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Enumeration of verocytotoxigenic Escherichia coli (VTEC) O157 and O26 in milk by quantitative PCR
No full textQuantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR) can be a convenient alternative to the Most Probable
Number (MPN) methods to count VTEC in milk. The number of VTEC is normally very low in milk; therefore
with the aim of increasing the method sensitivity a qPCR protocol that relies on preliminary enrichment was
developed. The growth pattern of six VTEC strains (serogroups O157 and O26) was studied using enrichment
in Buffered Peptone Water (BPW) with or without acriflavine for 4–24 h. Milk samples were inoculated with
these strains over a five Log concentration range between 0.24–0.50 and 4.24–4.50 Log CFU/ml. DNA was
extracted from the enriched samples in duplicate and each extract was analysed in duplicate by qPCR using
pairs of primers specific for the serogroups O157 and O26. When samples were pre-enriched in BPW at 37 °C
for 8 h, the relationship between threshold cycles (CT values) and VTEC Log numbers was linear over a five Log
concentration range. The regression of PCR threshold cycle numbers on VTEC Log CFU/ml had a slope coefficient
equal to −3.10 (R2 = 0.96) which is indicative of a 10-fold difference of the gene copy numbers between
samples (with a 100 ± 10% PCR efficiency). The same 10-fold proportion used for inoculating the milk samples
with VTECwas observed, therefore, also in the enriched samples at 8 h. A comparison of the CT values of milk samples
and controls revealed that the strains inoculated in milk grew with 3 Log increments in the 8 h enrichment
period. Regression lines that fitted the qPCR and MPN data revealed that the error of the qPCR estimates is lower
than the error of the estimatedMPN (r= 0.982, R2= 0.965 vs. r= 0.967, R2= 0.935). The growth rates of VTEC
strains isolated frommilk should be comparatively assessed before qPCR estimates based on the regressionmodel
are considered valid. Comparative assessment of the growth rates can be done using spectrophotometric
measurements of standardized cultures of isolates and reference strains cultured in BPW at 37 °C for 8 h. The
method developed for the serogroups O157 and O26 can be easily adapted to the other VTEC serogroups that
are relevant for human health. The qPCR method is less laborious and faster than the standard MPN method
and has been shown to be a good technique for quantifying VTEC in milk
PREVALENZA DI ESCHERICHIA COLI PRODUTTORI DI VEROCITOTOSSINE IN BOVINI MACELLATI IN EMILIA ROMAGNA.
No full textQuesta ricerca mira a valutare la prevalenza di VTEC O157 e non-O157 in bovini regolarmente macellati.119 campioni di pelle e 83 di carcasse bovine, provenienti da macelli dell’Emilia Romagna, sono stati arricchiti in EC-broth ed analizzati mediante PCR per individuare i geni VT1 e VT2, impiegando primer MK1 (TTTACGATAGACTTCTCGAC) e MK2 (CACATATAAATTATTTCGCTC). Colture in MacConkey Agar col numero più alto di colonie isolate, ottenute dagli arricchimenti positivi allo screening, sono state utilizzate per l’isolamento. L’identificazione delle colonie batteriche è stata fatta mediante ibridazione con sonde DNA marcate con digossigenina e complementari alle sequenze genetiche VT1 e VT2.Il 42% (50/119) delle pelli bovine ed il 4,2% (4/83) delle carcasse bovine sono risultati positivi al test di screening. Test con arricchimenti artificialmente contaminati con circa 200 UFC/mL VTEC risultano costantemente positivi. L’isolamento di VTEC è stato possibile solo in 13 dei 50 campioni positivi allo screening (26%) e mai nelle carcasse (0/4). Dei tredici isolati nove erano positivi per il gene VT2, sei per VT1 e due per entrambi. Nove degli isolati VT-positivi lo erano anche per HlyA e due di essi erano eaeA-positivi. La prevalenza di VTEC appare relativamente elevata al test PCR di screening (42%). La sensibilità del metodo PCR è presumibilmente <1 UFC/mL nel campione iniziale, considerando l’effetto dell’arricchimento. La sensibilità del metodo d’isolamento è influenzata dalla necessità di utilizzare diluizioni degli arricchimenti per ovviare alla prevalenza di coliformi non-VTEC e altri batteri che crescono nell’agar MacConkey. La dimostrazione delle intimine è stata limitata alle varianti riconducibili al tipo eaeA, ma potrebbero esservi adesine diverse e, comunque, la potenziale patogenicità di ceppi con genotipo eae-negativo è stata documentata in letteratura
A Rapid Enzyme-Linked Immunomagnetic Electrochemical (ELIME) Assay for the Detection of Escherichia coli O26 in Raw Milk
No full textIn this work we present a magnetic bead–based immunosensorss for the determination of Escherichia coli O26 in milk. The assay uses commercial Dynabeads® for the capture of the target bacteria from 6-h enrichment broth and horseradish peroxidase–labelled polyclonal antibodies and detection of the peroxidase activity by chronoamperometry. Bovine seroalbumin was used as blocking reagent for reducing the binding of non-specific antibodies to the beads and/or other bacteria. The effectiveness of the enzyme-linked immunomagnetic electrochemical (ELIME) assay to detect low number of E. coli O26 in milk was demonstrated using spiked milk samples from five different lots with concentrations of 9.00–18.80 or 0.90–1.88 CFU in 25 mL. Three repetitions for each concentration were analysed in parallel also by real-time PCR following the standard method ISO/TS 13136:2012, using 24-h enriched cultures. Results demonstrated that the ELIME assay can reduce the time for analyses to one working day and produce reliable results that can be confirmed by overnight cultures of the beads-bacteria complexes allowing further characterization of the virulence, including the presence of Shiga toxin–encoding genes, which is important to discriminate the enterohaemorrhagic strains
Information management and ante-mortem inspection procedures for the emerging diseases control: Experiences acquired in the epidemiological surveillance of bluetongue and lumpy skin disease
No full textThe spread of exotic, emerging and reemerging diseases, has become, in the last years, one of the most important threats to the animal productions and public health, representing a new challenge for the European Community. In a global-market framework, where trade and contacts between countries are simplified, effective and well-developed surveillance systems are necessary. Multiple factors are, in fact, associated with the emergence of new, known or exotic diseases in this new economic panorama and for these reasons controls on animal imports, traceability and timeliness detection of infected animals should be considered the basis of a sound surveillance. In this work, we focused our attention on the management of Bluetongue and on the risk of introduction of the Lumpy Skin Disease in Italy, in order to describe the national and European surveillance systems for these diseases. In particular, we underlined the crucial role of information that reach the Official Veterinarian at the slaughterhouse concerning the epidemiological situation of the sending countries. Information that are important for the management of the ante-mortem inspection and for increasing the awareness of the Veterinary Inspectors of their role in the surveillance
Stipiti di Escherichia coli produttori di Shiga-tossine: variabili confondenti nella stima del rischio
No full textObiettivo della ricerca eseguita
Valutare la prevalenza di Escherichia coli produttori di Shiga tossine negli animali al macello e nel latte crudo. Confrontare i risultati ottenuti attraverso procedure analitiche diverse, basate su tecniche colturali in combinazione con metodi d'immuno-concentrazione o su tecniche molecolari (PCR e VIDAS Ice) per lo screening dei campioni e per il riconoscimento degli isolati (ibridazione con sonde DNA). Valutare le caratteristiche di performance delle tecniche analitiche nelle matrici animali e alimentari in funzione dei diversi sierotipi virulenti oggetto delle analisi, al fine di comprendere quali procedure di screening e d'isolamento si mostrano più vantaggiose e per valutare il potenziale di falsi positivi o falsi negativi in rapporto ai livelli di contaminazione e alla natura delle matrici analizzate. Definire il
profilo di virulenza degli isolati, inclusa l'antibiotico-resistenza e il patotipo e ricercare la presenza di batteriofagi vettori del gene STX2. Valutarne inoltre la potenzialità di infettare ceppi EPEC presenti nelle stalle. L'articolazione del progetto tra i vari gruppi di ricerca prevedeva la collaborazione nell'attuazione delle
diverse procedure di caratterizzazione degli isolati, ma anche l'utilizzo di un comune test di screening PCR, basato sul protocollo Food PCR Project PL QLRT-1999-00226, per la ricerca dei geni STx1 e 2 negli arricchimenti selettivi dei campioni di pelle e carcassa (bovini ed ovini) latte (di vacca, pecora e capra) e filtri delle mungitrici meccaniche (laddove utilizzati). Lo scambio di aliquote concentrate degli arricchimenti, positivi e negativi e l'impiego di controlli interni costituiti da DNA target a concentrazione nota in campioni risultati negativi intendeva fornire ai diversi partecipanti al progetto collaborativo la possibilità di confrontare la riproducibilità di questa tecnica di screening ed individuare i campioni sospetti da poter saggiare con le diverse procedure analitiche
Valutazione dei livelli di metalli e metalloidi nelle carni avicole e nella selvaggina
No full textIl nostro studio mira a determinare i livelli di contaminazione da cadmio e da piombo nelle carni di pollame. I campioni saranno raccolti in Romagna, una regione che ha in Italia una notevole rilevanza per tale produzione. Saranno valutati i fattori che incidono sulla variabilità, quali i mangimi, la zona e le procedure di allevamento, operando in collaborazione con una grossa industria di macellazione che è disposta a fornire i dati relativi ai polli e ai tacchini macellati, provenienti da diverse zone del nord est dell’Italia. Per l’analisi dei metalli in tracce sarà utilizzata la tecnica di stripping anodico. Uno studio preliminare servirà ad ottimizzare le condizioni utili ad eseguire analisi precise e ripetibili, in grado di soddisfare i requisiti specificati dalla Direttiva 2001/22 dell'UE, che riguarda i metodi di campionamento ed analisi di piombo, cadmio ed altri agenti contaminanti negli alimenti. Successivamente saranno eseguiti almeno sessanta - settanta campioni del pollame (pollo e tacchino). Sulla base di questi dati saranno valutati i fattori che condizionano la variabilità (ed il grado d’incertezza). Combinando i nostri dati con i risultati dei programmi di nazionali di monitoraggio e con i dati sui consumi alimentari sarà valutato il contributo delle carni di pollame nei riguardi dell’esposizione al piombo ed al cadmio.
Sarà fatto anche uno studio preliminare per stimare i livelli di Arsenico cui la popolazione italiana è esposta attraverso il consumo di queste carni. La tecnica voltammetrica è stata utilizzata con successo, in studi recenti sull’acqua di mare e sui molluschi, per determinare la contaminazione da arsenico e per specificare la natura dei composti arseniosi contaminanti (forma organica/inorganica, forma trivalente o pentavalente). Questa metodologia a parer nostro potrebbe essere adattata all’analisi di carni di pollo, in combinazione con procedure di purificazione utili a ridurre l'interferenza di altri metalli quali il rame, che è abbondante nei campioni di fegato. Durante il primo anno questa metodologia sarà messa a punto e ci si attende che possa essere più vantaggiosa, in termini di tempi e costi dell’analisi, a confronto con altre metodologie oggi utilizzate quali la “inductively coupled plasma mass spectrometry” o la “ion-chromatography” combinata con la “hydride-generation atomic spectrometry”. Durante il secondo anno del progetto saranno analizzati alcuni campioni prelevati da animali macellati di diversa provenienza.
Insieme alle determinazioni sul pollame, oggetto di allevamento intensivo, effettueremo determinazioni identiche su campioni di carne di selvaggina che vive e viene macellata in Romagna e su campioni di selvaggina che saranno prelevati dall'unità di ricerca del Università di Milano. Questi dati permetteranno una valutazione dei livelli di contaminazione nell'ambiente naturale
Le emergenze da agenti microbici: il ruolo della sorveglianza veterinaria e dell'HACCP
No full textsono descritte le condizioni e le cause che portano alla emergenza e riemergenza di malattie infettive d'interesse per la sanità pubblica veterinari
VALUTAZIONE DEL RISCHIO NELLA PRODUZIONE E COMMERCIALIZZAZIONE DELLE CARNI E METODI DI CONTROLLO IGIENICO SANITARIO
No full textL'obiettivo generale del programma di ricerca è quello di sviluppare metodologie e realizzare studi per valutare i principali rischi connessi alla produzione delle carni fresche di suino, bovino e pollame. In particolare mira a sviluppare metodi analitici per la ricerca di Salmonella, Campylobacter, Escherichia coli produttori di verocitotossine e di Listeria monocytogenes e a fare indagini epidemiologiche utili a definire la prevalenza di animali infetti e le modalità di contaminazione delle carni nei macelli. Si valideranno con prove in campo le procedure sviluppate, basate sull'impiego di tecniche biomolecolari quali la PCR, l'utilizzo di tecniche d'ibridazione su membrana e l'impiego di biosensori elettrochimici. Si condurranno studi epidemiologici utili a definire la prevalenza dei principali agenti zoonoscici che riguardano la filiera di produzione del suino, del bovino e del pollo, a caratterizzare gli isolati e definire le modalità di contaminazione delle carni e le strategie utili per controllarla. Si realizzerà un modello quantitativo di stima dell'esposizione relativo alla probabilità di assunzione di Campylobacter termofili mediante carni di pollame. Si metteranno a punto metodi di screening per l'individuazione di bovini sottoposti a trattamenti ormonali illeciti, impiegando tecniche istopatologiche ed immunoistochimiche, che abbiano una migliore performance rispetto alle tradizionali tecniche istologiche. Si metteranno a punto tecniche per evidenziare trattamenti illeciti di sanificazione che si applicheranno al controllo di carni refrigerate sottovuoto importate da paesi extracomunitari in cui queste tecniche sono comunemente utilizzate
Detection and Characterization of Histamine-Producing Strains of Photobacterium damselae subsp. damselae Isolated from Mullets
No full textPhotobacterium damselae subsp. damselae (Pdd) is considered to be an emerging pathogen of marine fish and has also been implicated in cases of histamine food poisoning. In this study, eight strains isolated from mullets of the genera Mugil and Liza captured in the Ligurian Sea were characterized, and a method to detect histamine-producing Pdd from fish samples was developed. The histamine-producing potential of the strains was evaluated in culture media (TSB+) using a histamine biosensor. Subsequently, two strains were used to contaminate mackerel fillets (4 or 40 CFU/g), simulating a cross-contamination on the selling fish stalls. Sample homogenates were enriched in TSB+. The cultures were then inoculated on thiosulfate-citrate-bile salts-sucrose agar (TCBS) and the dark green colonies were cultured on Niven agar. The violet isolates were characterized using specific biochemical and PCR based tests. All Pdd strains were histamine producers, yielding concentration varying from 167 and 8977 µg/mL in TSB+ cultures incubated at 30 °C for 24 h. Pdd colonies were detected from the inoculated mackerel samples and their histidine decarboxylase gene was amplified using species-specific primer pairs designed for this study. The results indicate that mullets can be source of Pdd and the fish retailers needs to evaluate the risk posed by cross-contamination on the selling fish stalls
Effects of Beeswax Coating on the Oxidative Stability of Long-Ripened Italian Salami
No full textBeeswax coating of foods put a barrier to oxygen, light, and vapour that can help to prevent oxidation of fat and pigments and water loss. The amounts of 2-thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) and water activity (Aw) were assessed in Italian salami coated with beeswax at 55 days of ripening and compared with controls at 5, 6, and 7 months of shelf life. The results were correlated with sensory quality. TBARS levels were below 0.8 mg kg−1 in the beeswax-coated salami until 6 months of aging (median 0.697, max 0.795) and significantly higher in the uncoated salami (median 1.176, max 1.227). A slight correlation between the amount of TBARS and Aw was observed in beeswax-coated salamis, whereas this effect was masked in controls by the large Aw variability observed at 7 months. Beeswax coating prevents case hardening and facilitated the peeling
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