1,721,003 research outputs found
Effect of Oral Semaglutide on Cardiovascular Parameters and Their Mechanisms in Patients with Type 2 Diabetes: Rationale and Design of the Semaglutide Anti-Atherosclerotic Mechanisms of Action Study (SAMAS)
Full text linkIntroduction Type 2 diabetes (T2D) management has reached a point where not only optimal glycaemic control is necessary, but also additional interventions with proven cardiovascular risk reduction benefit. Subcutaneous semaglutide has been shown to provide cardiovascular protection, but its use may be limited by its injection formulation. To overcome this limitation, an oral semaglutide tablet has been developed, which could potentially be of the same value as its injection counterpart, but in a much wider group of patients with T2D, thereby allowing for broader cardiovascular risk reduction in this vulnerable patient population. Methods A total of 100 consecutive patients with T2D and a disease duration of up to 10 years, without manifest cardiovascular disease, who are treated with metformin (+/- sulphonylurea) and optimal cardioprotective therapy, will be recruited in a single-blinded, randomized trial named "Semaglutide Anti-atherosclerotic Mechanisms of Action Study (SAMAS)." After 1:1 randomization, patients will receive either oral semaglutide 14 mg daily or placebo for 1 year. The primary outcome comprises changes in atherosclerosis-related structural and functional characteristics of the arterial wall, namely: reduction of the carotid intima-media thickness, improvement of endothelial function and decrease in arterial stiffness. Secondary outcomes are changes in atherogenic small dense low-density lipoproteins, glucose control (HbA1c) and inflammatory markers (hsCRP). Possible correlations between primary endpoints and changes in lipids, HbA1c and high-sensitivity C-reactive protein will be sought. Discussion This is the first study to investigate the direct and indirect anti-atherosclerotic mechanisms of oral semaglutide. The results are expected to confirm the position of oral semaglutide in the multifactorial management of T2D with an emphasis on cardiovascular disease prevention
Health related quality of life and metabolic features of older patients with type 1 and 2 diabetes mellitus
No full textCelovita oskrba osebe s sladkorno boleznijo je vseživljenjska in zdravljenje oseb s sladkorno boleznijo temelji predvsem na opolnomočenosti. To je proces, v katerem posamezniki pridobijo znanje in spoznanja, potrebna za prilagoditve življenjskih navad z namenom izboljšanja kakovosti življenja. Medtem ko se učinkovitost zdravljenja oseb s sladkorno boleznijo tradicionalno meri s spremljanjem laboratorijskih parametrov in prisotnostjo zapletov sladkorne bolezni, pristop celostne, integrirane oskrbe poudarja pomen razumevanja vpliva vseh vidikov življenja s sladkorno boleznijo na posameznike. Ta širši vidik zajema psihosocialne vidike in dejavnike življenjskega sloga, ki so zajeti v konceptu z zdravjem povezane kakovosti življenja (HRQOL). V zadnjih letih je bila populacija oseb s sladkorno boleznijo priča pomembnim spremembam v demografskih trendih, v pristopih k zdravljenju in predvsem s soočanjem z novimi zdravstvenimi metodologijami in tehnološki integraciji (med drugim neprekinjenega spremljanja glukozeangl. Continuous Glucose MonitoringCGM). Te spremembe poudarjajo nujnost proaktivnega spremljanja HRQOL v obliki PROM-ov (angl. Patient Reported Outcome MeasuresPROM). Le z dobrim poznavanjem lastnosti najhitreje rastoče demografske podskupine oseb s sladkorno boleznijo – starejšihse lahko oblikujejo ustrezni pristopi k zdravljenju. Naš namen je bil preučiti HRQOL in presnovne značilnosti starejših s sladkorno boleznijo tipa 1 in tipa 2 z uporabo validiranih samoocenjevalnih vprašalnikov in preučiti vpliv uvedbe CGM na HRQOL in parametre urejenosti glikemije.
V prvem delu doktorske teze predstavimo dejavnike HRQOL in samooceno zdravja pri starejših s sladkorno boleznijo. Naša raziskava je pokazala nekatere posebnosti v podskupini starejših, saj večina domen HRQOL ni bila povezana s prisotnostjo zapletov sladkorne bolezni ali urejenostjo glikemije. Dokažemo, da je debelost pomemben dejavnik (slabše) HRQOL ne glede na tip sladkorne bolezni. V prvem delu doktorskega dela tako pokažemo doprinos in pomen ločenih meril izidov zdravljenja, ki naj torej poleg urejenosti glikemije poročajo o bolnikovih vidikih zdravljenja oziroma PROM.
V drugem delu doktorskega dela pokažemo presnovne značilnosti starejših s sladkorno boleznijo tako tipa 1 kot tipa 2 in dokažemo, da življenjski slog starejših s sladkorno boleznijo tipa 1 (SB1) vključuje v povprečju več telesne dejavnosti, medtem ko so starejši s sladkorno boleznijo tipa 2 (SB2) pretežno opredelili svoj življenjski slog kot sedeč. Vpliv količine in intenzivnosti telesne dejavnosti na urejenost glikemije je bil zaznaven samo v podskupini oseb, ki so bile pogosto in visoko intenzivno telesno dejavne.
V tretjem delu teze predstavimo dojemanje in učinkovitost uvedbe CGM pri starejših s SB1in SB2, zdravljenimi z večkratnimi dnevnimi injekcijami inzulina (angl. multiple daily injections of insulinMDI). Uvedba CGM pri starejših osebah z dobro nadzorovano sladkorno boleznijo je vodila v visoko zadovoljstvo brez izražanja dodatnega bremena pri samovodenju sladkorne bolezni. Poleg tega je bila dokazana dodatna korist pri nadzoru glikemije, katero je uporaba CGM stabilizirala v ciljnem območju.
Doktorsko delo pomembno dopolnjuje količinsko skopo literaturo o determinantah HRQOL pri starejših osebah s SB1 in SB 2 (primerljivih starosti) in dokazuje, da je to pomembna in premalo raziskana tema pri sladkorni bolezni. Osvetli tudi razlike med osebami s SB1 in SB2, kar podpira na posameznika osredotočen pristop k vodenju sladkorni bolezni, ki je pri starejših ključnega pomena ravno zaradi izrazitih medosebnih razlik. Narekovana rutinska vključitev psihosocialnih vidikov v zdravstveno oskrbo oseb s sladkorno boleznijo lahko izboljša zdravstveno oskrbo v najširšem smislu. Razumevanje dojemanja in morebitnih koristi CGM pri starostni skupini starejših, z uporabo napredne tehnologije neseznanjenih posameznikov, je pomembno vodilo pri uvajanju uporabe tehnično naprednih pripomočkov za samovodenje pri tej skupini s sladkorno boleznijo tako tipa 1 kot tipa 2.Integrative diabetes care is lifelong. Patient care evolves with the patient\u27s age, shifting from strict glycaemic goals to a comprehensive assessment of health-related quality of life (HRQOL). Therefore, in addition to glycaemic control measures, research should include patient-reported outcome measures (PROMs). Diabetes treatment is based on patient empowerment, the process in which persons with diabetes acquire the knowledge and insights necessary to adjust their lifestyle habits to improve their quality of life. In parallel with the aging of the population, the assessment of HRQOL in the form of PROMs is increasingly being implemented also due to the increasing introduction of new therapies and advanced technical devices for self-management of diabetes, such as Continuous Glucose Monitoring (CGM). The scientific evidence and clinical experience with these technologies among older adults are growing, however still scarce. With bridging the knowledge gap of the characteristics of the elderly persons with diabetes subpopulation, appropriate approaches to treatment can be developed. We aimed to determine the HRQOL and metabolic characteristics of older persons with type 1 and type 2 diabetes with the use of validated questionnaires. Furthermore, we assessed the impact of the introduction of CGM on HRQOL and glycaemic control parameters.
The first part of the thesis presents HRQOL and self-assessed mental health in older persons with diabetes, revealing that in a subgroup of older adults most HRQOL domains were not associated with diabetes complications or glycaemic control. Obesity significantly impacted HRQOL, regardless of diabetes type. The first part of my doctoral thesis therefore demonstrates the contribution and importance of separate criteria of treatment outcomes, which, in addition to glycemia control, should report on the patient\u27s aspects of treatment, captured by PROMs.
The second part elaborates on the metabolic characteristics of older people with type 1 and type 2 diabetes and demonstrates that the lifestyle of older people with type 1 diabetes involves on average more physical activity, while older people with SB2 predominantly defined their lifestyle as sedentary. The effect of the amount and intensity of physical activity on glycaemic control was only evident in a subgroup of frequent and high-intensity physically active subjects.
The third part presents the perception and effectiveness of CGM introduction in elderly with type 1 and 2 diabetes treated with multiple daily injections (MDI). CGM introduction resulted in high satisfaction and improved glucose control. The introduction of CGM in elderly persons with well-controlled diabetes was accepted without imposing additional distress in the self-management of diabetes. Furthermore, an additional benefit in glucose control was demonstrated, since the introduction of CGM stabilized glucose in the target range.
The thesis complements the scarce existing literature on HRQOL determinants in elderly patients with diabetes, emphasizing the importance of a patient-centred approach due to pronounced inter-individual differences. Incorporating and addressing the HRQOL perspective in diabetes care and research is imperative, especially for the elderly, and improves health care in the broadest sense. Understanding the perception and potential benefits of CGM in the elderly population aids with the onboarding of medical devices in technology-naïve patients and is of critical relevance for the introduction of medical devices in this group of persons with both type 1 and type 2 diabetes
Studying the infuence of peptide mimetic of N-terminal ghrelin on expression of orexigenic neuropeptides and activation of neurons in the mouse hypothalamus
No full textSurface expression of major peanut alergen Ara h 2 mimotopes in lactic acid bacteria Lactococcus lactis
Full text linkAlergije so motnje v delovanju imunskega sistema, s katerimi se dandanes spopada vse več ljudi. Obstajajo sicer različni načini zdravljenja teh bolezni, a so pogosto zahtevni, imajo resne neželene učinke, so neprijetni za pacienta in niso nujno uspešni. Vse to so razlogi, zaradi katerih se raziskovalci usmerjajo v iskanje novih možnih terapij. Velik potencial izkazujejo kratki peptidi-mimotopi, ki lahko posnemajo dejanske alergene in se vežejo na protitelesa IgE pri bolniku, a ne povzročijo alergijske reakcije ter tako sčasoma vodijo v umiritev alergijskega odziva. Odločili smo se jih raziskati v tej magistrski nalogi. Izbrali smo mimotope, ki posnemajo glavni alergen arašidov, saj je prav alergija za arašide ena najpogostejših. Za nosilce smo uporabili mlečnokislinske bakterije – sev Lactococcus lactis, ki veljajo za koristne in so dobro raziskane. Cilj magistrske naloge je bil pripraviti transformirane mlečnokislinske bakterije s sposobnostjo površinskega izražanja mimotopov, ki posnemajo alergen arašidov in se vežejo na protitelesa IgE. Bakterije Lactococcus lactis smo transformirali s plazmidi, ki so vsebovali zapise za izbrane peptide-mimotope, s postopkom elektroporacije. Predhodno smo njihove zapise pomnožili v bakterijah Escherichia coli. Uspešnost transformacije smo preverjali s potrjevanjem pravilnega nukleotidnega zaporedja za izbrane peptide v bakterijah, uspešnost izražanja in funkcionalnost peptidov pa s pomočjo encimsko imunoadsorpcijskega testa (ELISA) ter z metodo prenosa po westernu. S celotnim eksperimentalnim delom smo dosegli postavljeni cilj – proces transformacije je bil uspešen, saj so bakterije na svoji površini izražale želene peptide. To smo dokazali s potrjenimi ustreznimi sekvencami vstavljenega genskega zapisa. S prenosom po westernu smo dokazali prisotnost peptidov na površini L. lactis. Ko smo uporabili humani serum pacientov z alergijo, pa smo s prenosom po westernu potrdili, da so peptidi res mimotopi. Mimotopi imajo velik potencial in upamo, da bodo nadaljnje raziskave prinesle nova, boljša zdravila za alergijske bolezni.Allergies represent a dysfunction in the activity of the immune system and are affecting increasingly more people nowadays. There are different ways of treating these diseases, but these ways are often demanding, have serious side effects, are unpleasant for the patient and not necessarily successful. Due to these reasons, researchers are trying to find new therapy choices. Short chain peptides show a great potential – these are mimotopes, which can mimic allergens and bind with the antibodies IgE of a patient, but do not cause an allergic reaction and in time can appease an allergic reaction. For this master thesis we have chosen mimotopes that mimic the main allergen of peanuts, since peanut allergy is one of the most common allergies. We have used lactic acid bacteria as carriers – strain Lactococcus lactis, which are considered as useful bacteria and are extensively researched. The aim of this master thesis was to prepare transformed lactic acid bacteria that have the ability of surface expression of mimotopes that mimic the allergen of peanuts and bind with the antibodies IgE. Bacteria Lactococcus lactis have been transformed with plasmids, which carried the genes for the chosen peptides – mimotopes - by the process of electroporation. Prior to that process, we have replicated their genes in bacteria Escherichia coli. The success of the transformation was checked/tested with the affirmation of the right sequence of nucleotides for the chosen peptides in the bacteria, while the success of the expression and functionality of peptides was tested with the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and the western blot. In the experimental part, we have achieved the set goal – the process of transformation was successful, since the bacteria expressed the peptides on their surface. That was proven with the right sequences of the entered genetic code, while western blot proved the presence of peptides on the surface of L.lactis. In addition, by using the human serum of the patients with allergies and western blot we have proven the fact that peptides are indeed mimotopes. We can then conclude that peptides have a great potential and hope that further research will bring new and improved medicine for allergies
In vitro evaluation of immunomodulatory effect of Lacticaseibacillus casei extracellular vesicles
No full textProbiotiki so skupki živih mikroorganizmov, ki imajo ob apliciranju v zadostnih količinah koristne učinke na zdravje gostitelja. Predstavljajo eno izmed ključnih strategij za zdravljenje disbioze, stanja neravnovesja med koristnimi in potencialno patogenimi bakterijami, ki je povezano z različnimi zdravstvenimi stanji. Njihova uporaba se je v zadnjih letih zelo razširila. Kljub splošno priznani varnosti pri uporabi so zabeleženi primeri neželenih učinkov, pri čemer so najresnejše okužbe zlasti pri ranljivih skupinah, kot so kritično bolni, nedonošenčki in posamezniki z oslabljenim imunskim sistemom. Mehanizem delovanja probiotikov še ni povsem pojasnjen. Znano je, da lahko krepijo črevesno pregrado, izpodrivajo patogene organizme in proizvajajo protimikrobne snovi. Izkazujejo tudi širok spekter encimskih aktivnosti in imajo sposobnost moduliranja imunskega sistema. Postbiotiki so definirani kot pripravki neživih mikroorganizmov in/ali njihovih komponent, ki prinašajo zdravstveno korist za gostitelja. V primerjavi s probiotiki prinašajo številne prednosti, kot so zmanjšanje tveganja za mikrobno translokacijo, okužbo in prenos genov, odpornih na antibiotike, daljši rok trajanja, lažje shranjevanje in enostavnejšo standardizacijo. Med postbiotike sodijo tudi zunajcelični vezikli (ZV). To so sferični, dvoslojni proteolipidi, dimenzij od 20 do 300 nm, ki jih bakterije sproščajo v zunajcelični prostor. ZV vsebujejo bioaktivne proteine, metabolite, lipide in nukleinske kisline in so pomemben dejavnik v medcelični komunikaciji. Molekule na površini ZV se lahko pripnejo na zunajcelične proteine ali specifične receptorje gostiteljske celice in sprožijo primarno reakcijo. ZV nosijo tudi skupine molekul, imenovane s patogeni povezani molekularni vzorci (angl. pathogen-associated molecular patterns – PAMPs), ki jih prepoznajo vzorčno prepoznavni receptorji (angl. pattern recognition receptors – PRRs) in sprožijo različne signalne poti. L. casei je po Gramu pozitivna bakterija, široko uporabljena v fermentiranih živilih in probiotičnih izdelkih, skupaj z drugimi koristnimi bakterijami. Številne študije nakazujejo, da bi bakterija L. casei lahko olajšala številne bolezni, med drugim srčno-žilne bolezni, debelost, delovala kot zaščita pred nastopom sladkorne bolezni tipa 2 in blažila škodo, povzročeno zaradi črevesnih bolezni. Prav tako je dokazano, da zmanjša pojavnost in trajanje driske pri otrocih in zdravih mladih odraslih. Več študij nakazuje, da imajo specifični sevi L. casei imunomodulatorne lastnosti in lahko vplivajo na izločanje citokinov. Hipoteza te študije je, da sev L. casei proizvaja zunajcelične vezikle, ki bi lahko imeli pomembno vlogo pri imunomodulatornem učinku seva. Cilji raziskav so zato vključevali preverjanje, ali sev L. casei proizvaja zunajcelične vezikle, karakterizacijo le-teh in ocenitev vpliva seva L. casei ter njegovih ZV na dveh različnih in vitro modelih. Specifični sev, ki je uporabljen v tej študiji, je trenutno v procesu pridobitve patenta, zato polnega imena seva trenutno ni mogoče razkriti. Prvi ključni korak je bila ekstrakcija ZV iz celične kulture. Po uspešni kultivaciji seva L. casei smo bakterije in celične ostanke odstranili s pomočjo centrifugiranja, filtriranja in ultracentrifugiranja. Tako prečiščene ZV smo nato kvantificirali s pomočjo Bradfordove metode, ki temelji na barvni reakciji med hidrofobnim barvilom in proteini. ZV smo vizualizirali z uporabo visoko ločljivega transmisijskega elektronskega mikroskopa. Porazdelitev velikosti ZV smo določili z uporabo Zetasizer Nano ZSP. Za in vitro študije smo uporabili dve celični liniji, in sicer RAW 264 (mišji makrofagi) in Caco-2 (humane epitelijske celice kolorektalnega raka). Preden smo se lotili raziskovanja imunomodulatornih učinkov ZV, smo s testom celične viabilnosti preverili, ali so ZV ali sev L. casei citotoksični. Celice smo inkubirali z ZV različnih koncentracij in sevom L. casei. Po inkubaciji smo celično viabilnost določili z uporabo testa proliferacije celic CellTiter 96® AQueous One Solution. Reagent vsebuje tetrazolijevo sol (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-karboksimetoksifenil)-2-(4-sulfofenil))-2H-tetrazolijevo sol (MTS), ki jo presnovno aktivne celice reducirajo do topnega formazana, pri čemer pride do obarvanja, ki ga je mogoče izmeriti spektrofotometrično. Količina nastalega produkta je neposredno sorazmerna številu živih celic v kulturi. V obeh celičnih linijah so se ZV in L. casei izkazali kot necitoksični. Nadaljevali smo s testi za dokazovanje imunomodulatornega učinka L. casei in ZV izbranih koncentracij. Zanimalo nas je, ali ZV in L. casei lahko zavrejo celično proizvodnjo dušikovega oksida (NO) v stimuliranih celicah RAW 264. NO deluje kot vnetni mediator in igra ključno vlogo pri kroničnem vnetju. Izvedli smo Griessov test, ki predstavlja indirektno metodo za določanje NO preko nitrita (NO2–), enega od dveh primarnih, stabilnih in nehlapnih razgradnih produktov NO. Griessov reagent vsebuje sulfanilno kislino in N-[1-naftil]etilendiamin. V kislem okolju sulfanilna kislina reagira z NO2–, pri čemer nastane diazonijeva sol, ki se nato združi z N-[1-naftil]etilendiaminom v visoko obarvano azo spojino, ki jo lahko zaznamo spektrofotometrično. Celice RAW 264 smo stimulirali z lipopolisaharidom (LPS), ki je močan imunostimulator in v celicah sproži vnetni odziv, ter tretirali z ZV različnih koncentracij in sevom L. casei. Po 24 urah smo zbrali supernatante in izvedli test. Sledila je analiza genskega izražanja. Zanimalo nas je, ali ZV in L. casei vplivajo na gensko izražanje interlevkina 6 (Il-6) ali dejavnika tumorske nekroze alfa (Tnf-α), ki igrata pomembno vlogo v imunskem odzivu. Celice RAW 264 smo predinkubirali z ZV in sevom L. casei ter stimulirali z LPS. Kot kontrolo smo uporabili celice brez tretiranja in stimulacije, kot pozitivno kontrolo pa celice brez predhodnega tretiranja, stimulirane z LPS. Zatem je bila izvedena ekstrakcija RNA z uporabo reagenta NucleoZOL® in reverzna transkripcija za sintezo komplementarne DNA. Nato smo izvedli amplifikacijo tarčnih genov z uporabo kvantitativne verižne reakcije s polimerazo (qPCR) s fluoroforom SYBR GREEN. Za izvedbo statističnih analiz smo uporabili GraphPad 8.4.2. Študija je pokazala, da je sev L. casei zmožen proizvajati zunajcelične vezikle. Ugotovili smo, da nobena od preučevanih koncentracij ZV ni citotoksična za Caco-2 celice, niti za celice RAW 264. Rezultati te študije kažejo, da ZV lahko modulirajo imunski sistem. Sev L. casei in njegovi ZV so zmanjšali proizvodnjo NO v celicah RAW 264, stimuliranih z LPS-om, kar nakazuje, da so ZV lahko koristni pri zdravstvenih stanjih, kjer je prisotna prekomerna proizvodnja NO. Prikazali smo tudi zmanjšano izražanje Il-6 in Tnf-α mRNA v LPS-stimuliranih celicah RAW 264, tretiranih z ZV, kar nakazuje, da bi ZV lahko bili koristni pri obvladovanju bolezni, ki jih spremlja prekomerno vnetje. Čeprav lahko to študijo štejemo kot preliminarno, bi ZV lahko igrali ključno vlogo pri imunomodulatornih lastnostih L. casei in bi jih lahko obravnavali kot obetavno terapevtsko orodje v primerih, ko žive probiotične bakterije niso priporočljive. Pomembno je omeniti, da so potrebne nadaljnje raziskave, vendar je ta študija odprla novo smer raziskav, ki vzbuja veliko zanimanje. ZV, pridobljeni iz L. casei, bi lahko postali del terapevtske strategije za različna stanja, pri katerih prevladuje vnetni proces.Probiotics are live microorganisms that, when administered in adequate amounts, confer a health benefit on the host. They are a prevailing strategy to treat dysbiosis, i.e., an imbalance between beneficial and potentially pathogenic bacteria in the gut, which is associated with various health conditions. Probiotics have gained popularity over the past years and are widely used for their health benefits. However, it is important to note that they also have some drawbacks, including short shelf life and potential side effects, most notably infection in more vulnerable patients. A postbiotic is a preparation of inanimate microorganisms and/or their components that confers a health benefit on the host. These postbiotics offer a promising solution to address some of the associated drawbacks. Probiotic-derived extracellular vesicles are considered postbiotics and are spherical, bilayered proteolipids containing specific subsets of bioactive molecules. Lacticaseibacillus casei has demonstrated significant potential in treating various diseases, including cardiovascular diseases, intestinal diseases, and cancer. The specific strain of L. casei used in this study is currently undergoing the patent process, and therefore, the full name cannot be disclosed at this time. The hypothesis of this study is that the L. casei strain is capable of producing extracellular vesicles (EVs), which may play a crucial role in its immunomodulatory effects. Thus, the objectives were to isolate EVs and evaluate their immunomodulatory activity in vitro. EVs were extracted through centrifugation, characterized using transmission electron microscopy (TEM) and dynamic light scattering (DLS) with Zetasizer Nano ZSP, and utilized as a treatment, along with the L. casei strain, in Caco-2 and RAW 264 cell lines. The results demonstrated that L. casei EVs had no effect on cell viability, decreased the production of nitric oxide (NO) in RAW 264 cells stimulated with lipopolysaccharides (LPS), and reduced the expression of interleukin-6 and tumor necrosis factor-α in LPS-stimulated RAW 264 cells. Based on these results, we can conclude that L. casei can produce EVs, which display immunomodulatory effects that may play an important role in beneficial activity to the host, thereby opening new avenues for promising future treatments
Screening and evaluation of inhibitory activity against alpha-glucosidase by natural compounds and Abies alba bark extract
No full textMicrobiological preservation efficacy against Pseudomonas aeruginosa in dermal formulation
No full textNode optimisation in the three-node Turing genetic circuit incorporated in Escherichia coli
No full textNastanek in razvoj živega organizma predstavlja veliko uganko in eno najbolj perečih vprašanj v biologiji. V nastanek novih celic, njihovo delitev, diferenciacijo in zmožnost oblikovanja višjih funkcionalnih sistemov je vključenih mnogo bioloških mehanizmov. Eden od teh je nastanek in tvorba Turingovih vzrocev.
Idejo o Turingovih vzorcih je leta 1952 v znanstveni publikaciji z naslovom Kemična osnova morfogeneze predstavil britanski matematik Alan Turing. V svojem delu je opisal model reakcije in difuzije, s pomočjo katerega lahko razložimo nastanek nekaterih vzorcev, ki jih v naravi vidimo kot zebrine proge, vzorce na tropskih ribah, na kožuhu leopardov, gepardov in drugih živali. Ideja Turingovega modela temelji na reakciji med dvema spojinama, imenovanima morfogena.
V Turingovem modelu je eden od morfogenov aktivator, ki je sposoben aktivacije samega sebe in drugega morfogena. Druga spojina deluje kot inhibitor in zavira nastajanje prve spojine. Če v sistemu difuzija ni prisotna, se po določenem času vzpostavi stabilno stanje, v katerem sta koncentraciji aktivatorja in inhibitorja teoretično enaki. Ko sistemu dodamo difuzijo, pride do destabilizacije, kar omogoča tvorbo Turingovih vzorcev. Ti so vidni kot periodično pojavljajoče se črte ali vzorci drugih oblik. Za nastanek Turingovih vzorcev je pomembno, da inhibitor difundira veliko hitreje kot aktivator, njihov pojav pa lahko opazujemo le, kadar zagotovimo pravilno in zelo specifično kombinacijo parametrov, kot so stopnja proizvodnje in stopnja razgradnje morfogenov, geometrija sistema, razpolovni čas molekul, ki reagirajo v sistemu, ter stopnja njihove difuzije.
Objavi Turingove razlage nastanka vzorcev je sledilo mnogo znanstvenih raziskav. Prisotnost modela reakcije in difuzije ter njegovega pomena je bila uspešno dokazana v kemičnih sistemih. Nadaljnje raziskave so se osredotočile na dokazovanje prisotnosti Turingovega mehanizma tvorbe vzorcev v bioloških sistemih. Dokazali so, da je tvorba Turingovih vzorcev pomembna pri obnovi tkiv nekaterih živalih, na primer kuščarjevega repa. Prav tako naj bi bil model reakcije in difuzije eden od mehanizmov tvorbe labirintnih vzorcev v možganski skorji sesalcev, pigmentacije živalske dlake ter oblikovanja prstnih odtisov. Čeprav prisotnost Turingovih vzorcev v razvojni biologiji še ni popolnoma dokazana, lahko v naravi (tudi pri človeku) opazimo mnogo primerov, ki so izrazito podobni Turingovim vzorcem, pridobljenim z matematičnim modeliranjem.
V zadnjih letih se znanstveniki intenzivno osredotočajo na tvorbo in dokazovanje Turingovih vzorcev s pomočjo tehnik sintezne biologije. Pridobitev sintezno načrtovanih Turingovih vzorcev bi pomenila velik napredek v sintezni biologiji, saj bi omogočila boljšo razlago tvorbe in nastanka določenih bioloških struktur. Prav tako bi vsa dodatna odkritja omogočila pridobitev znanj in boljše razumevanje delovanja mehanizmov na področju sintetičnega inženirstva tkiv, ki igra pomembno vlogo v razvoju naprednih zdravljenj. Cilj širšega projekta, katerega del je to magistrsko delo, je natančno proučiti in biotehnološko pripraviti Turingovo genetsko vezje, sposobno tvorbe Turingovih vzorcev, ki bi ga bilo mogoče vstaviti v prokariontski organizem E. Coli.
Glavni razlog, da raziskave do sedaj v večini niso bile uspešne, je da so genetska vezja zelo občutljiva na vsakršne motnje, doseg pravih in specifičnih parametrov pa je zelo težaven. Scholes in sod. so izvedli temeljito analizo potencialnih genetskih vezij za sintezo Turingovih vzorcev. Rezultati raziskave so vodili do odkritja novih genetskih vezij in njihovih topologij, ki so veliko bolj robustna in manj občutljiva na spremembe parametrov. Genetsko vezje, ki se je izkazalo za najrobustnejše je bilo tri-vozliščno vezje z oznako \u273954\u27. To vezje smo za poglobljeno analizo in optimizacijo izbrali tudi v naši raziskavi.
Turingovo genetsko vezje \u273954\u27 je sestavljeno iz treh vozlišč, ki so poimenovana s črkami A, B in C. Vozlišči A in B lahko difundirata, vozlišče C pa tega ni sposobno. Vozlišči A in C lahko aktivirata sami sebe, kar dosežemo z genskim inženirstvom pozitivne povratne zanke v njuni regulaciji.
Induciranje genetskega vezja \u273954\u27, torej začetek njegovega delovanja, omogoča marionetni inducibilni sistem z majhnimi molekulami (angl. marionette small-molecule inducible system). Kot primerni inducibilni majhni molekuli smo izbrali protokatekujsko kislino (PCA) in salicilno kislino (SA). Genetsko vezje za svoje delovanje potrebuje le eno od omenjenih majhnih molekul. Ker so dokazali, da lahko obe molekuli nastaneta v enoencimskih reakcijah znotraj E. Coli, smo vezje \u273954\u27 testirali z obema. Omenjeno vezje so v predhodnih raziskavah že vstavili v ogrodje E. Coli, kjer sta PCA in SA predstavljali induktorja vozlišča A. Večina ostalih komponent, kot so promotorji, sintezni encimi, encimi za razgradnjo in transkripcijski dejavniki, so prav tako že predhodno testirali in optimirali za delovanje omenjenega vezja. Glavni cilj magistrskega dela je bila optimizacija vozlišča A s pomočjo načrtovanja različnih plazmidov, ki nosijo zapis za to vozlišče. Nove plazmide, ki smo jih pridobili s pomočjo molekulskega kloniranja, smo testirali in preverili, ali delujejo v skladu z našimi pričakovanji.
Delovanje različnih plazmidov smo preverili z merjenjem absorbance fluorescentnih proteinov: vozlišče B nosi zapis za zeleni fluorescentni protein, vozlišče C pa za rdeči fluorescentni protein. S kombinacijo in prilagajanjem specifičnih komponent vseh treh vozlišč smo preverili, kako dodatek različnih zunanjih stimulacij deluje na vozlišče A.
Za lažje vrednotenje celotnega vezja smo želeli v vozlišče A vgraditi modri fluorescentni protein. Ugotovili smo, da BFP (blue fluerescent protein) ni primeren za vgraditev v vozlišče A, saj smo zaradi visokega signala ozadnja dobili slabo korelacijo med količino izraženega BFP in aktivnostjo vozlišča A. Pomembno je zavedanje, da je avtoaktivacija oziroma pozitivna povratna zanka vozlišča A nujna za delovanje končnega genetskega vezja – če ne deluje, se to ne more aktivirati in posledično tvorba Turingovih vzorcev ni mogoča. Prav tako smo ugotovili, da pozitivna povratna zanka vozlišča A deluje brez zunanje stimulacije, ko je kot induktor uporabljena PCA. Vsi na novo pridobljeni plazmidi s PCA promotorjem so primerni za vgraditev kot vozlišče A v končno genetsko vezje. Ko smo kot induktor vozlišča A uporabili SA, smo opazili zelo šibko začetno aktivnost pozitivne povratne zanke. Tudi v tem primeru so bili vsi plazmidi delujoči in funkcionalni, a so zahtevali zunanjo stimulacijo vozlišča A s SA. Na pogladi pridobljenih ugotovitev se zdi vozlišče A, ki je zapisano na plazmidih s PCA promotorjem bolj ustrezno za vgraditev v končno genetsko vezje. Ugotovili smo tudi, da s prilagoditvami specifičnih delov DNA, ki se nahajajo pred in po sekvenci, ki kodira zapis za sintezni encim (AroZ/Ybts) lahko vplivamo na količino proizvodnje endogenih induktorjev (PCA in SA).
Na podlagi pridobljenih rezultatov lahko trdimo, da vse komponente delujejo pravilno, da je vozlišče A optimirano in primerno za vgraditev v končno genetsko vezje. Sintezno načrtovanje Turingovih vzorcev še vedno predstavlja velik izziv na področju sintezne biologije. Optimizacija vozlišča A in rezultati, ki smo jih pridobili med izdelavo magistrske naloge, predstavljajo korak bližje h končni vgradnji celotnega genetskega vezja v prokariontski E. Coli sistem. Z razvojem sinteznega genetskega vezja za proizvodnjo Turingovih vzorcev, bomo omogočili podrobnejši vpogled v razvojne mehanizme in njihovo razumevanje, to pa bo prineslo napredek na področju biosintetskih terapij, tkivne regeneracije in tkivnega inženirstva.In 1952 Alan Turing published his seminal paper called »The Chemical Basis of Morphogenesis« in which he presents a reaction-diffusion model of biological pattern formation. Based on the interactions of two morphogens, a slowly diffusing activator and a fast diffusing inhibitor, this model enables the formation of spatial patterns which closely resemble those on the leopard spots, zebra stripes, and many other patterns found in nature. Turing patterns have been observed in different chemical systems, whilst their engineering in synthetic biology still presents a big challenge. Synthetic engineering of Turing patterns would present a big step forward in synthetic biology and would provide a better explanation for how patterning occurs in biology. It can also provide practical information for synthetic tissue production, the use of which could contribute to future therapeutic purposes. Previously, different types of genetic circuits capable of Turing patterns production were analysed computationally, and the \u273954\u27 Turing circuit proved most promising. This genetic circuit was previously implemented in E. coli chassis with protocatechuic acid (3,4-dihydroxybenxoic acidPCA) and salicylic acid (2-hydroxybenzoic acidSA) as node A diffusers. Most of the circuit components, such as promoters, synthesis enzymes, degradation enzymes and transcription factors, were previously optimised. The focus of this study was node A optimisation, which was performed by creating three different variants of node A, obtained by molecular cloning. These were then tested to verify if node A is functioning as expected. Based on the results obtained in this study, expression levels from node A are believed to be optimized, and all of its components are functioning correctly
Identification and characterization of major bee venom allergen Api m 1 mimotopes for development of specific immunotherapy
Full text linkAlergija po piku čebele je nevarno bolezensko stanje, saj lahko povzroči hude, v nekaterih primerih ţivljenjsko ogroţajoče anafilaktične reakcije, obenem pa je specifična imunoterapija s čebeljim strupom dolgotrajna, naporna in povzroča neţelene stranske učinke, zato obstaja potreba po novih učinkovinah in alternativnih strategijah zdravljenja.
Eno izmed perspektivnejših skupin novih imunoterapevtikov predstavljajo peptidni mimetiki epitopov alergenov (mimotopi). Po principu molekularne mimikrije so mimotopi sposobni sproţiti zelo podoben ali celo enak imunski odziv, kot epitopi, katere posnemajo. Posledično lahko v imunoterapiji predstavljajo nadomestne ligande za alergene. V primerjavi z alergeni je njihova prednost v tem, da, kot kratki peptidi, nimajo vezavnih mest potrebnih za premreţenje IgE na površini efektorskih celic.
Zaradi potencialne terapevtske uporabnosti smo v okviru doktorskega dela poiskali mimotope poglavitnega alergena čebeljega strupa, Api m 1. Z rešetanjem bakteriofagnih knjiţnic kratkih naključnih peptidov na tarčnih protitelesih IgG, usmerjenih proti Api m 1, smo odkrili kolekcijo 46 edinstvenih peptidov. V testih vrednotenja je 36 peptidov izkazovalo močno in specifično vezavo do tarčnih protiteles ter kompeticijo z Api m 1 za iste paratope (ali vezišča v neposredni bliţini). Med peptidi smo odkrili dva izrazita aminokislinska motiva GP[S/N/D]ELG[R/K/H] in D[K/R/H]SKP(H). Vpliv prispevka posameznih aminokislinskih ostankov znotraj motiva za vezavo na tarčna protitelesa smo ocenili s testom alaninskega rešetanja. Pri linearnem mimotopu GRMGPSELGPVIG sta se glutaminska kislina in lizin izkazali kot ključni za vezavo, medtem ko alaninske različice cikličnega mimotopa GCWDSLGRAC niso obdrţale vezavnih lastnosti izvornega peptida. Aminokislinska zaporedja pridobljenih peptidov smo in silico prilegali na Api m 1 in določili epitopa, ki gradita površinsko izpostavljeni zanki znotraj regije 17-24 na N-koncu Api m 1 in znotraj regije 119-124 na C-koncu. Za namen aktivne imunizacije smo na podlagi analize rezultatov našega raziskovalnega dela in podatkov iz literature izbrali majhni plaščni protein pIII iz bakteriofaga M13 kot samostojni nosilec mimotopov. Štiri predstavnike identificiranih epitopov smo sintetizirali in jih hkrati pripravili kot fuzijske proteine z nosilcem pIII, tako da smo jih izolirali iz periplazme E. coli. Tako pripravljenim konstruktom in sinteznim peptidom smo ovrednotili njihov imunoterapevtski potencial. Ker smo v procesu selekcije kot tarčna protitelesa uporabili IgG iz zajčjega seruma, smo preverili ali mimotopi ohranijo sposobnost vezave na protitelesa IgE iz seruma pacientov, alergičnih za strup čebele. S testom točkovnega nanosa (ang. dot blot) smo potrdili, da se IgE iz seruma 12 pacientov, reaktivnih na Api m 1, specifično veţejo na štiri izbrane mimotope, spojene z nosilcem pIII, kar potrjuje, da so identificirani epitopi relevantni za oba izotipa protiteles. S pomočjo testa aktivacije bazofilcev (ang. basophil activation test, BAT) smo ugotovili, da mimotopi, spojeni s pIII, ne aktivirajo bazofilcev, torej niso alergogeni. Po stimulaciji s sinteznimi peptidi prav tako nismo zaznali aktivacije bazofilcev, s čimer smo izključili moţnost, da peptidni mimotopi aktivirajo bazofilce preko drugih od IgE neodvisnih mehanizmov. Dodatno smo preverili, ali lahko peptidni mimotopi, z blokado vezavnih mest na IgE, preprečijo degranulacijo bazofilcev, ki jo sproţi alergen Api m 1. Preliminarni rezultati kaţejo, da ni razlik med aktivacijo bazofilcev, ki jo je povzroči Api m 1, in aktivacijo, ki jo je povzročil Api m 1 v prisotnosti mimotopov. Vseeno opisan koncept predstavlja osnovo za nadaljnji razvoj tega novega pristopa k zdravljenju alergij. Vpliv mimotopov na T celični odziv smo ovrednotili z določanjem citokinov v kulturi mononuklearnih celic iz periferne krvi alergičnih pacientov. Čebelji strup in Api m 1 sta spodbudila preteţno citokine Th2, medtem ko je mimotop, spojen s pIII, povečal izločanje interferona gama (IFN-?), kar nakazuje premik citokinskega profila iz Th2 v Th1. Izsledki raziskave tako opredeljujejo mimotope Api m 1 kot obetavne učinkovine za nadaljni razvoj hipoalergenih učinkovin za varnejšo imunoterapijo alergije po piku čebele.
V drugem delu doktorske disertacije smo tehnologijo rešetanja bakteriofagnih knjiţnic uporabili za določitev epitopov poglavitnega alergena ambrozije, Amb a 1, pri katerem je dodaten izziv predstavljalo dejstvo, da tridimenzionalna struktura proteina ni znana. Odkrili smo 6 peptidov, ki so specifično vezali tako na tarčna protitelesa IgG, usmerjena proti Amb a 1 kot tudi na IgE iz zmesi serumov alergičnih pacientov. Izselekcionirani peptidi so se le šibko ujemali s primarnim zaporedjem Amb a 1, kar je nakazovalo, da so epitopi konformacijski. Za določitev konformacijskih epitopov smo peptide prilegali na homologni tridimenzionalni model Amb a 1, ki smo ga izdelali v računalniškem programu za molekulsko modeliranje Phyre2. Po prileganju smo z EpiSearch analizo definirali lokacijo moţnih epitopov na površini molekule okoli aminokislinskih ostankov K104, S110, H214 in W312.
V zadnjem delu smo se lotili razvoja nove metode za sočasno analizo več alergenov v testu aktivacije bazofilcev (multipleks BAT) s pomočjo fluorescenčnega označevanja alergenov z nanokristali Qdot. Poglavitna alergena čebeljega strupa, Api m 1 in Api m 2, smo konjugirali z nanokristali Qdot dveh različnih velikosti ter primerjalno ovrednotili njihovo primernost za analizo več alergenov hkrati. Uporabili smo nanokristale karboksil-Qdot, pri katerih vezava na alergen poteka preko karboksilne skupine in amino-Qdot, pri katerih vezava poteka preko aminske skupine. Potrdili smo, da označevanje alergenov tako z nanokristali karboksil- kot tudi z amino-(PEG)-Qdot ni vplivalo na njihovo IgE reaktivnost. Nasprotno pa se je alergogena aktivnost oz. sposobnost prekriţanja IgE na površju bazofilcev ohranila le pri alergenih, označenih z nanokristali amino-(PEG)-Qdot. Slednje smo nato uporabili v multipleks testu BAT in rezultat običajne analize BAT primerjali z rezultatom multipleks BAT. Ugotovili smo ujemanje pri 15 od 17 bolnikov in 6 od 6 kontrolnih osebah s primerljivimi krivuljami odziva na alergen, na podlagi česar sklepamo, da so alergeni, označeni z nanokristali amino-(PEG)-Qdot, uporabni za sočasno analizo aktivacije bazofilcev z več alergeni. Multipleks BAT je pomembna nadgradnja trenutnega testa, ki bo pocenil in olajšal diagnostično obravnavo dvojno pozitivnih in polisenzibiliziranih bolnikov, obenem pa odpira nove moţnosti za raziskave, kot je na primer preučevanje razporeditev površinskih IgE na efektorskih celicah.Bee sting allergy is a dangerous disease condition which can cause severe, in some cases life-threatening anaphylactic reactions. Due to the fact that bee venom immunotherapy is time-consuming and laborious, frequently accompanied by side effects, new therapeutic agents and alternative treatment strategies are needed.
One of the promising groups of new immunotherapeutics is peptide mimetics of allergen epitopes (mimotopes). On the basis of molecular mimicry, mimotopes can elicit a very similar or even the same immune response as epitopes which they mimic. They may therefore represent substituting ligands for allergens in immunotherapy. As short peptides mimotopes do not have the binding sites required for cross-linking of IgE on the surface of effector cells which represents their advantage over allergens.
Due to the potential therapeutic utility, we aimed to identify mimotopes of the major bee venom allergen, Api m 1. By screening bacteriophage library of short random peptides against target anti-Api m 1 IgG antibodies we discovered a collection of 46 unique peptides. In evaluation assays, 36 peptides showed strong and specific binding to target antibodies and effectively competed with Api m 1 for the same paratopes (or sites in the close proximity). The peptides contained two distinct amino acid motifs either GP[S/N/D]ELG[R/K/H] or D[K/R/H]SKP(H). The contribution of individual amino acid residues within the motif to the target antibody binding was assessed by alanine screening assay. In the GRMGPSELGPVIG linear mimotope, glutamic acid and leucine proved to be critical for binding, whereas alanine variants of the GCWDSLGRAC cyclic mimotope did not retain the binding properties of the parental peptide. We then mapped amino acid sequences of the obtained peptides to Api m 1 in silico and determined the epitopes on the surface-exposed loops within the 17-24 region at the N-terminus of Api m 1 and within the 119-124 region at the C-terminus.
Based on our research results and literature data we selected small coat protein pIII from M13 bacteriophage as a carrier of mimotopes for active immunization. Four representatives of the identified epitopes were synthesized and isolated as pIII-fused proteins from the periplasm of E. coli. Immunotherapeutic potential of pIII-fused constructs and synthetic peptides were evaluated. Given that rabbit IgG were used as target antibodies in the selection process, we checked whether the mimotopes retained the ability to bind to IgE from patients´ serum. The dot blot assay confirmed that IgE from the serum of 12 patients, reactive to Api m 1, specifically bind to four selected pIII-fused mimotopes, thus verifying that the identified epitopes are relevant for both antibody isotypes. Using a basophil activation assay (BAT), we confirmed that pIII-fused mimotopes did not activate basophils i.e they are non-allergenic. Also, no basophil degranulation was detected after stimulation with synthetic peptides, thus excluding the possibility that peptide mimotopes would activate basophils via other IgE-independent mechanisms. We further examined whether peptide mimotopes, by blocking binding sites to IgE, can prevent basophil degranulation triggered by Api m 1 allergen. Preliminary results indicate that there is no difference between basophil activation induced by Api m 1 and activation induced by Api m 1 in the presence of mimotopes. Nevertheless, the described concept represents the basic platform for further development of this new approach to treating allergies. The effect of mimotopes on the T cell response was evaluated by measuring the cytokines in the cultures of peripheral blood mononuclear cells from allergic patients. Bee venom and Api m 1 stimulated predominantly Th2 cytokines, whereas the pIII-fused mimotope increased interferon-gamma (IFN-γ) secretion, suggesting a shift in the cytokine profile from Th2 to Th1. The results of the research thus identify mimotopes Api m 1 as promising candidates for the further development of hypoallergenic therapeutic agents for safer immunotherapy of bee sting allergy.
In the second part of the doctoral dissertation, we performed a screening of bacteriophage short peptide libraries to determine the epitopes of the main ragweed allergen Amb a 1 where an additional challenge was the fact that the three-dimensional structure of the protein is unknown. We detected 6 peptides that specifically bound both target IgG antibodies directed against Amb a 1 as well as IgE from a mixture of sera from allergic patients. The selected peptides only weakly aligned with the Amb a 1 primary sequence, thus suggesting that the epitopes are conformational. To determine the conformational epitopes, the peptides were mapped onto the homologous three-dimensional model of Amb a 1 generated with a program for molecular modelling Phyre2. By using EpiSearch analysis after mapping, we defined the location of possible epitopes on the surface of the molecule around the amino acid residues K104, S110, H214 and W312.
In the last part, we developed a new method for the simultaneous analysis of several allergens in the basophil activation test (BAT multiplex) using fluorescence labelling of allergens with Qdot nanocrystals. The main allergens of bee venom, Api m 1 and Api m 2, were conjugated with Qdots of two different sizes and their suitability for the analysis of several allergens simultaneously was evaluated. Binding of carboxyl-Qdot to allergen is attained via carboxyl group, whereas amino-Qdot binds to allergen via an amine group. We confirmed that the labelling of allergens with both carboxyl- and amino-(PEG)-Qdot did not affect their IgE reactivity. In contrast, allergenic activity i.e. the ability to cross-link IgE on the surface of basophils was maintained only in allergens labelled with amino-(PEG)-Qdot nanocrystals. The latter were then used in the multiplex BAT and the result of the BAT analysis was compared with the result of the multiplex BAT. Matching results were found in 15 of 17 patients and 6 of 6 controls with comparable allergen response curves, suggesting that allergens labelled with amino-(PEG)-Qdot nanocrystals are suitable for concomitant analysis of basophil activation with multiple allergens. Multiplex BAT represents an important improvement of the current test, which will reduce the cost and facilitate the diagnostic workup of double-positive and polysensitized patients, while opening up new possibilities for research, such as studying the distribution of surface IgE on effector cells
- …
