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Die genetische Grundlage der Antikörpervielfalt
No full textThukydides beschreibt eine nicht identifizierte Seuche, die Athen im Peloponesischen Krieg (430 v. Chr.) heimsuchte. Ein Viertel der Athener Landstreitkräfte starben. „Diejenigen, die sich von der Krankheit erholten …, hatten nun keine Angst mehr um sich; kein Mann wurde nämlich zweimal befallen … Und solche Leute nährten in der gehobenen Stimmung des Augenblicks fast die vergebliche Hoffnung, daß sie für die Zukunft sicher vor jedweder Krankheit wären.“ Dieser Bericht beschreibt zwei Elemente des Immunsystems — Gedächtnis und Spezifität
Proteine, die somatische Hypermutation und Klassenwechselrekombination im Immunglobulinlokus bewirken
No full textTitelblatt und Inhaltsverzeichnis
Zusammenfassung
Summary
Abbreviations
Introduction
Specific aims
Results
Discussion
Material and Methods
References
Acknowledgement
PublicationsSummary Antibodies are produced by B cells before antigen contact. A given B
cell synthesizes antibodies of one specificity only. However, the large number
of B lymphocytes allows for a large diversity, which stands ready to meet the
antigenic universe. Upon contact with the cognate antigen, the B cell expands
into a clone and eventually secretes the antibody in large amounts. The
diversity of antibodies is generated in two steps, first before antigen
contact by random and imprecise joining of gene segments. Second, upon
encounter with the antigen, three types of genetic changes in the antibody
encoding loci may occur: somatic hypermutation (SHM) and gene conversion in
the antigen binding part; and class switch recombination (CSR) in the non-
antigen binding part of the antibody. All three phenomena are mediated by the
enzyme activation-induced cytidine deaminase (AID), which is specifically
expressed in activated B cells. WEHI-231 is known as an immature B cell line
with no evidence for SHM or CSR. Indeed, in early freezings of the WEHI-231
line the canonical AID is absent. However, we found some variant lines that
express AID. But despite the presence of AID and other known factors required
for SHM and CSR, cells of the WEHI-231 variants do not switch the Ig class and
hypermutate only at low level. This level, though, was enough in a subclone to
cause decreased surface IgM via accumulation of mutations in the Κ light
chain, which decreased expression, and, in turn, decreased the amount of
complete IgM on the cell surface. And instead of CSR, we found in a WEHI-231
variant recombination between alleles. In early WEHI-231 freezings, instead of
the canonical AID, an 18-kD protein is expressed. The protein reacts with the
antibody to AID, and therefore may represent a temporal precursor to
functional AID. Based on the presence the 18-kD protein and expression of the
mature B cell marker IgD, we re-classified WEHI-231 as a mature B cell line,
and the WEHI-231 variants as activated B cell lines. We used the WEHI-231
lines to search for additional unknown factors required for SHM and CSR. By
retroviral integration mutagenesis we found the chaperone Tid-1 as a potential
missing factor. As a second candidate, we studied the chromatin-remodeling
factor Supt6h, which is thought to help transcription by displacing histones
for the RNA polymerase II to access the DNA. The rate of mutation introduced
by AID depends on the rate of transcription, and so a transcription factor
seemed to be a good choice after we had found previously that Supt6h binds AID
in yeast two-hybrid screens.Eine B-Zelle produziert Antikörper von nur einer bestimmten Spezifität. Da
verschiedene B-Zellen verschiedene Antikörper produzieren, ermöglicht die hohe
Anzahl von B-Zellen eine immense Antikörpervielfalt. Diese Vielfalt wird durch
zwei genetische Mechanismen gewährleistet: zum Einen vor Antigenkontakt, durch
zufälliges und unpräzises Zusammenfügen von Gensegmenten. Zum Anderen kann
nach Antigenkontakt durch somatische Hypermutation (SHM) und Genkonversion die
Antikörpervielfalt hinsichtlich der Spezifität erhöht werden, und durch
Umschalten der Immunglobulinklasse (class switch recombination, CSR) kann der
konstante Teil des Antikörpers ausgewechselt werden. Für die genannten
Mechanismen ist das Enzym AID (activation-induced cytidine deaminase)
notwendig, welches ausschliesslich in aktivierten B-Zellen exprimiert wird.
Die Zelllinie WEHI-231 wird als Repräsentant einer unreifen B-Zelle angesehen.
Sie sollte daher kein AID exprimieren und damit auch weder SHM noch CSR
aufweisen. In der vorliegenden Arbeit wurden jedoch AID-exprimierende WEHI-231
Varianten gefunden: Obwohl AID vorhanden ist und auch die anderen in CSR und
SHM involvierten Faktoren in den WEHI-231 Varianten unverändert exprimiert
werden, konnte kein CSR und nur im geringen Maße SHM nachgewiesen werden. Eine
Ausnahme ist ein Zellklon, der durch Akkumulation von Mutationen in der
leichten Kette nur wenig IgM an der Zelloberfläche vorweist. Ein möglicher
Hinweis auf fehlerhafte AID-Aktivität ist die Rekombination zwischen den
Immunglobulin-Allelen, die in WEHI-231 vorgefunden wurde. Anstelle des
klassischen AID-Proteins mit 24 kD Molekulargewicht wurde in der
ursprünglichen WEHI-231-Linie ein Protein gefunden, das mit dem AID-Antikörper
reagiert, aber nur 18 kD Molekulargewicht hat. Aufgrund dieser Ergebnisse und
der Tatsache, dass auch IgD exprimiert wird, wurde WEHI-231 als reife
B-Zelllinie und die WEHI-231-Variante als aktivierte B-Zelllinie
reklassifiziert. Um weitere Faktoren für SHM und CSR zu finden, wurde SHM in
der WEHI-231-Variante mittels retroviraler Integration induziert und als
potentieller Kandidat das Chaperon Tid-1 gefunden. Als ein weiterer AID-
Interaktionspartner wurde der chromatin-modulierende Faktor Supt6h untersucht,
welcher zuvor als potentieller AID-Interaktionspartner in einem yeast two-
hybrid test identifiziert wurde. Supt6h bewirkt das Entfernen und späteres
Wiedereinfügen von Histonen während der Transkription der RNA Polymerase II.
Da die AID-induzierte Mutationsrate von der Transkriptionsrate abhängt, wurde
unter der Annahme, dass Supt6h ein vielversprechender Kandidat ist,
Interaktion mit AID verifiziert
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