436 research outputs found
Über Kalziumsignale und Zytotoxizität menschlicher natürlicher Killerzellen : Calcium signaling and cytotoxicity of human natural killer cells
No full textCalcium signaling is an essential component of immune cell function. Immunocompetent
cells employ calcium ions as a second messenger to regulate proliferation, migration
and maturation. In addition, intracellular calcium signals are necessary for cytotoxic
lymphocytes (CLs) such as CD8+ T-cells and natural killer cells (NK cells) to eliminate
target cells. For several decades, the doctrine used to be that this elimination is mainly
achieved by forcing a target cell into apoptosis. In recent years, several groups reported
that there is at least one further way of target cell killing. Given the right circumstances,
CLs are also able to kill by a direct lysis of the target cell’s membrane, a process referred
to as ’necrosis’.
Our research group, the Department of Biophysics at Saarland University, directed by
Prof. Dr. Markus Hoth, investigates the Ca2+ dependence of signaling processes in immune
cells. We found that calcium ion influx into killer cells is not only necessary for a
successful attack on pathogens and tumor cells, but that extracellular calcium supply can
influence a killer cell’s global killing efficiency.
The aim of this doctoral thesis was to study influx kinetics of Ca2+ ions in active NK
cells at a single-cell level using fluorescence microscopy. The conducted experiments led
to two main conclusions:
I) Not only do NK cells employ both necrosis and apoptosis when killing certain target
cells, but the frequency distributions of both killing types depend highly on the extracellular
Ca2+ concentration ([Ca2+]ext). Low concentrations favor the occurrence
of apoptosis, while an increase in [Ca2+]ext shifts the balance towards necrotic killing.
This shift occurs even after raising Ca2+ ion levels beyond the amount necessary for
necrosis induction.
II) The shape of Ca2+ influx differs, regarding necrotic and apoptotic killing. Necrosis
induction depends on high sustained rises in [Ca2+]int, while NK cells causing
apoptosis tend to show low and oscillatory Ca2+ signals.
Further experiments were conducted in attempt to reveal the responsible molecular mechanisms.
Artificially releasing high amounts of Ca2+ ions into the cytosol of killing NK
cells, using a photolabile Ca2+ chelator, suggests that high cytosolic Ca2+ concentrations
are necessary but not sufficient for necrosis induction by NK cells.
The presented results have contributed to shedding light on the Ca2+ dependence of
NK cell function. In his doctoral thesis published in 2016, Christian Backes from our
research group demonstrated that the balance of necrosis to apoptosis induced by NK
cells greatly affects their total killing competence. The observation that global killing efficiency of CD8+ T-lymphocytes and NK cells depends on [Ca2+]ext can now in parts
be explained by the likelihood of necrotic and apoptotic killing processes shifting.
Although different Ca2+ influx patterns in active NK cells were previously described
by other groups, no exact quantification of these signals has yet been provided. In addition
to giving such a quantification, this thesis can provide evidence that these different
signal types are clearly linked to distinct outcomes regarding NK cell cytotoxicity in vitro.
NK cells play a pivotal role in tumor surveillance and - in case of already developed
cancer - keeping malignant cell clones in check. Apoptosis and lysis of target cells may
both help achieve a shared aim but will differently affect the anti-tumor immune response.
Hence, different Ca2+ signals in tumor-killing NK cells as well as their likelihood of inducing
apoptosis or necrosis may also affect tumor development, progression as well as
the efficacy of immune therapy and adoptive cell transfer. Many recent studies suggest
that tumor cells benefit from necrosis by taking advantage of the resulting microenvironment.
If we can deepen our understanding of how different calcium signal types in CLs
come about, we could try to modulate killing behaviour to shape a more desirable cellular
immune response to malignancies.Kalziumsignale spielen eine Schlüsselrolle in der Funktion unserer Immunabwehr. Immunzellen
verwenden diese Signale, um komplexe Prozesse wie Proliferation, Migration
und Reifung zu regulieren. Darüber hinaus benötigen Killerzellen wie CD8+-T-Zellen und
natürliche Killerzellen (NK-Zellen) hohe zytosolische Kalziumspiegel, um Zielzellen abzutöten.
Die Doktrin der letzten Jahrzehnte war, dass dieses Abtöten im Wesentlichen
auf einem einzigen Mechanismus basiert: der Aktivierung des programmierten Zelltodes,
der Apoptose der Zielzelle. Seit einiger Zeit mehren sich jedoch die Hinweise, dass es noch
mindestens einen weiteren Mechanismus gibt. Unter gewissen Voraussetzungen können
Killerzellen ihre Opfer auch durch eine direkte Lyse der Zellmembran töten. Dieser Prozess
wird gemeinhin als "Nekrose" bezeichnet.
Unter der Leitung von Prof. Dr. Markus Hoth erforscht unsere biophysikalische Arbeitsgruppe
seit Jahren die Bedeutung von Kalziumsignalen für eine Vielzahl von Immunzellen.
Wissenschaftler unserer Abteilung fanden heraus, dass ein Kalziumeinstrom in Killerzellen
nicht nur notwendig für das Abtöten von Bakterien und Tumorzellen ist, sondern dass das
extrazelluläre Kalziumionenangebot auch einen Einfluss auf die absolute Killingeffizienz
ausübt.
Das Ziel der vorliegenden Doktorarbeit war, die Kinetik dieser Kalziumströme in aktiven
NK-Zellen mittels Fluoreszenzmikroskopie auf Einzelzellebene zu erforschen. Die in
diesem Rahmen durchgeführten Experimente lieferten zwei wichtige Erkenntnisse:
I) Zusätzlich zur Bestätigung, dass NK-Zellen sowohl Apoptose als auch Nekrose in
geeigneten Zielzellen induzieren, stellte sich heraus, dass die statistische Verteilung
beider Killingtypen stark vom extrazellulären Kalziumangebot abhängt. Niedrige
Konzentrationen an Kalziumionen begünstigen das Auftreten von Apoptosen, während
steigende Kalziumspiegel zu mehr und mehr Nekrosen führen. Dieser Einfluss
zeigt sich auch noch bei extrazellulären Kalziumkonzentrationen, die weit über dem
für Nekrose notwendigen Maß liegen.
II) NK-Zellen zeigen verschiedene Arten von Kalziumsignalen, je nachdem, welchen Typ
Zytotoxizität (i.e. Nekrose oder Apoptose) sie in ihrer Zielzelle induzieren. Die Lyse
der Zelle bedurfte dabei stets eines hohen und anhaltenden Einstroms von Kalziumionen,
während Killerzellen, die Apoptose hervorriefen, niedrigere und oszillierende
Kalziumströme zeigten.
Weitere Experimente zielten darauf ab, die molekularen Mechanismen für diese Unterschiede
in den Signalen aufzudecken. Indem große Mengen an Kalziumionen mittels eines
photolabilen Chelators künstlich in Killerzellen freigesetzt wurden, konnte gezeigt werden,
dass hohe Kalziumeinströme zwar notwendig, aber sehr wahrscheinlich nicht hinreichend für das nekrosebasierte Abtöten sind.
Die vorliegenden Ergebnisse haben dazu beigetragen, die Kalziumabhängigkeit der Funktion
von NK-Zellen besser zu verstehen. In seiner 2016 publizierten Doktorarbeit konnte
Christian Backes aus unserer Arbeitsgruppe zeigen, dass die Balance von Nekrose- zu
Apoptoseinduktion einen starken Einfluss auf das globale Killingpotential von NK-Zellen
ausübt. Mit Hilfe der hier gewonnenen Erkenntnis, dass diese Balance vom extrazellulären
Kalziumangebot abhängt, kann die Beeinflussung der Effizienz natürlicher Killerzellen
durch die Verfügbarkeit von Kalziumionen nun in Teilen erklärt werden.
Verschiedenartige Muster von Kalziumströmen in aktiven NK-Zellen wurden in der Vergangenheit
bereits von anderen Arbeitsgruppen postuliert, jedoch nicht exakt quantifiziert.
Neben einer solchen Quantifizierung kann die vorliegende Arbeit erstmals beweisen,
dass diese Signalmuster deutlich mit den verschiedenen Killingarten assoziiert sind, zu
denen NK-Zellen fähig sind.
Natürliche Killerzellen zählen zu den wichtigsten Effektoren der Tumorüberwachung.
Auch im Falle von bereits entstandenen Tumoren tragen sie essenziell dazu bei, den Tumor
in Schach zu halten. Unmittelbar führen Apoptoseinduktion und Lyse zwar zum
gleichen Ergebnis - dem Tod der Tumorzelle -, beide Prozesse beinflussen jedoch die gegen
den Tumor gerichtete folgende Immunantwort auf stark unterschiedliche Weise. Es ist
anzunehmen, dass die Frage, wie NK-Zellen Tumorzellen eliminieren und welche Kalziumsignale
sie dabei präsentieren, auch einen Einfluss auf die Wirksamkeit von Chemotherapien,
immunmodulierenden Therapien und adoptivem Zelltransfer haben könnte. Viele
aktuelle Studien legen nahe, dass Tumorzellen von einem bestimmten immunologischen
Mikromilieu profitieren. Ein solches Milieu scheint insbesondere durch nekrotische Zellen
begünstigt zu werden. Ein tiefer gehendes Verständnis davon, wie verschiedene Kalziumsignale
in NK-Zellen zustande kommen, könnte es erlauben, sie pharmakologisch zu
beeinflussen, um das Tötungsverhalten von NK-Zellen zu modifizieren. Auf diese Weise
könnte ein immunologisches Mikromilieu im Tumorgewebe erreicht werden, das bösartige
Zellen schädigt, ohne gleichzeitig die Vermehrung benachbarter Tumorzellen zu stimuliere
Funktionale Analyse von Tötungsmechanismen humaner Melanom-spezifischer CD8+ T-Zellen und natürlicher Killerzellen
No full textSowohl natürliche Killerzellen (NK-Zellen) als auch CD8+ T-Zellen (CTL) übernehmen als zytotoxische Effektorzellen komplementäre Aufgaben in der Immunantwort gegen Pathogene und entartete Zellen. NK-Zellen zählen zur angeborenen Immunität und erkennen ihre Zielzellen über die Bindung keimbahnkodierter Rezeptoren. CD8+ T-Zellen sind hingegen Teil der adaptiven Immunität und interagieren antigenspezifisch über ihren T-Zell-Rezeptor mit dem MHCI-Peptid-Komplex der Zielzelle.
Um eine antigenspezifische Interaktion zwischen einer CD8+ T-Zelle und ihrer Zielzelle auch in vitro zu ermöglichen, wurde im Rahmen dieser Arbeit die Generierung antigenspezifischer CD8+ T-Zellklone erstmals in unserem Labor etabliert. Die Generierung Melanom-spezifischer CD8+ T-Zellklone (CTLMART1 und CTLgp100) hat die direkte Interaktion mit Melanomzellen ermöglicht, wodurch ein Melanom-Kokultur-Modell etabliert werden konnte. Dieses Kokultur Modell wurde im Rahmen dieser Arbeit eingesetzt, um die NK- und CD8+ T Zell Interdependenz (gegenseitige Abhängigkeit) besser verstehen zu können. Dabei wurde die SK-Mel5 Zelllinie zunächst dem Selektionsdruck durch NK bzw. CTLMART1 ausgesetzt. Die überlebenden Melanomzellen aus dieser Kokultur wurden anschließend in einem Zytotoxizitäts-Assay (Real-time Killing Assay) als Zielzellen von NK und CTLMART1 verwendet. Eine Erhöhung des NK:SK-Mel5 Verhältnisses in der Kokultur korrelierte dabei invers mit der Lyseeffizienz der kokultivierten Melanomzellen durch NK. Somit hatte eine NK-Kokultur eine Resistenz der überlebenden Melanomzellen gegen die NK-vermittelte Zytotoxizität zur Folge. Parallel wurde auch in den kokultivierten SK-Mel5 Zellen eine Hochregulation von MHCI, einem Liganden für NK-inhibitorische Rezeptoren, festgestellt. Im Gegenzug war die CTLMART1 vermittelte Zytotoxizität auf die NK-inkubierten SK Mel5 Zellen unverändert. Eine CTLMART1-Kokultur hatte überraschenderweise sowohl eine Resistenz der überlebenden SK-Mel5 Zellen gegen die NK- als auch CTLMART1-vermittelte Zytotoxizität zur Folge. Außerdem wurde auch hier die Expression der MHCI-Rezeptoren hoch-, jedoch ebenso die Expression des MART1 Proteins herunterreguliert. Durch extrazelluläre Beladung der CTLMART1-inkubierten SK Mel5 Zellen mit dem korrespondierenden MART1-Antigen konnte die Resistenz gegenüber der CTLMART1-vermittelten Zytotoxizität kompensiert werden. Die Herunterregulation der MART1-Proteinexpression bewirkt somit eine verminderte Präsentation des korrespondierenden MART1-Antigens über MHCI-Moleküle an der Plasmamembran (PM) und bedingt dadurch eine Reduktion der CTLMART1-vermittelten Zytotoxizität gegen CTLMART1-kokultivierte SK-Mel5 Zellen.
Die CTL- und NK-Zell-vermittelte Zytotoxizität basiert in beiden Fällen auf den gleichen Mechanismen: Das Perforin-vermittelte Killing über Sezernierung von lytischen Vesikeln sowie die Bindung spezifischer Todes-Rezeptoren. Dabei kann der Zielzelltod durch Induktion der Apoptose, bei der die Integrität der PM erhalten bleibt, und durch Induktion der Nekrose ,die ein Aufplatzen der Zelle und damit den Verlust der PM-Integrität zur Folge hat, herbeigeführt werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Eignung der beiden Apoptose-Sensoren pCasper3 GR sowie Annexin V in bildgebenden Verfahren zur Charakterisierung des Effektor-induzierten Zelltodes untersucht und miteinander verglichen. Der FRET-basierte Sensor pCasper3-GR indiziert mittels Farbumschlag der Zelle von orange nach grün die Aktivierung der Effektor-Caspase 3, während das Fluorophor-gekoppelte Annexin V die extrazellulär translozierten Phosphatidylserine (PS) an der PM bindet. Das apoptotische Sterben von Zielzellen wurde dabei stets signifikant früher durch Analyse des pCasper Signals als durch Verwendung von Annexin V detektiert. Interessanterweise wurden Nekrosen durch beide Sensoren nahezu gleichzeitig nachgewiesen. Das deutet darauf hin, dass Annexin V bei Nekrosen und Sekundärnekrosen (Verlust der Membranintegrität einer bereits apoptotischen Zelle) in die Zelle diffundiert und intrazellulär PS bindet, was es für die genaue Charakterisierung des Effektor-induzierten Zelltodes ungeeignet macht.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde mit der Generierung antigenspezifischer CD8+ T-Zellklone ein wertvolles Werkzeug in der AG Hoth etabliert, das die Analyse der CD8+ T-Zell-vermittelten Zytotoxizität in vitro in einem physiologischen Kontext, wie z. B. der Melanom-Kokultur, ermöglicht. Mit Hilfe des etablierten Kokultur-Modells kann die Charakterisierung der Resistenzmechanismen von Tumorzellen, die vor allen Dingen bei Immuntherapien von Krebspatienten eine Rolle spielen, untersucht werden. Außerdem kann ein besseres Verständnis der CD8+-NK-Zell-Interdependenz langfristig eine Optimierung von zellbasierten Immuntherapien zur Folge haben. Zudem ermöglicht der Vergleich verschiedener Zelltod-Sensoren eine verbesserte Analyse zytotoxischer Mechanismen und trägt so zu einem besseren Verständnis der Funktion von zytotoxischen Immunzellen bei.Natural killer (NK) cells as well as CD8+ T cells (CTL) act as cytotoxic effector cells and perform complementary roles in immune responses against pathogens and malignant cells. NK cells belong to the innate immunity and express germ-line encoded activating and inhibitory receptors. CTL on the other hand are part of the adaptive immune system and recognize their targets by antigen-specific interactions of their T cell receptors (TCR) with MHCI-peptide-complexes presented by target cells.
In this thesis, antigen-specific CD8+ T cell clones were generated for the first time in our laboratory to allow antigen-specific interactions between CD8+ T cells with their cognate target antigen in vitro. Generation of melanoma specific CD8+ T cell clones (CTLMART1 and CTLgp100) gave us the opportunity to analyze combined CTL- and NK-mediated cytotoxicity against human melanoma cells (SK-Mel5). To this end, a melanoma-coculture-model has been established. Firstly, SK-Mel5 cells were coincubated together with NK cells or CTLMART1, respectively. Surviving melanoma cells served as target cells and were challenged again by adding NK cells or CTLMART1 as effector cells in a cytotoxicity assay (real-time killing assay). An increase of the NK:SK Mel5-ratio in coculture correlated with a reduced NK-mediated cytotoxicity and thus an NK cell resistance of surviving melanoma cells. Simultaneously, MHC class I (MHCI), a ligand for inhibitory NK receptors, was upregulated by NK-cocultured SK-Mel5 cells. In contrast, CTLMART1-mediated cytotoxicity against melanoma cells was unaffected by NK-coincubation. Surprisingly, addition of CTLMART1 in SK-Mel5 coculture induced a resistance of surviving SK-Mel5 cells against NK- as well as CTLMART1-mediated cytotoxicity. A CTLMART1-coculture caused an upregulation of MHCI molecules in parallel to a decrease of MART1 expression. Exogenous administration of corresponding MART1-peptide in a rescue-experiment restored CTLMART1-mediated cytotoxicity against SK-Mel5 cells coincubated with CTLMART1 beforehand. Thus, downregulation of MART1-protein expression induces a reduced presentation of corresponding MART1-antigens via MHCI molecules at the plasma membrane (PM), thereby causing a reduction of CTLMART1-mediated cytotoxicity against CTLMART1-cocultured SK-Mel5 cells.
CTL and NK cells are activated by different receptors but kill their target cells using the same basic mechanisms: perforin-mediated killing via secretion of lytic granules as well as binding of specific death receptors. Thereby different modes of cell death can be induced: apoptosis, which preserves PM integrity, and necrosis, which is indicated by disruption of the PM. In this thesis two different apoptosis sensors, pCasper3-GR and Annexin V, were tested in imaging based techniques to characterize effector cell-mediated cell death. The FRET-based pCasper3-GR sensor indicates activation of effector caspase 3 via color change from orange to green fluorescence emission. Fluorophore-labeled Annexin V on the other hand senses extracellular translocated phosphatidyl serines (PS) at the PM. In all experiments, pCasper signal analysis revealed apoptotic cell death before Annexin V signal analysis. Interestingly, analysis of both sensors revealed necrotic cell death almost simultaneously, indicating a diffusion of Annexin V into the cell, which causes an intracellular PS-binding. Thus, Annexin V seems to be an inappropriate marker for characterization of effector-induced cell death.
By generating antigen-specific CD8+ T cell clones, a valuable tool has been established in our laboratory to study CTL-mediated cytotoxicity in vitro in a more physiological context. Using this tool, a melanoma-coculture-model could be established, which allows the characterization of resistance mechanisms used by tumor cells, having an impact on immune cell based tumor therapies of cancer patients. Furthermore, a better understanding of CTL-NK-cell interdependence could give rise to optimization strategies of immune therapies. Moreover, a comparison of different cell death markers facilitates an optimized analysis of cytotoxtic mechanisms and thereby contributes to a better understanding of cytotoxic immune cell function
The calcium channel modulator 2-APB hydrolyzes in physiological buffers and acts as an effective radical scavenger and inhibitor of the NADPH oxidase 2
No full text2-aminoethoxydiphenyl borate (2-APB) is commonly used as a tool to modulate calcium signaling in physiological studies. 2-APB has a complex pharmacology and acts as activator or inhibitor of a variety of Ca2+ channels and transporters. While unspecific, 2-APB is one of the most-used agents to modulate store-operated calcium entry (SOCE) mediated by the STIM-gated Orai channels. Due to its boron core structure, 2-APB tends to readily hydrolyze in aqueous environment, a property that results in a complex physicochemical behavior. Here, we quantified the degree of hydrolysis in physiological conditions and identified the hydrolysis products diphenylborinic acid and 2-aminoethanol by NMR. Notably, we detected a high sensitivity of 2-APB/diphenylborinic acid towards decomposition by hydrogen peroxide to compounds such as phenylboronic acid, phenol, and boric acid, which were, in contrast to 2-APB itself and diphenylborinic acid, insufficient to affect SOCE in physiological experiments. Consequently, the efficacy of 2-APB as a Ca2+ signal modulator strongly depends on the reactive oxygen species (ROS) production within the experimental system. The antioxidant behavior of 2-APB towards ROS and its resulting decomposition are inversely correlated to its potency to modulate Ca2+ signaling as shown by electron spin resonance spectroscopy (ESR) and Ca2+ imaging. Finally, we observed a strong inhibitory effect of 2-APB, i.e., its hydrolysis product diphenylborinic acid, on NADPH oxidase (NOX2) activity in human monocytes. These new 2-APB properties are highly relevant for Ca2+ and redox signaling studies and for pharmacological application of 2-APB and related boron compounds
Electrochemical Quantification of Extracellular Local H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> Kinetics Originating from Single Cells
No full textHydroxyapatite based mouthrinses against oral biofilm formation in situ
No full textIntroduction: Nowadays, various artificial dental materials are applied for oral rehabilitation with high rates of success. However, there is still the risk of bacterial colonization, which can affect their clinical performance and lead to failures. Recent reports have shown that hydroxyapatite particles (HAP) may have preventive properties against bacterial adhesion.
Objectives: This in situ study aims to investigate the effect of different sizes and shapes of HAP on the acquired pellicle and on the biofilm formed on enamel, titanium (Ti), ceramic, and polymethyl methacrylate (PMMA).
Material and Methods: This study was performed according to three different protocols. In all of them, the volunteers carried an upper jaw splint with attached samples. Three minutes after the splint placement, the volunteers rinsed with 10 ml of the selected solution for 30 seconds. The tested solutions included three 5% HAP watery solutions, as well as chlorhexidine (CHX) and water, as controls. The HAP solutions were prepared from three powders containing nanoparticles with different shapes and medium sizes: HAP I (needle, 40 nm), HAP II (needle, 100 nm), HAP III (spherical, 200 nm).
In Protocol 1, two volunteers used the selected rinsing solution after 3 min of pellicle formation. Scanning Electron Microscopy (SEM) was used to evaluate the samples immediately after rinsing, 30 min and 2 h after rinsing to assess the capacity of HAP particles to adhere to the pellicle formed on enamel, Ti, ceramic, and PMMA. Protocol 1 also evaluated the influence of the size and shape of the different HAP particles on their adhesion to the pellicle’ surface.
In Protocol 2, the splints remained in the oral cavity for 24 h after pellicle formation and the five volunteers made the rinsing at two different time points. The first rinsing was performed after 3 min of pellicle formation and a second rinsing after a 12 h interval. Protocol 2 evaluated the effects of three different HAP solutions on the biofilm formed on the applied materials.
Protocol 3 evaluated the effects of HAP II on the biofilm adhesion on polished and non-polished titanium discs. The objective was to access the influence of Ti surface topography. The five volunteers rinsed at 4-time points on a 48-h interval. The first rinsing was performed after 3 min of pellicle formation, and three followings rinsing were made each 12 h.
The biofilm coverage and viability in protocols 2 and 3 were assessed by SEM, Fluorescence Microscope (FM) and Transmission Electron Microscope (TEM).
Results: In Protocol 1, descriptive results showed that HAP might interact with the salivary proteins from acquired pellicle despite the particles’ size or shape or the material applied. Protocols 2 and 3 presented similar results: the three HAP solutions did not alter the bacterial viability, but successfully reduced the biofilm adhered to all surfaces tested on protocol 2 and on polished titanium surfaces from protocol 3. The HAP size and shape had no significant influence on its anti-adhesive effects on enamel, titanium, ceramics, or PMMA. Additionally, protocol 3 indicated that the Ti surface topography influences biofilm adhesion and accumulation. SEM figures also suggest that HAP may interact with the oral bacteria from the biofilm.
Conclusions: The anti-adhesive effect of the bioinspired HAP solutions yielded a significant impact on the in situ oral biofilm formation on polished enamel, titanium, ceramics, and PMMA surfaces, representing a promising adjunct solution for biofilm management.Effect von Hydroxylapatit basierten Mundspülungen auf die orale Biofilmbildung in situ
Einleitung: Heutzutage werden verschiedene künstliche Zahnmaterialien mit hohen Erfolgsraten für orale Rehabilitationsbehandlungen eingesetzt. Es besteht jedoch weiterhin das Risiko einer Besiedlung mit Bakterien, die deren klinische Erfolg beeinträchtigen und zum Versagen führen können. Jüngste Berichte haben gezeigt, dass Hydroxylapatit-Partikel (HAP) präventive Eigenschaften gegen die Anhaftung von Bakterien haben können.
Zielsetzung: Ziel dieser in situ-Studie ist es, die Auswirkung unterschiedlicher Größen und Formen von HAP auf die erworbene Pellikel und den auf Zahnschmelz, Titan (Ti), Keramik und Polymethylmethacrylat (PMMA) gebildeten Biofilm zu untersuchen.
Material und Methoden: In dieser Studie wurden drei verschiedene Protokolle durchgeführt. Bei allen versuchen trugen die Probanden eine mit Proben bestückte Oberkieferschiene. Drei Minuten nach der Platzierung der Schiene spülten die Probanden 30 Sekunden lang mit 10 ml der ausgewählten Lösung. Die getesteten Lösungen waren drei wässrige, 5%ige HAP-Lösungen sowie Chlorhexidin (CHX) und Wasser als Kontrollen. Die drei HAP-Lösungen wurden aus unterschiedlichen Pulvern hergestellt, welche Nanopartikel mit unterschiedlichen Formen und mittleren Größen enthielten: HAP I (nadelförmig, 40 nm), HAP II (nadelförmig, 100 nm), HAP III (sphärisch, 200 nm).
Gemäß Protokoll 1 verwendeten zwei Probanden die ausgewählte Spüllösung nach 3 Minuten Pellikelbildung. Die Analyse der Proben erfolgte mittels Rasterelektronenmikroskopie (REM) unmittelbar nach dem Spülen sowie 30 Minuten und 2 Stunden nach dem Spülen, um die Fähigkeit von HAP-Partikeln an die auf Zahnschmelz, Ti, Keramik und PMMA gebildete Pellikel anzuhaften. Protokoll 1 bewertete auch den Einfluss der Größe und Form der HAP-partikel auf das Adhärenzverhalten au des Pellikeloberfläche.
Gemäß Protokoll 2 blieben die Oberkieferschienen nach der Pellikelbildung für 24 Stunden in der Mundhöhle, und die 5 Probanden führten die Spülungen zu zwei verschiedenen Zeitpunkten durch. Die erste Spülung erfolgte nach 3 Minuten Pellikelbildung und eine zweite Spülung nach 12 Stunden. Protokoll 2 bewertete die Auswirkungen dreier verschiedener HAP-Lösungen auf dem Biofilm, der auf den untersuchten Materialien innerhalb von 24 h gebildet wurde.
Protokoll 3 bewertete die Auswirkungen von HAP II auf die Biofilmhaftung an polierten und nicht polierten Titanscheiben. Ziel war es, den Einfluss der Ti-Oberflächentopographie zu erfassen. Die 5 Probanden spülten zu vier Zeitpunkten im Zeitraum von 48 Stunden. Die erste Spülung wurde erfolgter 3 Minuten nach der Pellikelbildung durchgeführt und die drei nachfolgenden Spülungen wurden alle 12 Stunden.
In den Protokollen 2 und 3 wurde die Biofilmbedeckung und Vitalität mittels REM, Fluoreszenzmikroskopie (FM) und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) analysiert.
Ergebnisse: Die Ergebnisse aus Protokoll 1 zeigen, dass HAP unabhängig von der Größe oder Form der Partikel mit den Speichelproteinen der Pellikel interagieren kann. Protokoll 2 und 3 zeigen ähnliche Ergebnisse: Die drei HAP-Lösungen änderten die Vitalität der Bakterien nicht, reduzierten jedoch erfolgreich den Biofilm, der auf allen nach Protokoll 2 getesteten Oberflächen und auch auf den polierten Titanoberflächen nach Protokoll 3 haftete. Die Größe und Form des HAP Partikel hatte keinen signifikanten Einfluss auf die Antihaftwirkung auf Zahnschmelz, Titan, Keramik oder PMMA. Zusätzlich zeigt Protokoll 3, dass die Ti-Oberflächentopographie die Biofilmadhäsion und -akkumulation beeinflusst. Die REM-Analysen zeigen außerdem, dass HAP mit den Bakterien des Biofilms interagieren kann.
Schlussfolgerungen: Die antiadhäsive Wirkung der bioinspirierten HAP-Lösungen hat einen signifikanten Einfluss auf die in situ Biofilmbildung auf polierten Zahnschmelz-, Titan-, Keramik- und PMMA- Oberflächen. Dies stellt einen vielversprechenden neuen Ausatz für das bioinspirierte Biofilm-Management.Collaborative Research Center CRC/SFB 1027, Saarland Universit
Impacts of bystander cells and external Ca2+ on NK/CTL-mediated cytotoxicity
No full textImmune killer cells, mainly cytotoxic T lymphocytes (CTLs) and natural killer (NK) cells,
serve a crucial role in eliminating pathogen-infected cells and cancer cells. The specificity of
immune cytotoxicity relies on the formation of the immunological synapse (IS) between the
killer cell and the target. While killer cells search and eliminate targets, environmental
components like the non-target bystander cells and extracellular calcium ([Ca2+]ex) are
important factors relevant for the killer cell’ functions. To date, the impact of bystander cells
and [Ca2+]ex on killer cell cytotoxicity remains poorly understood. To address this question, I
investigated the role of the bystander cells and [Ca2+]ex for killer cell functions. In the first part
of this work, I focused on bystander cells. I found that the presence of bystander cells enhanced
the killing efficiency of both CTLs and NK cells without affecting the degranulation of
cytotoxic lytic granules (LG). Live cell imaging showed that the killer cells migrate with a
faster velocity and a higher persistence in the presence of bystander cells. The persistence, but
not the velocity of killer cells was reduced by the blockade of integrin β chains 1, 2 and 7 on
the killer cells with neutralizing antibodies. Furthermore, bystander cell-generated H2O2
elevates the killer cell migration velocity, but not the persistence and degranulation. In the
second part, based on coworkers' observation, I investigated how [Ca2+]ex affects CTLmediated
cytotoxicity. I reproduced that CTLs show the best killing when [Ca2+]ex was reduced
to 130-800 μM, higher or lower [Ca2+]ex impaired the killing efficiency. The same tendency
was confirmed for LG release in CTLs with the same [Ca2+]ex using total internal reflection
fluorescence microscopy (TIRFM). I could show that the Ca2+ signal at the site where vesicles
fused is lower than in the LG-free cytosol and the site a vesicle stayed non-fused. In summary,
this work suggests that bystander cells enhance NK/CTL-mediated cytotoxicity by promoting
killer cell migration through bystander-derived H2O2 and by killer cell β integrins. CTLs execute the cytotoxicity in a [Ca2+]ex dependent manner, and the release of LG correlates with a
Ca2+ microdomain which contains relatively low Ca2+ at the IS. These results suggest a positive
role of the bystander cells in facilitating killer cell to pinpoint the target, and uncover the
potential utility of tuning [Ca2+]ex to modify killer cell cytotoxicity, therefore allowing new
insights into the possible impact of the microenvironment on immune surveillance.Die wesentlichen Killerzellen des Immunsystems, Zytotoxische T Lymphozyten (CTL)
und Natürliche Killerzellen (NK), spielen eine entscheidende Rolle bei der Eliminierung
von Pathogen-infizierten Zellen und Krebszellen. Die Spezifizität der Zytotoxizität des
Immunsystems hängt dabei von der erfolgreichen Bildung der Immunologischen Synapse
(IS) zwischen Killer- und Zielzelle ab. Die Suche nach und Abtötung von Zielzellen wird
wahrscheinlich von verschiedenen Faktoren des Mikromilieus beeinflusst: U.a. könnten
sogenannte Bystanderzellen, die selbst nicht von den Killerzellen erkannt werden, wie
auch die extrazelluläre Calciumkonzentration ([Ca2+]ex) eine wichtige Rolle für die
Funktion der Killerzellen spielen. Beide Faktoren sind allerdings bis jetzt nicht eingehend
untersucht worden. Daher hat meine Arbeit zum Ziel die Rolle von Bystanderzellen und
von [Ca2+]ex auf die Funktion von Killerzellen zu analysieren. Im ersten Teil der Arbeit
habe ich mich auf die Bystander-Zellen fokussiert. Ich habe herausgefunden, dass die
Effizienz von CTL und NK Zellen bei der Abtötung von Zielzellen durch die
Anwesenheit von Bystander-Zellen positiv beeinflusst wird, ohne dass diese dabei die
Degranulation der lytischen Granula (LG) beeinflusst. Mittels bildgebender Verfahren
konnte nachgewiesen werden, dass CTL und NK Zellen in der Anwesenheit von
Bystander-Zellen schneller migrieren und dabei auch eine höhere Migrations-Persistenz
aufweisen. Dabei wird die Persistenz nicht aber die Geschwindigkeit der Migration durch
eine Blockade der Integrin β-Untereinheiten durch neutralisierende Antikörper reduziert.
Im Gegensatz dazu erhöht H2O2, welches von den Bystander-Zellen produziert wird, die
Geschwindigkeit aber nicht die Persistenz der Migration, ohne dabei die Degranulation
der LG zu beeinflussen. Im zweiten Teil der Arbeit habe ich die Abhängigkeit der CTL
Zytotoxizität von [Ca2+]ex untersucht, basierend auf vorhandenen Ergebnissen von
anderen Labormitgliedern Ich habe reproduziert, dass CTL bei einer [Ca2+]ex von etwa
130-800 μM ein Optimum bezüglich Zytotoxizität gegenüber Zielzellen haben, höheres
oder niedrigeres [Ca2+]ex reduziert die Abtötungseffizienz. Dieselbe Abhängigkeit von
[Ca2+]ex habe ich für die Freisetzung von LG an der IS mittels Totaler-Interner-
Reflektions-Mikroskopie (TIRFM) gemessen. Zusätzlich konnte ich zeigen, dass
intrazelluläre Ca2+ Signale in Bereichen niedriger sind, in denen LG Fusion stattfindet,
und höher in Bereichen, in denen keine Fusion stattfindet. Zusammenfassend zeigt die
Arbeit, dass Bystander-Zellen die Zytotoxizität von CTL und NK Zellen erhöht, und zwar
durch eine H2O2-abhängige Erhöhung der Migrationsgeschwindigkeit und eine Integrinabhängige Erhöhung der Migrationspersistenz. Die zytotoxische Funktion ist Ca2+-
abhängig mit einem relativ niedrigen Ca2+-Optimum und relativ niedrigen Ca2+
Konzentrationen an der IS. Diese Ergebnisse weisen auf eine positive Rolle von
Bystander-Zellen bei Abtötung von Zielzellen hin, und sie zeigen eine Möglichkeit auf,
[Ca2+]ex zu nutzen, um die Zytotoxizität der Killerzellen zu modulieren. Beide Ergebnisse
unterstreichen darüber hinaus die fundamentale Rolle des Mikromilieus bei der
Immunabwehr
Migration of Primary Human Lymphocytes in 3D matrices
No full textCytotoxic T cells protect us from viruses and tumors and move large distances within the body to find infected or transformed target cells. Their migration is an interplay of their intrinsic ability to migrate and to sense their environment and adapt to it. The composition of extracellular signals and physical contact to connective tissue fibers modulates the migration of T cells. To be able to analyze lymphocyte behavior in 3D I first developed new imaging methods in 3D environments for epifluorescence and Single Plane Illumination Microscopy (SPIM) using collagen as matrix. As a natural non-toxic substrate that is biologically active and can form sponge-like porous matrices that are homogenous and stable under physiological conditions collagen is a perfect starting point to remodel basic tissue architecture and determine basic migration parameters of lymphocytes. Using this collagen based system with a flattened matrix to avoid out of focus migration of cells (2D matrix) I could determine the basic migration parameters of primary human cytotoxic T lymphocytes (CTL) and natural killer cells (NK) in a 3D environment using epifluorescence microscopy. In 0.25 % collagen, representing normal tissue interstitial matrix, lymphocytes migrate in a random walk at average speeds ~ 5 μm min-1 (range ~ 0.6 - 18 μm min-1) and low average persistence. Bead stimulation of CTL that enriches effector and effector memory subtypes, increases average persistence while average velocity is nearly unchanged. By adding extracellular matrix (ECM) compounds the matrix can easily be modified and cell behavior can be modulated. E.g. fibronectin can modulate cell velocity and persistence while fragmented hyaluronic acid, mimicking inflammation or injury, can modulate persistence of CTL. Transferring the collagen system to selected plane illumination microscopy (SPIM) for long term imaging of large 3D volumes SPIM is highly advantageous as it reduces potential toxicity from illumination of the sample and is unraveled in acquisition speed. Additionally the high resolution and frame rate of SPIM systems allows imaging large volumes of containing hundreds of cells or large organoids / spheroids while at the same time catching subcellular dynamic structures like filopodia or actin waves. A system to analyze CTL biology in SPIM experiments was developed and established successfully. Having set up 3D imaging methods we aimed to elucidate the function of a protein central to CTL dynamics governed by actin polymerization: profilin. Many cytosolic proteins are involved in cytoskeletal remodeling yet not much is known about the dynamic control in human CTL. Profilin1 (PFN1) an actin binding protein that lies at the border of cytoskeletal dynamics and signaling pathways, was found, by our Chinese collaborators in Shanghai, to be downregulated in CTL from pancreatic cancer patients. Using overexpression systems of PFN1 (and mutations) with fluorescent fusion proteins and siRNA downregulation we could show that PFN1 is a negative regulator of CTL cytotoxicity and that interactions with phospholipids and regulatory proteins are important for proper regulation of migration. Interestingly actin polymerization rates appear almost unaffected by changes of the relative PFN1:G-actin concentration as is the case for overexpression of PFN1, the Y59A (abolished actin binding) mutant and CTL with siRNA downregulation of PFN1. Apart from this we could show that PFN1 in primary human CTL modulates the protrusion pattern during migration and the release of LGs at the IS via actin structure modulation at the IS. This shows that especially the interplay with phospholipid pathways is an important function for PFN1 apart from supplying actin monomers to polymerizing actin filaments. The results of the profilin study were published in 2017 (Schoppmeyer et al. 2017).Zytotoxische T Zellen beschützen uns vor Viren und Tumorzellen und müssen dafür große Distanzen im Körper und Gewebe zurücklegen um infizierte oder transformierte Zellen zu finden und eliminieren. T-Zell Migration ist ein Zusammenspiel von extrazellulären Signalen, physischem Kontakt zu Fasern der extrazellulären Matrix, zytoskeletaler Dynamik und dem intrazellulärer Signalwege. Um das Migrationsverhalten von Lymphozyten zu analysieren habe ich zuerst neue Imaging-Methoden entwickelt in 3D Umgebungen für die Epifluoreszenz- und Lichtblattmikroskopie (Selected Plane Illumination Mikroskopie oder SPIM) mit Kollagen als grundlegender Matrix. Diese Methoden werden in dieser Arbeit als 2D Matrix (Epifluoreszenz) und 3D SPIM (Lichtblattmikroskopie) benannt. Die natürliche und nicht toxische Kollagenmatrix ist biologisch aktiv und polymerisiert unter physiologischen Bedingungen zu schwamm-artigen, porösen, homogene und stabilen Matrizen. Dies macht Kollagen zu dem perfekten Startpunkt zur Remodellierung einer grundlegenden Gewebearchitektur und Bestimmung der Grundlegenden Migrationsparameter von Lymphozyten. Mit Hilfe des Kollagen basierten Systems und einer verflachten Matrix (10 - 15 μm) um eine „out of focus“ Migration der Zellen zu verhindern konnte ich Grundlegende Parameter von primären humanen Lymphozyten von gesunden Spendern mit Hilfe des 2D Matrixsystems bestimmen. Lymphozyten migrieren mit einer Zufallsbewegung mit einer Durchschnittsgeschwindigkeit von etwa 5 μm min-1 und niedriger Persistenz in 0.25 % Kollagen. Bead Stimulation von CTL, welche Effektor und Effektor-Gedächtniszellen in der Population anreichert, erhöht die durchschnittliche Persistenz der Population während die Durchschnittsgeschwindigkeit sich kaum verändert. Durch das Hinzufügen von Komponenten der Extrazellulären Matrix (Fibronektin und Hyaluronsäure) ist es relativ einfach möglich die Matrix und damit das Verhalten der darin migrierenden Zellen zu modulieren. Fibronektin z.B. beeinflusst sowohl die Durchschnittsgeschwindigkeit als auch die Persistenz während Hyaluronsäure nur die Persistenz beeinflusst. Zur Langzeitbeobachtung von Zellen unter physiologischen Bedingungen reicht das 2D Matrix System nicht aus auf Grund seiner Limitationen. Der Transfer des kollagen-basierten Systems zu SPIM erlaubt Langzeitaufnahmen von Zellpopulationen in 3D Volumen unter probenschonenden Bedingungen bei gleichzeitiger subzellulärer Auflösung. Das Aktin-Zytoskelett steht zentral zu dynamischen Prozessen in T Zellen und die Polymerisation von Aktinfilamenten ist die treibende Kraft für die Zellbewegung. Eine Vielzahl an Proteinen sind in der Remodellierun
Einfluss der R-CHOP Therapie auf die Verteilung und die Funktion von Immunzellen bei Patienten mit aggressivem Non-Hodgkin-Lymphom
No full textDas häufig auftretende diffus großzellige B-Zell-Lymphom (DLBCL) wird als Standardtherapie mit einer Kombination aus Chemotherapie und dem zusätzlichen Einsatz des therapeutischen anti-CD20 Antikörpers Rituximab behandelt. Trotzdem kommt es bei ca. 30-50 % der Patienten zur Bildung eines Rezidivs oder die Patienten werden refraktär. Daher stellt eine bessere prognostische Beurteilung der Patienten einen wichtigen Schritt in der Entwicklung einer individualisierten Therapie bei Non Hodgkin Lymphomen dar.
Innerhalb dieser Arbeit wurden jeweils 27 ml EDTA-Blut (3 x 9 ml) von insgesamt 33 DLBCL Patienten zu unterschiedlichen Zeitpunkten (Diagnosestellung, Verlauf der Therapie und Nachsorge) analysiert, um einen Überblick über quantitative und qualitative Veränderungen der im Blut zirkulierenden Immunzellen zu erhalten. Als Referenzpunkt diente das Blut, das zum Zeitpunkt der „Diagnosestellung“ abgenommen wurde, das zudem mit Blut immunologisch gesunder Spender verglichen wurde. Im weiteren Therapieverlauf, wenn klinisch möglich, wurde das Blut jedes Patienten jeweils vor Rituximab-Gabe zu allen 6 8 Zyklen R CHOP untersucht. Nach Therapie folgte eine Blutabnahme alle drei Monate zum Nachsorgetermin, sodass der erste in diese Studie eingegangene Patient bereits über einen Zeitraum von drei Jahren untersucht wurde. Aus allen Blutproben wurden PBMC (periphere mononukleäre Zellen) aufgereinigt und durchflusszytometrisch untersucht. Folgende Subpopulationen wurden durch die Verwendung unterschiedlicher Antikörper und einer entsprechenden Gatingstrategie identifiziert: Leukozyten (Singlets, CD45+), Granulozyten (FSC A/SSC-A), Lymphozyten (CD45+/CD14-) und Monozyten (CD45+/CD14+). Die Lymphozytenpopulation wurde dann weiter unterteilt in T-Zellen (CD3+, mögliche Auftrennung in CD4+/CD8+), B-Zellen (CD19+) und NK Zellen (CD56+, CD3-, CD19-). Da die Bindung des CD20 Antikörpers Rituximab über den Fcγ-Rezeptor CD16 vermittelt wird, wurden die NK Zellen, T Zellen und Monozyten zusätzlich hinsichtlich ihrer CD16 Expression analysiert. Zudem wird die CD56 Expression in T-Zellen und Monozyten mit Tumorerkrankungen assoziiert, sodass diese Zellpopulationen auch auf ihre CD56-Expression hin untersucht wurden. Zum Zeitpunkt der Diagnosestellung ergaben sich für den prozentualen Anteil der NK und B Zellen (gemessen an den CD45+ Leukozyten) keine Unterschiede im Vergleich zu gesunden Spendern. Der Anteil an Granulozyten und T-Zellen war überraschenderweise verringert und der Anteil an Monozyten erhöht. Hier war insbesondere auch der Anteil der CD16+ Monozyten im Vergleich zu gesunden Spendern erhöht und korrelierte negativ mit der Prognose der Patienten. Zudem zeigte sich ein zusätzlicher Anstieg der CD16+ Monozyten über den Therapieverlauf. Funktional wurde in dieser Studie das Tötungsverhalten von NK und T-Zellen im Populationskillingassay untersucht. Als Zielzelllinien wurden MHC I-defiziente K562-Zellen (natürliche Zytotoxizität) und die CD20+ DLBCL-Zelllinie U-2932 verwendet. Das Killing der U 2932 wurde über Rituximab vermittelt, wobei der Fc-Teil an CD16+ NK bzw. T Zellen bindet, um eine Antikörper-abhängige zellvermittelte Zytotoxizität (ADCC) zu induzieren. Hierbei zeigte sich keine veränderte Zytotoxizität der NK Zellen sowohl im Therapieverlauf als auch im Vergleich zu gesunden Kontrollspendern. Das T-Zellkilling war hingegen sowohl Rituximab spezifisch gegen U 2932 als auch gegen K562 Zellen zum Zeitpunkt der Diagnosestellung im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant erhöht. Die für diese Zytotoxizität verantwortlichen Zellen sind wahrscheinlich unkonventionelle T-Zellen, wie NKT-Zellen oder T-Zellen. Diese Zellen lysieren ihre Zielzelllinien Antigen-unspezifisch und werden mit wichtigen Funktionen bei der Tumorimmunität in Zusammenhang gebracht. Die genaue Bestimmung der verantwortlichen Zellen ging über den Rahmen dieser Studie hinaus, wird aber innerhalb unserer Arbeitsgruppe weiter untersucht, da das Vorhandensein der Zellen im Blut bei DLBCL Patienten ein wichtiger immunologischer Parameter sein könnte.
Mit dieser Studie wurde die Aufreinigung, die durchflusszytometrische und funktionelle Analyse von Blutproben von DLBCL Patienten in unserem Labor grundlegend etabliert. Daraus haben sich Folgearbeiten, wie die genetische Untersuchung unterschiedlicher Polymorphismen, Zytokin- und Vitamin D-Spiegel Analysen im Plasma und die Bestimmung weiterer Oberflächenrezeptoren, z.B. mittels CyTOF, ergeben. Damit erhoffen wir uns weitere immunologisch relevante Unterschiede zu finden bzw. die in dieser Studie bereits gefundenen Unterschiede genauer zu charakterisieren, um eine diagnostische oder prognostische Relevanz bestimmen zu können.The standard therapy for the common diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) is a combination of chemotherapy (CHOP) with the additional use of the therapeutic anti CD20 antibody Rituximab. Nevertheless, approximately 30-50 % of patients develop a relapse or become refractory. Therefore, a better prognostic assessment of patients represents an important step in the development of individualized therapy for non-Hodgkin lymphoma.
Within this work, 27 ml EDTA blood (3 x 9 ml) each from a total of 33 DLBCL patients were analysed at different time points (diagnosis, course of therapy and follow-up) to obtain an overview of quantitative and qualitative changes of the immune cells circulating in the blood. The blood samples taken at the time of "diagnosis" served as the reference point and was compared with blood samples from healthy controls. In the further course, when clinically possible, the blood of each patient was analysed every 6-8 cycles of R-CHOP before rituximab administration. After therapy, blood sampling followed every three months at the follow-up appointment, so that the first patient included in this study had already been examined over a period of three years. PBMC (peripheral blood mononuclear cells) were purified from all blood samples and analysed by flow cytometry. The following subpopulations were identified by using different antibodies and an appropriate gating strategy: leukocytes (singlets, CD45+), granulocytes (FSC A/SSC-A), lymphocytes (CD45+/CD14-) and monocytes (CD45+/CD14+). The lymphocyte population was then further subdivided into T cells (CD3+, possible separation into CD4+/CD8+), B cells (CD19+) and NK cells (CD56+, CD3-, CD19-). Since the binding of the CD20 antibody rituximab is mediated by the Fcγ receptor CD16, the NK cells, T cells and monocytes were additionally analysed for their CD16 expression. In addition, CD56 expression in T cells and monocytes is associated with tumour disease, consequently these cell populations were also analysed for CD56 expression. At the time of diagnosis, there were no differences in the percentage of NK and B cells (measured by CD45+ leukocytes) compared with healthy donors. Surprisingly, the percentage of granulocytes and T cells was decreased and the percentage of monocytes was increased. In particular, the proportion of CD16+ monocytes was also increased compared to healthy controls and correlated negatively with the prognosis of the patients. Furthermore, an additional increase of CD16+ monocytes was shown over the course of therapy. Functionally, this study investigated the killing behaviour of NK and T cells in the population killing assay. MHC I-deficient K562 cells (natural cytotoxicity) and the CD20+ DLBCL cell line U-2932 were used as target cell lines. Killing of U 2932 was mediated via rituximab, with the Fc portion binding to CD16+ NK or T cells to induce antibody-dependent cell mediated cytotoxicity (ADCC). Here, there was no altered cytotoxicity of NK cells both during the course of therapy and compared to healthy controls. In contrast, T cell killing was significantly increased, both rituximab-specific against U-2932 and against K562 cells at the time of diagnosis compared to the control group. These cells lyse their target cell lines in an antigen-unspecific manner and are associated with important functions in tumour immunity. The exact determination of the responsible cells was outside the frame of this study, but will be further investigated within our group, as the presence of these cells in the blood might be an important immunological parameter in DLBCL patients.
This study fundamentally established the purification, flow cytometric and functional analysis of blood samples from DLBCL patients in our laboratory. This has resulted in follow-up work, such as the genetic investigation of different polymorphisms, cytokine and vitamin D level analyses in plasma, and the determination of additional surface receptors, e.g., by CyTOF. Thus, we hope to find further immunologically relevant differences or rather to characterize the differences already found in this study more precisely in order to be able to determine a diagnostic or prognostic relevance.DFG; SFB89
Killing efficiency of natural killer cells is boosted by physical contact with T cells
No full textNatural killer (NK) cells are killer cells from the innate immune system responsible for eliminating pathogen-infected or tumorigenic cells. T cells are the central players in the adaptive immune system, including T helper CD4+ T cells and cytotoxic CD8+ T cells. However, how the interaction between NK cells with T cells influences NK cell killing efficiency still largely unknown. To tackle this question, in this work, I co-cultured primary NK cells with activated T cells and examined NK cell killing efficiency. I found that an in vitro co-culture with activated T cells, both CD4+ and CD8+, greatly enhances the killing efficiency of homologues NK cells against different types of tumor cell lines. Co-culture with T cells did not affect NK cells on the expressions of cytolytic proteins (perforin and granzymes) or the degranulation of lytic granules. Instead, T cell co-culture greatly enhanced speed and persistence of NK cell migration as well as NK cell infiltrating capability into 3D collagen matrices. The T cell-induced NK activation can be achieved in 24-hour-co-culture and lasts for several days. I have further identified that physical contact between NK and T cells is indispensable. Blockade of IL-2 receptor using neutralizing antibody abolished enhancement in NK cell killing boosted by T cells. Nether conditional medium from activated T cells nor addition of IL-2 could resemble the extent of T cell boosted NK cell killing, indicating that local IL-2 plays a critical role in this regard. Moreover, ICAM-1/LFA-1 interaction is also involved in boosting NK cell functions by T cells. Surface molecule profiling from CyTOF analysis revealed distinct subsets in T cell boosted NK cells. RNAseq data show that cytoskeletal elements and related molecules as well as metabolic pathways were significantly altered by T cell co-culture. These findings extend the understanding of the T-NK cell interaction mechanism and provide valuable insights into the link between important players from both innate and adaptive immunity.Natürliche Killerzellen (NK) sind zelluläre Bestandteile des angeborenen Immunsystems, die eine wichtige Rolle bei der Beseitigung von mit Krankheitserregern infizierten oder tumorbildenden Zellen spielen. Auf der anderen Seite sind T-Zellen die Hauptakteure des adaptiven Immunsystems, zu denen CD4+ T-Helferzellen und zytotoxische CD8+ T-Zellen gehören. Obwohl die Interaktion zwischen NK-Zellen und T-Zellen die Tötungseffizienz der NK-Zellen beeinflusst, ist dieser Mechanismus noch weitgehend unerforscht. Im Rahmen dieser Studie habe ich primäre NK-Zellen mit aktivierten T-Zellen in einer Ko-Kultur untersucht, um die Auswirkungen auf die Tötungseffizienz der NK-Zellen zu untersuchen. Die Ergebnisse zeigen, dass die In-vitro-Kokultur mit aktivierten T-Zellen, sowohl CD4+ als auch CD8+, die Tötungseffizienz der NK-Zellen gegen verschiedene Tumorzelllinien signifikant erhöht. Es wurde festgestellt, dass diese Ko-Kultur weder die Expression von zytotoxischen Proteinen wie Perforin und Granzyme noch die Degranulation der lytischen Granula beeinflusst. Stattdessen erhöht die Ko-Kultur mit T-Zellen die Geschwindigkeit und Ausdauer der Migration der NK-Zellen sowie deren Fähigkeit, in dreidimensionale Kollagenmatrizes einzudringen. Die Aktivierung der NK-Zellen durch T-Zellen kann bereits innerhalb von 24 Stunden in der Ko-Kultur erreicht werden und hält mehrere Tage an. Des Weiteren wurde festgestellt, dass der direkte physische Kontakt zwischen NK- und T-Zellen unerlässlich ist. Die Blockade des IL-2-Rezeptors mit einem neutralisierenden Antikörper hebt die Verstärkung der NK-Zellabtötung durch T-Zellen auf. Weder das konditionierte Medium von aktivierten T-Zellen noch die Zugabe von IL-2 allein konnten das Ausmaß der verstärkten NK-Zellabtötung durch T-Zellen erreichen, was darauf hinweist, dass lokales IL-2 in diesem Zusammenhang eine entscheidende Rolle spielt. Darüber hinaus spielt die Interaktion von ICAM-1/LFA-1 eine bedeutende Rolle bei der Verstärkung der NK-Zellfunktionen durch T-Zellen. Durch die Anwendung der CyTOF-Analyse konnten Oberflächenmolekülprofile erstellt werden, die unterschiedliche Untergruppen in den NK-Zellen aufzeigten, die durch T-Zellen verstärkt wurden. Zusätzlich zeigten RNAseq-Daten signifikante Veränderungen in Elementen des Zytoskeletts, verwandten Molekülen und Stoffwechselwegen durch die Ko-Kultur mit T-Zellen. Diese Erkenntnisse erweitern das Verständnis des Interaktionsmechanismus zwischen T- und NK-Zellen und liefern wertvolle Informationen über die Verbindung zwischen den maßgeblichen Akteuren des angeborenen und des adaptiven Immunsystems
- …
