1,721,112 research outputs found
Stammentwicklung zur heterologen Expression von Sekundärstoffclustern in Aktinobakterien
No full textIn this study we could show the biosynthetic potential of the genus Streptomyces by sequencing the genome of Streptomyces fulvissimus, which revealed 32 putative biosynthetic gene clusters. We were able to elucidate the biosynthesis of the macrodiolide antibiotic pamamycin by knocking out responsible genes in the pamamycin biosynthetic cluster and analyzing the resulting intermediates. We could show that succinyl-CoA is utilized as a starter unit and either malonyl-CoA, methylmalonyl-CoA or ethylmalonyl-CoA are used as extender units in pamamycin biosynthesis. The knowledge of the pamamycin biosynthesis was used to engineer our heterologous host, the model organism Streptomyces albus J1074, in a specific direction. We focused our efforts to reduce or abolish the cellular concentration of methylmalonyl-CoA and ethylmalonyl-CoA in S. albus J1074 to reduce the compound spectrum of produced pamamycins. We could greatly influence the compound spectrum and we could identify the bottleneck of pamamycin production as succinyl-CoA. We could also prove that the metabolism of valine is the sole provider for the biosynthesis of pamamycin. Furthermore we could show the dependency of antibiotic production on gene dosage and we could increase the production of several secondary metabolites by increasing the number of clusters present on the genome.Wir konnten das genetische Potential des Genus Streptomyces anhand der kompletten Genom-Sequenz von Streptomyces fulvissimus, der 32 putative Biosynthese-Gencluster besitzt, zeigen. Außerdem konnten wir die Biosynthese des Makrodiolid-Antibiotikums Pamamycin aufklären, indem die für die Biosynthese verantwortlichen Gene ausgeknockt und die daraus entstandenen Intermediate nachgewiesen wurden. In der Pamamycin-Biosynthese wird Succinyl-CoA als Startereinheit verwendet, auf welche entweder Malonyl-CoA, Methylmalonyl-CoA oder Ethylmalonyl-CoA als weitere Bausteine folgen können. Dieses Wissen nutzten wir, um unseren heterologen Stamm Streptomyces albus J1074 gezielt zu verändern. Unser Ziel war es, die intrazellulären Konzentrationen von Methylmalonyl-CoA und Ethylmalonyl-CoA in S. albus zu verringern um das Substanzspektrum der produzierten Pamamycine einzuschränken. Wir konnten das Substanzspektrum der produzierten Pamamycine stark beeinflussen, dadurch Succinyl-CoA als den limitierenden Faktor der Biosynthese identifizieren, und nachweisen, dass sich die Pamamycin-Biosynthese ausschließlich aus dem Metabolismus von Valin speist. Durch das Einbringen mehrerer Biosynthesegencluster in denselben genetischen Hintergrund konnten wir die Produktion verschiedener Antibiotika steigern und dadurch zeigen, dass die Sekundärstoffproduktion von der Anzahl der Gencluster abhängig ist
New natural products from Actinobacteria : potential and constraints of heterologous expression in Streptomyces hosts
Full text linkNaturstoffe finden breite Anwendung als Antiinfektiva oder Krebstherapeutika. Eine reiche Quelle für solche Naturstoffe sind Bakterien aus der Ordnung Actinomycetales. Weit verbreitete Arzneistoffe, wie zum Beispiel Erythromycin oder Tetracyclin, wurden aus Actinomyceten isoliert. Die vorliegende Arbeit beschreibt die Entdeckung von drei neuen Naturstoffen aus Actinomyceten. Die neuen Moleküle Loseolamycin, Dudomycin und Bonsecamin wurden mittels Expression von Genen in einem Heterologen Wirt entdeckt. Die Beispiele in dieser Arbeit zeigen deutlich die Vorteile wie auch die Schranken dieser Technik für die Entdeckung neuer Moleküle auf. Neben der Darlegung der Entdeckung und Aufreinigung der Moleküle wird in dieser Arbeit auch die Anwendung von Methoden wie Massenspektrometrie zur Molekülcharakterisierung beschrieben. Gendeletionen sowie die Nutzung von individuellen Kulturmedien halfen, die Biosynthese von Loseolamycin, Dudomycin und Bonsecamin in den jeweiligen Actinomyceten aufzuklären. Des Weiteren wurden Bioaktivitätstests durchgeführt, um mögliche Anwendungen der neuen Moleküle in Medizin oder der Landwirtschaft zu erforschen. Diese Experimente lieferten vielversprechende Ergebnisse für eine der neuen Substanzen.Natural products (NPs) are widely used as anti-infective or anticancer drugs. A prolific source for new natural products are bacteria of the biological order of actinomycetales. As a matter of fact, numerous well-established drugs such as erythromycin or tetracycline are actinomycete products. The present thesis describes the discovery of three new natural products from actinomycetes. The novel molecules loseolamycin, dudomycin and bonsecamin were discovered using the approach of gene cluster expression in a heterologous host. The examples in this work clearly show the advantages as well as the boundaries of heterologous expression in the discovery of new natural products. Besides the molecules’ discovery and isolation, this work describes the use of methods such as high resolution mass spectrometry to characterize the new NPs. Gene deletion experiments as well as the cultivation in customized media helped to elucidate the biosynthesis of the new molecules in the actinomycetes. Further, bioactivity tests were also performed to explore potential applications of loseolamycin, dudomycin and bonsecamin in medicine or agriculture and led to interesting results in one case
Heterologe Üperproduktion von neuen Naturstoffen in Streptomyceten
No full textSecondary metabolites, often referred to as natural products (NPs), produced by Actinobacteria (mostly by Streptomyces) are a major source for antibiotics and other drugs. The genome data of Actinobacteria revealed their great biosynthetic potential to be far from fully exploited. The major reason is that most corresponding biosynthetic gene clusters responsible for the NP production remain “silent” under laboratory conditions or their expression level is too low for the detection and isolation of new molecules. The first part of this thesis is focussing on the discovery, isolation and characterisation of the new NPs cyclofaulknamycin and aorimycins. The discovery of cyclofaulknamycin shows that even well described model organisms like Streptomyces albus J1074, which is under investigations in hundreds of laboratories worldwide, have the potential to still conceal unknown bioactive molecules. This applies even more for newly isolated bacteria, which was shown by the example of the novel NPs aorimycins. The second part focusses on known compounds with unknown pharmaceutical potential. One of the main reasons for that is a low production yield resulting in supply shortage for the profiling of compounds. Herein, a method is tested which utilised random rational designed promoters to increase the NP production level. By the use of this method new derivatives were isolated and further characterised.Sekundärmetabolite, die oft als Naturstoffe bezeichnet werden, werden oft von Actinobakterien (meist von Streptomyceten) produziert und sind eine wichtige Quelle für Antibiotika und andere Arzneimittel. Die Genomdaten von Actinobakterien haben gezeigt, dass ihr großes biosynthetisches Potenzial noch nicht ausgeschöpft ist. Der Hauptgrund dafür ist, dass die meisten für die Naturstoffproduktion verantwortlichen biosynthetischen Gencluster unter Laborbedingungen nicht aktiv sind oder ihr Expressionsniveau zu niedrig ist, um neue Moleküle nachweisen zu können. Der erste Teil dieser Arbeit befasst sich mit der Entdeckung, Isolierung und Charakterisierung der neuen Naturstoffe Cyclofaulknamycin und Aorimycin. Die Entdeckung von Cyclofaulknamycin zeigt, dass selbst gut beschriebene Modellorganismen wie Streptomyces albus J1074, die in hunderten von Laboren weltweit untersucht werden, noch unbekannte bioaktive Moleküle verbergen können. Dies gilt umso mehr für neu isolierte Bakterien, was am Beispiel der neuartigen Aorimycine gezeigt wurde. Der zweite Teil konzentriert sich auf bekannte Verbindungen mit unbekanntem pharmazeutischem Potenzial. Einer der Hauptgründe dafür ist die geringe Produktionsausbeute, die zu Engpässen bei der Profilierung von Verbindungen führt. Hier werden zufällig-rational konzipierte Promotoren eingesetzt, um die Naturstoff-Produktion zu steigern. Mit Hilfe dieser Methode wurden neue Derivate isoliert und weiter charakterisiert
The engineering of heterologous host for natural products overproduction
Full text linkStreptomyces are a prolific source of diverse bioactive natural products. However, most of the corresponding biosynthetic gene clusters are expressed poorly under laboratory conditions. Therefore, the optimized host strains for heterologous expression of biosynthetic gene clusters and the production of natural products in sufficient yields are in great need. The first part of this thesis is dedicated to the optimization of the S. albus host strain to increase the natural product production titers through ribosomal engineering. For the first time, we showed that ribosomal engineering has a significant impact on the whole transcriptome of the cell, what, in turn, has a strong effect on the expression level of indigenous and heterologously expressed biosynthetic gene clusters. The second part is dedicated to RiPPs natural products derivatization in Streptomyces hosts via two approaches: the stop-codon suppression and rational codon randomization. By using the first approach, we succeed in incorporating unnatural amino acids into a potent lantibiotic cinnamycin and have obtained five new derivatives. The platform for rational codon randomization was developed, enabling the fast and efficient derivatization of an anticancer RiPP thioholgamide A. These two approaches proved to be efficient for the RiPPs derivatization and might find its application in bio-orthogonal chemistry, target fishing, and improvement of the pharmacokinetics of the RiPP lead compounds.Streptomyceten sind eine ergiebige Quelle diverser, bioaktiver Naturstoffe. Jedoch werden die meisten dazugehörigen biosynthetischen Gencluster nur geringfügig unter Laborbedingungen exprimiert. Daher sind optimierte Wirtstämme für die heterologe Expression von Genclustern und Produktion der Naturstoffe in ausreichender Menge von großem Bedarf. Der erste Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit der Optimierung des Wirtstammes S. albus, um die Produktion mittels Veränderungen auf ribosomaler Ebene zu erhöhen. Zum ersten Mal zeigen wir, dass Veränderungen dieser Art einen signifikanten Einfluss auf das gesamte Transkriptom der Zelle haben, was wiederum einen starken Effekt auf das Expressionslevel von eigenen und heterolog exprimierten Clustern ausübt. Der zweite Teil beschäftigt sich mit der Derivatisierung von RiPP-Naturstoffen in Streptomyceten über zwei Ansätze: Stopp-Codon-Unterdrückung und rationale Codon- Randomisierung. Unter Nutzung des ersten Ansatzes konnten wir erfolgreich unnatürliche Aminosäuren in das wirksame Lantibiotikum Cinnamycin einbauen und erhielten fünf neue Derivate. Die rationale Codon-Randomisierung wurde entwickelt und ermöglicht die schnelle und effiziente Derivatisierung des antikanzerogenen RiPP Naturstoffes Thioholgamid A. Beide Ansätze sind effiziente Methoden zur Derivatisierung von RiPP-Naturstoffen und könnten Anwendung in der bio-orthogonalen Chemie, „target fishing“ und bei der Verbesserung der Pharmakokinetik der RiPP-Leitstrukturen finden
Metabolic and genomic profiling of actinobacteria strains : from new natural products to biosynthetic pathways
Full text linkMarine actinomycetes are known to be a promising source for new natural products with putative application as therapeutic agents. Thus, the exploitation of novel discovered actinomycetes strains remains in the focus of NP research. The presented thesis deals on the one hand with the isolation and structural characterization of new NPs produced by streptomycetes species. On the other hand, the construction of a novel biosensor concept for the detection of secondary metabolite production is discussed. New spiroindimicins E and F were isolated from the Streptomyces sp. MP131-18 and structures were confirmed by NMR. Additionally, two new lagunapyrones D and E were identified by characteristic MS/MS fragmentation. The genome of MP131-18 has been sequenced and the gene cluster, responsible for the synthesis of bisindole compounds has been identified and connected to lynamicins/spiroindimicin production. Furthermore, four new alpiniamides B-D have been isolated from the Streptomyces sp. IB 2014/11-12. The sequenced genome enabled the identification of the gene cluster responsible for alpiniamide production. The predicted biosynthetic pathway was confirmed by feeding experiments and gene deletions in a heterologous host. Finally, a contribution to the construction of a repressor-based biosensor, which detects the products of awakened silent gene clusters in streptomycetes, has been made. This concept was successfully applied to the activated coelimycin gene cluster. Marine Aktinomyceten stellen eine beliebte Quelle neuer Naturstoffe dar, welche unter Umständen Anwendung als therapeutische Arzneimittel finden. Daher steht die Untersuchung neuer Aktinomyceten Stämme im Fokus der Naturstoffforschung. Die dargelegte Arbeit handelt von der Isolierung und strukturellen Charakterisierung neuer Naturstoffe, welche von Streptomyceten produziert wurden. Desweiteren, wird die Konstruktion eines neuen Biosensors dargestellt, welcher die Produktion von Sekundärmetaboliten detektieren soll. Es wurden zwei neue spiroindimicine E und F aus der Streptomyces sp. MP131-18 isoliert und die chemische Struktur mittels NMR bestätigt. Das Genom von MP131-18 wurde sequenziert und der Gencluster, welcher verantwortlich ist für die Synthese der Bisindole-Substanzen identifiziert und den Lynamicinen/Spiroindmicinen zugeordnet. Weiterhin, wurden vier neue Alpiniamide B-D aus dem Stamm Streptomyces sp. IB 2014/11-12 isoliert. Das sequenzierte Genom ermöglichte die Identifizierung des Genclusters, welcher für die Alpiniamide Produktion verantwortlich ist. Die vorgeschlagene Biosyntheseroute wurde bestätigt durch Fütterungsexperimente und Gendeletierungen in einem Hostorganismus. Abschließend wurde ein Beitrag zur Konstruktion eines Repressor-basierender Biosensors geleistet, welcher die Aktivierung von zuvor inaktiven Gencluster in Streptomyceten detektieren soll. Dieses Konzept wurde erfolgreich an dem aktivierten Coelimycin Gencluster angewendet
Engineering of Streptomyces albus J1074 and Streptomyces lividans TK24 for natural products production
Full text linkActinobacteria have remarkable chemical potential that is not explored due to low level of corresponding genes expression. In order to uncover this reservoir of natural products we developed a reporter-guided screening strategy combined with transposon mutagenesis. It was used to activate silent polycyclic tetramate macrolactam biosynthesis gene cluster in Streptomyces albus J1074. As result, the mutant with awaken secondary metabolism was obtained. Analysis of this strain led to identification of new regulatory system consisting of transcriptional regulator XNR_3174 and bacterial hormone-like compound butenolide. XNR_3174 and butenolide biosynthesis genes orthologues are present in the genomes of different Streptomyces. The identified regulatory system comprises a new condition-depended cascade controlling secondary metabolism in Actinobacteria. We also developed new host strains for heterologous production of natural products by deleting 11 endogenous secondary metabolite gene clusters from chromosome of S. lividans and introducing up to 2 sites for integration of foreign DNA. When expressing three heterologous gene clusters the generated hosts have shown better performance than the parental strain. S. lividans TK24 was also improved as a host for heterologous protein production by deleting a set of proteases encoding genes. The developed strains represent a step forward to a better panel of organisms for bioprospecting and genome mining of novel natural products.Actinobakterien besitzen ungeahntes chemisches Potenzial, das aufgrund niedriger Exprimierung entsprechender Gene nicht erforscht werden kann. Um Dieses aufzudecken, wurde eine Kombination aus reportergeführter Screening-Strategie und Transposon Mutagene entwickelt. Die Verwendung dieser Strategie führte zur Aktivierung des polyzyklischen Tetramat-Makrolaktam Gen-Clusters in Streptomyces albus J1074. Der erhaltene Stamm weißt eine aktivierte Produktion von Sekundärmetaboliten auf und Analysen führten zur Identifizierung eines Regulationssystems, bestehend aus dem transkriptionellen Regulator XNR_3174 und dem hormonähnlichen Naturstoff Butenolid. Orthologe von XNR_3174 und der Butenolid Gene findet man in Genomen verschiedener Streptomyceten. Das identifizierte System umfasst die neue „condition-dependent“-Kaskade, die den Sekundärstoffwechsel in Actinobakterien steuert. Zusätzlich entwickelten wir, durch das Entfernen von 11 endogenen Gen-Clustern aus dem Genom von S. lividans und dem Einfügen von zwei DNA Integrationsstellen, neue Wirtsstämme für die heterologe Produktion von Naturstoffen. Bei der heterologen Exprimierung von drei Gen-Clustern zeigten die optimierten Wirte bessere Resultate als der ursprüngliche Stamm. Durch das Entfernen der Proteasegene wurde S. lividans TK24 als Wirt für die Proteinproduktion verbessert. Die entwickelten Stämme vereinfachen die Bioprospektion und die Entdeckung neuer Naturstoffe unter Verwendung des „Genome-Mining“ Ansatzes
Discovery of new natural products and biosynthetic gene clusters from Streptomyces
Full text linkDue to the constant appearance of new diseases and antibiotic resistances new drugs with improved properties are urgently needed. Many of the commercially available drugs are based on natural products (NPs) or natural product derivatives. Actinobacteria, especially the genus Streptomyces are an important source of a variety of NPs with clinical relevance. Due to intensive exploitation of Streptomyces during the 20th century, their potential was considered exhausted. However, developments in analytical chemistry and biotechnology revealed new biosynthetic abilities hidden in Streptomyces. Herein, by applying dereplication, genome mining and heterologous expression, several Streptomyces strains have been analyzed for the production of new natural products and their corresponding biosynthetic gene clusters (BGCs). This led to the discovery of the structures and BGCs of new depsibosamycins (peptides) from S. aurantiacus LU19075 and lipothrenins (lipo-amino acid) from S. aureus LU18118. De novo structure elucidation was a large part of this work and supported the structural characterization of cyclofaulknamycin, which was discovered through a target genome mining approach. Further de novo structural elucidations in collaboration with colleagues provided a contribution to the discovery of dudomycin, bonsecamin and many more new NPs. The obtained results contribute to the field of natural product research and confirm Streptomyces as a rich source of new NPs.Aufgrund des ständigen Aufkommens neuer Krankheiten und Antibiotikaresistenzen werden dringend neue Arzneimittel mit verbesserten Eigenschaften benötigt. Viele der im Handel erhältlichen Medikamente basieren auf Naturstoffen (NS) oder Naturstoffderivaten. Actinobakterien, insbesondere die Gattung Streptomyces, sind eine wichtige Quelle für eine Vielzahl von klinisch relevanten NS. Aufgrund der intensiven Ausbeutung von Streptomyceten im 20. Jahrhundert galt ihr Potenzial als erschöpft. Entwicklungen in der instrumentellen Analytik und der Biotechnologie haben jedoch neue verborgene biosynthetische Fähigkeiten von Streptomyceten ans Licht gebracht. In dieser Arbeit wurden durch Dereplikation, Genom-Mining und heterologe Expression mehrere Streptomyceten-Stämme auf die Produktion neuer NS und der zugehörigen biosynthetischen Gencluster (BGC) untersucht. Dies führte zur Entdeckung der Strukturen und BGC von neuen Depsibosamycinen (Peptide) aus S. aurantiacus LU19075 und Lipothreninen (Lipo-Aminosäuren) aus S. aureus LU18118. De novo Strukturaufklärung war ein großer Teil dieser Arbeit und unterstütze die strukturelle Charakterisierung von Cyclofaulknamycin, welches durch einen Target-Genom-Mining-Ansatz entdeckt wurde. Weitere de novo Strukturaufklärungen in Zusammenarbeit mit Kollegen lieferten einen Beitrag zur Entdeckung von vielen neuen NS. Die erzielten Ergebnisse leisten einen Beitrag zur Naturstoffforschung und bestätigen Streptomyceten als reiche Quelle für neue NS
Discovery of natural products through heterologous expression of biosynthetic gene clusters in Streptomyces albus
Full text linkThis thesis focused on the identification of new natural products through heterologous expression of their cluster in the Streptomyces albus Del14 strain. Genomic library of a rare actinomycete strain Kutzneria albida DSM 43870 was used as a source of secondary metabolite clusters. Two clusters of K. albida were successfully expressed in S. albus Del14. Expression of a cryptic nucleoside gene cluster led to the production of a new member of pyrrolopyrimidine family of natural products which was called huimycin. Expression of the cryptic NRPS cluster led to the production of a new cyclopeptide called cyclohuinilsopeptin A. Both compounds were isolated and their structures were elucidated by NMR. Biosynthetic pathways for the isolated compounds were proposed based on sequence analysis and on the results of gene inactivation studies. Another focus of this work was deciphering of the biosynthetic pathway leading to the production of isoquinoline alkaloids mansouramycins in Streptomyces albus. Mansouramycin biosynthetic cluster was identified by heterologous expression and gene inactivation studies. Results of extensive genetic experiments and feeding studies indicate that the identified biosynthetic pathway leading to the production of isoquinolines mansouramycins is new. In contrast to all known isoquinoline biosynthetic routes, tryptophan instead of tyrosine serves as a main precursor for the production of mansouramycins.Diese Arbeit beschäftigt sich mit der Identifizierung neuer Naturstoffe durch heterologe Expression biosynthetischer Gencluster in dem Stamm Streptomyces albus Del14. Eine Genbibliothek eines Actinomyceten, Kutzneria albida DSM 43870, wurde als Quelle der Biosynthesegencluster verwendet. Zwei Gencluster konnten erfolgreich in S. albus Del14 exprimiert werden. Die Expression eines kryptischen Nucleosid-Genclusters führte zur Produktion eines Naturstoffs aus der Gruppe der Pyrrolopyrimidine, welcher Huimycin genannt wurde. Darüber hinaus führte die Expression eines NRPS Genclusters zur Produktion eines neuen cyclischen Peptids namens Cyclohuinilsopeptin A. Beide Stoffe wurden isoliert und die Struktur wurde mittels NMR aufgeklärt. Vermutungen zur Biosynthese wurden basierend auf der Analyse des jeweiligen Clusters und auf Ergebnissen von Geninaktivierungen erstellt. Ein weiterer Fokus dieser Arbeit liegt auf der Entschlüsselung der Biosynthese des Isochinolin-Alkaloids Mansouramycin in Streptomyces albus. Der Gencluster, welcher für die Biosynthese verantwortlich ist, wurde durch heterologe Expression und Geninaktivierungen identifiziert. Die Ergebnisse umfangreicher genetischer Experimente sowie Fütterungsstudien führten zur Entdeckung des neuen Biosynthesewegs des Isochinolins Mansouramycin. Im Gegensatz zu bekannten Biosynthesewegen von Isochinolinen dient Tryptophan anstelle von Tyrosin als Vorstufe für die Produktion vom Isochinolin Mansouramycin D
Entdeckung der chemische Vielfalt von angucycline Antibiotica : molekulare Grundlagen von Biosynthese des Simocyclinones und Grecocyclines
No full textMembers of the angucycline group of antibiotics are produced by different Streptomyces species and share common structural feature – the four-ring aglycon frame organized in a planner manner. Simocyclinone D8 is a potent inhibitor of the DNA gyrase supercoiling activity. It is the highly complex hybrid antibiotic, which comprises four parts that are coming from three pools of primary metabolism: angucyclic and linear polyketides, deoxysugar moiety and aminocoumarin. Although a hypothesis explaining simocyclinone biosynthesis has been previously proposed, little was proven in vivo due to the genetic inaccessibility of the producer strain. Three new D-type simocyclinones (D9, D10 and D11) produced by Kitasatospora sp. and Streptomyces sp. NRRL-24484, as well as their biosynthetic gene clusters, have been identified. The gene inactivation and expression studies have disproven the role of a modular polyketide synthase (PKS) system in the assembly of the linear dicarboxylic acid. Instead, the new stand-alone ketosynthase genes were shown to be involved in the biosynthesis of the tetraene chain. Additionally, the gene responsible for the conversion of simocyclinone D9 into D8 had been identified. Also biosynthetic gene cluster involved in the biosynthesis of another angucyclic polyketides grecocyclines from Streptomyces sp. Acta 13-62 was identified and cloned. Grecocyclines have unique structural moieties such as a dissacharide side chain, an additional amino sugar at the C-5 position and a thiol group. Enzymes from this pathway may be used for the derivatization of known active angucyclines in order to improve their desired biological properties.Zugehörige zur Antibiotika Gruppe der Angucycline werden von verschiedenen Streptomyces Arten produziert und weisen strukturelle Gemeinsamkeiten, wie den planaren 4-Ring Aglykon Rahmen auf. Simocyclinon D8 ist ein starker Gyrasehemmer und verhindert damit das Supercoiling der DNA. Es ist ein hochkomplexes Hybrid Antibiotikum, das aus 4 Teilen, die aus 3 Gruppen des Primärstoffwechsels kommen, besteht: angucyclische und lineare Polyketide, Desoxyzuckerteile und Aminocoumarin. Obwohl kürzlich eine Hypothese aufgestellt wurde, die die Biosynthese von Simocyclinonen erklärt, ist in vivo aufgrund der genetischen Unzugänglichkeit des produzierenden Stammes nur wenig nachgewiesen. Drei neue D-Typ Simocyclinone (D9, D10, D11), produziert von Kitasatospora sp. und Streptomyces sp. NRRL-24484, sowie deren biosynthetische Gencluster wurden identifiziert. Die Gen Inaktivierungs- und Expressionsstudien haben die Rolle eines modularen Polyketidsynthasesystems (PKS) beim Zusammenfügen der linearen Dicarboxylsäure widerlegt. Stattdessen wurde gezeigt, dass die neuen eigenständigen Ketosynthase Gen an der Biosynthese der Tetraenkette beteiligt sind. Darüber hinaus wurde das für die Umwandlung von D9 in D8 verantwortliche Gen identifiziert. Auch das biosynthetische Gencluster, das an der Biosynthese eines anderen angucyclischen Polyketids, Grecocycline von Streptomyces sp. Acta 13-62, beteiligt ist, wurde identifiziert und geklont. Grecocycline haben einzigartige strukturelle Reste wie die Disaccharid-Seitenkette, einen zusätzlichen Aminozucker am C5 Atom und eine Thiolgruppe. Enzyme dieses Wegs können für die Derivatisierung bekannter aktiver Angucycline verwendet werden um deren gewünschte biologische Eigenschaften zu verbessern
Transposon-Mutagenese in Streptomyceten
Full text linkRecent whole genome sequencing programs have revealed that the biosynthetic potential of Actinomycetales has been even underexplored with traditional approaches. With the advent of next-generation DNA sequencing techniques, we can access the huge amount of genetic information, which awaits development into new chemical and biological entities. Therefore efficient methods for the genes characterization are of great importance. In vivo transposon-based strategy is a valuable tool to identify functions of a number of genes and to construct random mutant libraries for diverse applications. Despite the wide availability of transposon systems, few options exist for use in actinomycetes. The aim of this project is to establish a system for random transposon mutagenesis in streptomycetes.
According to this aim the nucleotide content of Himar1 gene was adapted to the high GC-content of streptomycetes. Set of plasmids for transposon mutagenesis had been constructed and transposon mutant libraries of streptomycetes species had been obtained (S. coelicolor M145, S. albus J1074 and S. lividans 1326). The system was used for identification of novel regulatory genes of actinorhodin biosynthesis in S. coelicolor and for random integration of gusA reporter gene and antibiotic biosynthetic cluster into chromosome of S. albus J1074 with further investigation of position effect in this strain. Also the secondary attB site, discovered in the genome of S. albus J1074, was characterized.Die Methoden der Next-Generation DNA-Sequenzierung erlauben uns Zugang zu einer großen Menge an genetischen Informationen, die intensiv in den Bereichen der Biologie und Chemie genutzt werden sollten. Deswegen ist die Entwicklung von effektiven Methoden für eine funktionelle Gen-Charakterisierung heutzutage sehr wichtig. Die in vivo-Transposon-basierte Strategie ist ein wertvolles Instrument, das man für die Identifizierung der Funktionen zahlreicher Gene und die Konstruktion von Random-Mutanten-Bibliotheken für vielfältige Anwendungen nutzen kann. Trotz der breiten Verfügbarkeit von Transposon-Systemen sind nur wenige davon zuverlässig auf Streptomyceten anwendbar. Das Ziel dieser Arbeit ist es, ein System für Random-Transposon-Mutagenese in Streptomyceten zu entwickeln. Hierfür wurde der Codongebrauch des Himar1 Gens an den hohen GC-Gehalt der Streptomyceten angepasst. Basierend auf diesem Gen wurden die Plasmide für die Transposon-Mutagenese konstruiert und die Bibliotheken der Mutanten von verschiedenen Streptomyceten erzeugt. Das System wurde in S. coelicolor für die Identifizierung von neuen regulatorischen Genen in der Actinorhodin Biosynthese verwendet. Außerdem wurden mit Hilfe unseres Systems das Reporter-Gen gusA und biosynthetische Antibiotika-Cluster zufällig in das S. albus-Chromosom integriert. Damit wurde der Positions-Effekt in diesem Stamm erforscht. Es wurde auch eine sekundäre attB-Stelle von fC31-basierten Plasmiden entdeckt und charakterisiert
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