes cause congenital
(hereditary) type Nephrogenic Diabetes Insipidus (NDI). In cases of congenital NDI, urine cannot be concentrated despite normal secreted and synthesized AVP levels or high
plasma concentrations. Mutations on V2R gene that cause congenital NDI, can also result
in the creation of different phenotypes of receptors. The course and the severity of disease
can vary due to incompatible receptor functions caused by different phenotypes of
receptors.
The aim of this thesis is to examine the relation between H80Y, V88L, V215M and L219P
mutations identified in V2R gene, which is known to cause congenital NDI, and V2
receptor functions. The purposes of this examination are to better illuminate the course
of disease and to provide information for further research on the treatment.
In accordance with the purpose of this study following procedure is conducted as an
experimental research. Relevant mutations mentioned above were produced utilizing sitedirected mutagenesis method to mammalian expression vectors containing wild type V2R
gene. These mammalian expression vectors were transfected to COS-7 cells. Intracellular
and cell surface expressions of both wild and mutant types of V2 receptors were
determined with the application of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
experiments. Levels of cyclic adenosine monophosphate (cyclic AMP, cAMP)
synthesized as a response to stimulation of transfected cells with AVP were scanned to
observe mutant V2 receptor activity. Positioning of mutant V2 receptors in the cell, and
their locations in the endoplasmic reticulum (ER) were observed with the fluorescent
imaging method.
As a result, all mutant type V2 receptors studied within the scope of this thesis are
observed to demonstrate varying degrees of function loss compared to wild type V2
receptors.Diabetes insipidus (DI), aşırı miktarda idrar oluşumu (poliüri) ve çok fazla miktarda su
içme (polidipsi) ile karakterize edilen nadir bir hastalıktır. Bu hastalık nedeniyle idrar
konsantre edilemez. Susuzluk testi, DI tanısını doğrulamak için kullanılır. Testin amacı,
hastanın idrarı konsantre etme yeteneğini gözlemlemek ve arjinin vazopressine
(vazopressin, antidiüretik hormon, ADH, AVP) olan cevabını değerlendirmektir. Tanı
gecikirse ciddi hipernatremi ve dehidratasyon gibi belirtiler ortaya çıkabilir. Tedavide
desmopressin (DDAVP) kullanılır.
Kalıtsal veya edinilmiş nedenlerle çeşitli tiplerde DI hastalığı oluşmaktadır. Arjinin
vazopressin reseptör 2 (V2 reseptörü, V2R, AVPR2) ve onu kodlayan genlerde oluşan
mutasyonlar ile aquaporin 2 su kanalları (AQP2) ve onu kodlayan genlerde oluşan
mutasyonlar; konjenital (ailesel, kalıtsal) tipteki Nefrojenik Diabetes İnsipidus’a (NDI) neden olmaktadır. Konjenital NDI’da normal şekilde salgılanan ve sentezlenen AVP
varlığına veya yüksek plazma konsantrasyonlarına rağmen idrar konsantre edilemez.
Konjenital NDI’a neden olan V2R genindeki mutasyonlar farklı fenotipte reseptör
oluşumuna neden olabilir. Bu farklı fenotipteki reseptörler, farklı reseptör fonksiyonları
meydana getirirler ve bunun sonucunda hastalığın seyri ve şiddeti değişiklik gösterebilir.
Bu tez çalışmasının amacı, konjenital NDI hastalığına neden olduğu bilinen ve V2R
geninde tanımlanan H80Y, V88L, V215M ve L219P mutasyonlarının, V2 reseptör
fonksiyonu üzerine etkilerinin araştırılmasıdır. Bu araştırmalar sayesinde, hastalığın
seyrinin aydınlatılması ve gelecekteki tedavi çalışmalarında kullanılması için bilgiler
sunulması hedeflenmiştir.
Bu amaç ve hedefler doğrultusunda yapılan deneysel çalışmalarda, ilgili mutasyonlar
yabanıl tip V2R geni içeren memeli ifade vektörleri kullanılarak site-directed mutagenez
yöntemi ile oluşturulmuştur ve COS-7 hücrelerine transfeksiyonları gerçekleştirilmiştir.
Yabanıl tip ve mutant V2 reseptörlerinin hücre içi ve hücre yüzeyindeki ifadeleri, enzimbağlı immünosorbent analiz (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) deneyleri ile
tespit edilmiştir. Mutant V2 reseptör aktivitesi ise transfekte hücrelerin AVP ile
uyarılması sonucunda cevap olarak sentezlenen siklik adenozin monofosfat (siklik AMP,
cAMP) düzeylerine bakılarak değerlendirilmiştir. Ayrıca mutant V2 reseptörlerinin hücre
içindeki yerleşimleri ve endoplazmik retikulumda (ER) takılı kalma durumları floresan
görüntüleme yöntemi ile araştırılmıştır.
Sonuç olarak, tez kapsamında çalışılan tüm mutant tip V2 reseptörlerinin yabanıl tipe
göre farklı düzeylerde fonksiyon kaybına uğradıkları gözlemlenmiştir
Bazı Farmakolojik Şaperonların Mutant AVPR2 Proteinlerinde Gözlemlenen Fonksiyon Kayıpları Üzerine Etkilerinin Araştırılması
No full textFaults in protein folding cause production of abnormal or immature proteins. Misfolded proteins accumulate in aggregates and have toxic effect in endoplasmic reticulum. This process results in conformational diseases caused by mutations in related genes which disrupt protein homeostasis. Various research groups proved that small cell-permeable molecules, called pharmacological chaperones, have therapeutic effects on conformational diseases. These small compounds stabilize misfolded proteins, allowing them to fold in their natural form, thus create a structure which helps them regain their three-dimensional molecular forms and their functions.
Mutations in AVPR2 and related genes cause NDI which is the X-linked; a conformational disease. Mutations in AVPR2 gene - that cause NDI - can cause formation of receptors in different phenotypes. However, in vitro AVPR2 expression studies show that these intracellular receptors, which are misfolded as a result of the mutation and caught in quality control system of endoplasmic reticulum, can fulfill their functions when they reach the apical membrane.
Purpose of this study is to investigate R68W, R67_G69/G107W (Compound heterozygote) and T273M mutant AVPR2 proteins which causes NDI disease and loss of functions, through pharmacological chaperone application; and observe if they are released from quality control mechanism and reach the apical membrane where they fulfill their functions.
In experimental studies conducted for this purpose, plasmids used in previous studies, containing wild-type and mutant AVPR2 gene sequences, were transferred into COS-7 cells by transient transfection method. Three different pharmacological chaperones, non-peptide antagonists OPC41061 (Tolvaptan), OPC31260 (Mozavaptan) and OPC21268 were applied to transfected mutant and wild-type COS-7 cells. Cell surface ELISA and total ELISA methods were applied to determine intracellular and cell surface expression of mutant and wild-type AVPR2. Pharmacological chaperone effect was observed by comparing the results of function loss performed in previous studies to ELISA results after pharmacological chaperone application. Additionally, in order to determine the location of mutant and wild-type AVPR2s in the cells after pharmacological chaperone application, imaging studies in florescence microscope were performed after ER-tracker and Golgi apparatus-tracer dyeing method.
All experimental studies proved, pharmacological chaperones of OPC41061, OPC31260 and OPC21268 were successful on R68W, R67_G69/G107W (Compound heterozygote) and T273M mutant AVPR2 proteins. Observations showed that ratio of mutant proteins reaching cell surface and their intracellular quantities are higher compared to control group mutant proteins.
Keywords: Pharmacological Chaperones, Quality Control Systems, Nephrogenic Diabetes Insipidus, AVPR2 MutationsETİK i
ÖZET i
ABSTRACT iv
TEŞEKKÜR vii
İÇİNDEKİLER viii
ÇİZELGELER xi
ŞEKİLLER xii
SİMGELER VE KISALTMALAR xiii
1.GİRİŞ 1
2.GENEL BİLGİ 2
2.1. Farmakolojik Şaperonlar 2
2.2. Farmakolojik Şaperonların Etki Konsantrasyonları 5
2.3. Farmakolojik Şaperonların Yapısal Mekanizması 5
2.3.1. Rekabetçi Antagonistler/İnhibitörler 6
2.3.2. Agonistler, Ters Agonistler, Kısmi Agonistler ve Allosterik Ligandlar 8
2.4. Farmakolojik Şaperonların Hedef Proteinler Üzerindeki Etkisi 15
2.4.1. Moleküler Yapıların Farmakolojik Şaperonlar ile Stabilizasyonu 15
2.5. Farmakolojik Şaperonlar ve Proteostaz Düzenleyicilerin Hedef Proteinler Üzerindeki İşbirliği 18
2.6. Endoplazmik Retikulum Kalite Kontrol Sistemi 21
2.6.1. Birincil Kalite Kontrol; ER-İlişkili Katlanma 22
2.6.2. İkincil Kalite Kontrol; Taşıma Yolağı 24
2.6.3. Üçüncül Kalite Kontrol; Hedef Bölgeye Ulaşma 25
2.7. NDI Hastalığına Neden Olan ve Endoplazmik Retikulum Kalite Kontrol Sistemine Takılı Kalan AVPR2 Mutantları 26
2.7.1. Transmembran Domeyn Mutasyonları 26
2.7.2. Sistein Mutasyonları 27
2.6.2.3. Hücre İçi Halka ve C-Ucu Mutasyonları 28
3.MATERYAL VE YÖNTEM 32
3.1. Mutant ve Yabanıl Tip AVPR2 Dizilerini İçeren Memeli İfade Vektörlerinin E.coli (DH5) Hücrelerine Transforme Edilmesi 33
3.2. Mutant ve Yabanıl Tip AVPR2 Dizilerini İçeren Memeli İfade Vektörlerinin Çoğaltılması 34
3.3. COS-7 Hücrelerinin Üretilmesi ve Hazırlanması 35
3.4. Yabanıl ve Mutant DNA Dizilerini İçeren Memeli İfade Vektörlerinin COS-7 Hücresine Transfeksiyonu 37
3.5. AVPR2 Mutantlarına, Farmakolojik Şaperon Uygulaması için Konsantrasyon Belirlenmesi; MTT Testi 38
3.6. Farmakolojik Şaperon Uygulaması Yapılmış Yabanıl Tip ve Mutant AVPR2’lerin Hücre İçi ve Hücre Yüzeyindeki İfadelerinin Belirlenmesi 40
3.6.1. Hücre Yüzey ELISA Yöntemi İçin COS-7 Hücrelerinin Çoğaltılması ve Transfeksiyonu 41
3.6.2. Hücre Yüzey ELISA Yöntemi İçin Farmakolojik Şaperon Uygulaması 41
3.6.3. Yüzey ELISA Yöntemi 42
3.6.4. Total ELISA Yöntemi İçin COS-7 Hücrelerinin Çoğaltılması ve Transfeksiyonu 43
3.6.5. Total ELISA Yöntemi İçin Farmakolojik Şaperon Uygulaması 44
3.6.6. Total ELISA Yöntemi 44
3.7. Floresan Görüntüleme Çalışmaları 46
3.7.1. Floresan Görüntüleme Çalışmaları İçin COS-7 Hücrelerinin Çoğaltılması ve Transfeksiyonu 46
3.7.2. Floresan Görüntüleme İçin Farmakolojik Şaperon Uygulaması 47
3.7.3. Floresan Görüntüleme Yöntemi 47
3.7.3.1. Hücrelerin ER-İzleyici ile Boyanması 47
3.7.3.2. COS-7 Hücrelerinin Golgi Aygıtı-İzleyici ile Boyama 48
3.8. Farmakolojik Şaperonların Etkilerinin Tespiti İçin Yapılan Tekrarlı Ölçümler Varyans Analizi (Tekrarlı Ölçümler ANOVA) 49
3.9. İstatistiksel Testler 49
4. SONUÇLAR VE TARTIŞMA 50
4.1. R68W Mutasyonu Sonuçları 71
4.2. ΔR67_G69/G107W, ΔR67_G69 ve G107W Mutasyonu Sonuçları 73
4.3. T273M Mutasyonu Sonuçları 75
5. KAYNAKLAR 78
ÖZGEÇMİŞ 93Protein katlanmasındaki hatalar, anormal ya da olgunlaşmamış proteinlerin meydana gelmesine neden olmaktadır. Yanlış katlanmış proteinler agregatlar halinde birikmekte ve endoplazmik retikulumda toksik etki yaratmaktadırlar. Bu süreç, ilgili genlerdeki mutasyonların neden olduğu ve protein homeostatisini bozan konformasyonel hastalıklara neden olmaktadır. Çeşitli araştırma grupları, farmakolojik şaperon olarak adlandırılan küçük hücre-geçirgen moleküllerin, konformasyonel hastalıklar üzerinde terapatik etkiye sahip olduklarını göstermişlerdir. Bu küçük bileşikler, yanlış katlanmış proteinleri stabilize ederek doğal bir şekilde kendilerine özgü katlanmalarına izin vermektedir. Dolayısıyla işlevlerini geri kazanabilecekleri moleküler üç boyutlu formlarını kazanmalarına yardımcı bir iskelet oluşturmaktadırlar.
Arjinin Vazopressin Reseptör 2 (AVPR2) ve onu kodlayan genlerde oluşan mutasyonlar; nadir bir hastalık olan X’e bağlı Nefrojenik Diabetes İnsipidus’a (NDI) neden olmaktadır. NDI’a neden olan AVPR2 genindeki mutasyonlar farklı fenotipte reseptör oluşumuna neden olabilirler. Ancak in vitro AVPR2 çalışmalarında, oluşan mutasyon sonucu yanlış katlanan ve endoplazmik retikulum kalite kontrol sistemine takılı kalan bu hücre içi reseptörlerin, apikal membrana ulaştıklarında fonksiyonel işlevlerini yerine getirebildikleri gösterilmiştir.
Bu çalışmanın amacı; NDI hastalığına neden olan ve fonksiyon kaybına neden olduğu tespit edilen R68W, R67_G69/G107W (Compound hemizigot) ve T273M mutant AVPR2 proteinlerinin farmakolojik şaperon uygulamasıyla, kalite kontrol sisteminden kurtarılıp görev gördükleri apikal membrana ulaşma durumlarının araştırılmasıdır.
Bu amaçla yapılan deneysel çalışmalarda, yabanıl tip ve mutant AVPR2 gen dizilerini içeren plazmidler COS-7 hücrelerine geçici transfeksiyon yöntemi ile aktarılmıştır. Transfekte mutant ve yabanıl tip COS-7 hücrelerine üç farklı farmakolojik şaperon, peptid olmayan antagonist OPC41061 (Tolvaptan), OPC31260 (Mozavaptan) ve OPC21268 uygulaması yapılmıştır. Mutant ve yabanıl tip AVPR2’lerin hücre içi ve hücre yüzeyi miktarlarının belirlenmesi için, hücre yüzey ELISA ve total ELISA yöntemi uygulanmıştır. Önceki çalışmalar kapsamında gerçekleştirilen mutant proteinlerin normal şartlar altında elde edilen sonuçları ile farmakolojik şaperon uygulama sonrasındaki ELISA sonuçları karşılaştırılarak, farmakolojik şaperon etkisi gözlemlenmiştir. Ayrıca farmakolojik şaperon uygulama sonrası mutant ve yabanıl tip AVPR2’lerin hücre içerisindeki yerleşimlerini tespit etmek amacıyla Endoplazmik Retikulum (ER)-izleyici ve Golgi aygıtı-izleyici boyama yöntemi sonrası floresans mikroskobunda görüntüleme çalışmaları gerçekleştirilmiştir.
Yapılan tüm deneysel çalışmalar sonucu, OPC41061, OPC31260 ve OPC21268 farmakolojik şaperonlarının, R68W, R67_G69/G107W (Compound hemizigot) ve T273M mutant AVPR2 proteinlerin üzerinde başarılı olduğu tespit edilmiştir. Mutant proteinlerin, kontrol grubu mutant proteinlerine oranla hücre yüzeyine ulaşmalarında ve toplam hücre içi miktarlarında artış gözlemlenmiştir.
Anahtar kelimeler: Farmakolojik Şaperonlar, Kalite Kontrol Sistemleri, Nefrojenik Diabetes Insipidus, AVPR2 mutasyonlar
Dictyostelium Discoideum’da Spontan Mutasyonların Hızı, Moleküler Spektrumu ve Sonuçları
No full textIn this study, the method performed with a model organism Dictyostelium discoideum. The study aims to examine whether the results are in accordance with the Drake’s rule and genetic drift barrier hypothesis and to analyze and discuss the genetic mechanisms that cause mutations. For this purpose, the genomes of thirteen randomly chosen MA lines have been sequenced by using next generation sequencing method. The mutation rate for nuclear DNA yielded 0.89x10-11 per site per generation. The estimated mutation rate is the lowest for any eukaryotes. According to the results, the estimated mutation rate is in accordance with the genetic drift hypothesis. In conclusion, it can be argued that low mutation rate is an adaptation to maintain genome in extremely mutagenic natural environment and unusual life cycle.Bu tez çalışmasında, mutasyon hızının ve spektrumunun belirlenmesi için bir model organizma olan Dictyostelium discoideum kullanılmıştır. Elde edilen sonuçların Drake kuralı ve genetik sürüklenme bariyeri hipotezlerine uygunluğunun sınanması ve mutasyon oluşumuna neden olan genetik mekanizmalar incelenerek tartışılması hedeflenmiştir. Bu amaçla, rasgele seçilen on üç MA soy hattının genomları yeni nesil DNA dizileme yöntemi kullanılarak, dizilenmiştir. Nükleer DNA için mutasyon hızı 0.89x10-11 mutasyon/bölge/nesil olarak hesaplanmıştır. Hesaplanan mutasyon hızı ökaryotlar için en düşük değerdir. Elde edilen sonuçlara göre, hesaplanan mutasyon hızı genetik sürüklenme bariyeri hipotezine uygundur. Sonuç olarak, D.discoideum’da gözlenen düşük mutasyon hızının aşırı mutajen olan doğal çevrede ve olağandışı hayat döngüsünde genomu koruyacak bir adaptasyon olduğu tartışılabilir
AVPR2 PROTEİNİNİN HOMOLOJİ TEMELLİ ÜÇ BOYUTLU YAPI MODELLEMESİ
No full textProteins are molecules found in all organisms and made up of unique amino acid sequences including many physiological processes directly. The three dimensional structure of a protein can determine the biological importance of that protein and its work within a process. The molecular effect of mutations on the structure and function of proteins is important. Any change in the protein sequence (deletion, insertion or mutation) can affect a specific or a whole area by disrupting the balance of interaction forces within the protein. These changes in the protein structures are assessed using bioinformatics tools today.
Bioinformatics form a multidisciplinary connection including genetics, structural biology and biochemistry. Homology based modeling studies, an area of bioinformatics, predicts the three dimensional structure of proteins. Knowing the physico-chemical features of proteins that are worked on and the three dimensional homology modeling studies of proteins are important in assessing the three dimensional structures of proteins. Knowing the three dimensional structure of a mutant or wild type of a protein plays an important role in protein-protein, protein-ligand and doking studies. In accordance with this information, drug design development studies are designed for the treatment of diseases caused by mutations.
The aim of this study is to assess the mutant AVPR2 proteins (which were previously functionally analyzed by our group) homology models using bioinformatics tools with their physico-chemical features and mutation function analyses, to provide information to be used for future treatment-oriented docking and modelling studies.
For this purpose, wild type AVPR2 and mutant type ΔR67_G69, G107W, ΔR67_G69/G107W, R68W, V162A and T273M models were extracted with Swiss-Prot homology modelling, a bioinformatics tool. Physico-chemical features of wild type and mutant type models are calculated with a programme named ProtParam. Wild type and mutant type models were examined through visualization on the Chimera programme. Generated models were assessed together with physico-chemical calculations and mutation function analyses.
As a result, it was determined that mutation function analyses of all models studied as part of the thesis, physico-chemical calculations and generated models support each other. This study will give information to the future studies about docking and modelling researches for treatment strategies when all in-vitro experiments, homology modelling studies and clinical features of the patients are considered together.İÇİNDEKİLER
Sayfa
ÖZET i
ABSTRACT iii
TEŞEKKÜR v
İÇİNDEKİLER vii
ÇİZELGELER ixx
ŞEKİLLER x
SİMGELER VE KISALTMALAR xiii
1. GİRİŞ 1
1.1. Proteinler ve Proteinlerin Yapısal Özellikleri 2
1.1.2. Proteinlerin Fiziko-Kimyasal Özellikleri 8
1.2.Protein Modelleme Çalışmalarında Biyoinformatik ve Sekans Analizleri 9
1.2.1.1. Sekans Veri Tabanı Araştırmaları 11
1.2.1.2. Çoklu Sekans Eşleştirmeleri 12
1.2.1.3. Filogenetik analiz 12
1.2.1.4. Reziduların Fonksiyonel İlişkileri 12
1.2.1.5. Sekans Motiflerinin Araştırılması 12
1.2.1.6. Sekonder Yapı Tahmini 13
1.2.2. Protein Yapı Çalışmaları 13
1.2.2.1. Protein Yapı Çalışmalarında Kullanılan Veri Bankaları 14
1.2.2.1.1. Yapısal Biyoinformatik için Araştırma Ortaklığı (Research Collaboratory For Structural Bioinformatics, RCSB PDB) 17
1.2.2.1.2. Avrupa Biyoinformatik Enstitüsü (The European Bioinformatics Institute, MSD-EBI) 18
1.2.2.1.3. Protein Veri Bankası Japonya (Protein Data Bank Japan, PDBj) 19
1.2.2.1.4. Proteinlerin Yapısal Sınıflandırması (Structural Classification of Proteins, SCOP) 21
1.2.2.1.5. Sınıf-Yapı-Topoloji-Homolog Süperaileleri (Class-Architecture,-Topology-Homologous Superfamily, CATH) 23
1.2.2.2. Proteinleri 3 Boyutlu Yapılarının Tahmini İçin Kullanılan Yöntemler 24
1.2.2.2.1. Kıvrım Tanıma Yöntemi 25
1.2.2.2.2. Ab initio modelleme 25
1.2.2.2.3. Homoloji Modelleme ve Homoloji Modelleme Basamakları 26
1.2.2.2.3.1. Swiss Model ile Homoloji Modelleme Çalışması 27
1.2.2.2.3.2. Üç Boyutlu Yapıları Görselleştirme Araçları 31
1.2.2.2.3.2.1. Rasmol 31
1.2.2.2.3.2.2. PyMOL 33
1.2.2.2.3.2.3. UCSF Chimera Programı 33
1.2.3. Fiziko-Kimyasal Özellik Hesaplama Çalışmaları 36
1.3. G Protein Bağlı Reseptörler ve Modelleme Çalışmaları 39
AVPR2 Geni ve Proteini 42
2. MATERYAL VE YÖNTEM 47
2.1. Sekans Analizi 47
2.2. Homoloji Modelleme Çalışması 52
2.3. Üç Boyutlu Yapıların Görselleştirilme Çalışması 52
2.4. Sperman Korelasyon Katsayısı ile Homoloji Modelleme Verilerinin ve Fonksiyon Analizi Çalışma Sonuçlarının Değerlendirilmesi 53
2.5. Üç Boyutlu Yapıların Fiziko-kimyasal Özelliklerinin Hesaplanması 53
3. SONUÇLAR VE TARTIŞMA 54
3.1. Sekans Analizlerinin Derlenmesi 53
3.2. Homoloji Modelleme Çalışması 54
3.3. Üç Boyutlu Yapıların Görselleştirilme Sonuçları 55
3.4. Sperman Korelasyon Katsayısı ile Homoloji Modelleme Verilerinin ve Fonksiyon Analizi Çalışma Sonuçlarının Arasındaki İlişkinin Gösterilmesi 73
3.5. Modellerin Fiziko-kimyasal Özelliklerinin Hesaplama Sonuçları 76
KAYNAKLAR 85
ÖZGEÇMİŞ 92Proteinler bütün organizmalarda bulunan ve birçok fizyolojik sürece doğrudan katılan amino asit dizilerinden oluşan eşsiz moleküllerdir. Bir proteinin üç boyutlu yapısı o proteinin biyolojik önemini ve süreç içerisindeki görevini belirleyen faktörler arasında sayılabilir. Mutasyonların proteinlerin moleküler yapısı ve işlevi üzerine olan etkisi oldukça önemlidir. Protein dizisindeki herhangi bir değişim protein içindeki etkileşim kuvvetlerinin dengesini bozarak belirli bir bölgeyi ya da bütünü etkileyebilir. Protein yapılarındaki bu değişiklikler günümüzde biyoinformatik araçlar kullanılarak değerlendirilmektedir. Biyoinformatik; genetik, klinik, yapısal biyoloji ve biyokimya alanları dahil olmak üzere disiplinler arasında bağ kurmaktadır. Biyoinformatiğin alanı olan homoloji temelli modelleme çalışmaları proteinlerin üç boyutlu yapısını tahmin etmeye çalışmaktadır. Çalışılan proteinlerin fiziko-kimyasal özelliklerinin bilinmesi ve proteinlerin üç boyutlu homoloji modelleme çalışmaları proteinlerin üç boyutlu yapılarının değerlendirilmesinde önemlidir. Bir proteinin mutant ya da yabanıl tipinin üç boyutlu yapısının bilinmesi protein-protein, protein-ligant ve doking çalışmalarında önemli rol oynar.
Bu çalışmanın amacı, in-vitro mutasyon fonksiyon analiz çalışmaları araştırma grubumuz tarafından tamamlanmış olan mutant AVPR2 protein homoloji modellemelerini biyoinformatik araçlar kullanılarak elde etmek, fiziko-kimyasal özelliklerini belirlemek ve elde edilen sonuçları ilgili proteinlerin in-vitro fonksiyon analiz çalışmalarından elde edilen sonuçlar ile birarada değerlendirmektir.
Bu amaçla yapılan çalışmalarda, yabanıl tip AVPR2 ve ΔR67_G69, G107W, ΔR67_G69/G107W, R68W, V162A ve T273M mutant tip AVPR2 modelleri Swiss-Model homoloji modelleme veri tabanı ile çıkarılmıştır. Yabanıl tip ve mutant tip modellerin fiziko-kimyasal özellikleri ProtParam programı ile hesaplanmıştır. Yabanıl ve mutant tip modeller Chimera programında görselleştirilerek incelenmiştir. Oluşturulan modeller, fiziko-kimyasal hesaplamalar ve mutasyon fonksiyon analizleriyle beraber değerlendirilmiştir.
Sonuç olarak, tez kapsamında çalışılan bütün modellerin mutasyon fonksiyon analizlerin, fiziko-kimyasal hesaplamalar sonucu elde edilen verilerin ve oluşturulan modellerin birbirlerini desteklediği belirlenmiştir.
İn-vitro mutasyon analizleri, homoloji modelleme çalışmaları ve hastaların klinik durumları birlikte değerlendirildiğinde bu çalışma gelecekteki tedavi amaçlı doking ve modelleme çalışmalarında kullanılabilecek bilgiler sunmaktadır
Iyonize Radyasyonun Otofajı Yolağında Bulunan Bazı Genlerin Ekspresyonuna Etkisinin Araştırılması
No full textUtilization of radiation widely due to the progress in technology resulted in the increased exposure to artificial radiation in addition to natural radiation. Under the circumstances there has been a demand for the development of fast, sensitive and radiation specific systems that could evaluate the damage on living organisms caused by the exposure to radiation.Gelişen teknoloji ile birlikte her alanda radyasyonun kullanımının artması canlıların doğal radyasyonun yanı sıra yapay radyasyona da maruz kalma miktarını arttırmıştır.Bu durum radyasyona maruz kalma sonucunda canlılarda meydana gelen hasarı tespit edebilecek hızlı, hassas ve radyasyona özgül sistemlerin geliştirilmesine ihtiyaç doğurmuştur
Alzheimer Hastalarında Psen1 Geni Mutasyon Taraması ve Apoe Genotiplendirmesi
No full textDementia means that the increasing losses of anamnesis, thinking and judgment skills with the passing of time. Alzheimer s Disease (AD) which is the most common dementia reason in elderly population, is a neurodegenerative disease and mostly appears as a combination of genetic and environmental factors. Early onset familial Alzheimer s Disease (EOAD) is rare and shows autosomal dominant Mendelian inheritance. The most common form of Alzheimer s Disease is late onset sporadic Alzheimer s Disease (LOAD) which is multifactorial, so it is more complex.The presence of missense mutations in PSEN1 gene is responsible for agressive progression of early onset familial Alzheimer s Disease. It is not clear that the role of PSEN1 on the most of LOAD case except the contributions to familial EOAD.Demans, hatırlama, düşünme ve akıl yürütme becerisinde zamanla artan kayıp demektir. Yaşlı populasyonda en sık görülen demans nedeni olan Alzheimer Hastalığı (AH), yüksek sıklıkla genetik ve çevresel faktörlerin etkileşimi sonucu ortaya çıkan nörodejeneratif bir hastalıktır. Daha nadir görülen erken başlangıçlı AH (EBAH), otozomal dominant Mendelyen geçişle belirlenen basit nedensellik gösterir. Hastalığın en sık görülen biçimi olan sporadik geç başlangıçlı AH (GBAH) ise multifaktöriyeldir, bu nedenle kompleks bir nedenselliğe sahiptir.Presenilin-1 (PSEN1) geninde yanlış anlamlı mutasyonların varlığı, EBAH olgularında agresif ilerlemeden sorumludur. Ailesel EBAH sürecine yaptığı katkıların dışında PSEN1 proteininin, GBAH olgularının büyük çoğunluğunda rolü olup olmadığı açık değildir
- …
