371 research outputs found
Naive CD8 T-cells initiate spontaneous autoimmunity to a sequestered model antigen of the central nervous system
No full textIn multiple sclerosis, CD8 T-cells are thought play a key pathogenetic role, but mechanistic evidence from rodent models is limited. Here, we have tested the encephalitogenic potential of CD8 T-cells specific for the model antigen ovalbumin (OVA) sequestered in oligodendrocytes as a cytosolic molecule. We show that in these ‘ODC-OVA’ mice, the neo-self antigen remains invisible to CD4 cells expressing the OVA-specific OT-II receptor. In contrast, OVA is accessible to naïve CD8 T-cells expressing the OT-I T-cell receptor, during the first 10 days of life, resulting in antigen release into the periphery. Introduction of OT-I as a second transgene leads to fulminant demyelinating experimental autoimmune encephalomyelitis with multiple sclerosis-like lesions, affecting cerebellum, brainstem, optic nerve and spinal cord. OVA-transgenic oligodendrocytes activate naïve OT-I cells in vitro, and both major histocompatibility complex class I expression and the OT-I response are further up-regulated by interferon-γ (IFN-γ). Release of IFN-γ into the circulation of ODC-OVA/OT-I double transgenic mice precedes disease manifestation, and pathogenicity of OT-I cells transferred into ODC-OVA mice is largely IFN-γ dependent. In conclusion, naïve CD8 T-cells gaining access to an ‘immune-privileged’ organ can initiate autoimmunity via an IFN-γ-assisted amplification loop even if the self-antigen in question is not spontaneously released for presentation by professional antigen presenting cells.Shin-Young Na, Yi Cao, Catherine Toben, Lars Nitschke, Christine Stadelmann, Ralf Gold, Anneliese Schimpl, and Thomas Hüni
Induction of experimental autoimmune encephalomyelitis in transgenic mice expressing ovalbumin in oligodendrocytes
No full textWe have used the 5' flanking sequence of the myelin basic protein gene known to include the core promoter and a strong oligodendrocyte (ODC)-specific enhancer to target expression of the well-studied model antigen ovalbumin (OVA) to ODC in transgenic mice. OVA protein was detected in a tissue- and cell-specific manner in these "ODC-OVA" mice. Without immunization, CD4 T cells and B cells remained ignorant of the neo-self antigen expressed in the central nervous system (CNS), as indicated by unimpaired development and lack of activation of OVA/IA(b)-specific TCR transgenic T cells in these mice, and the ability to mount normal OVA-specific recall and antibody responses. Upon immunization with OVA in complete Freund's adjuvant, about half of the transgenic mice developed neurological symptoms characteristic of experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). Mononuclear infiltrates in the brain and spinal cord contained both macrophages and T cells, similar to classical models of EAE induced by immunization with CNS antigens in adjuvant. The wealth of immunological reagents available to study and manipulate the OVA-specific response should make this new model useful for the investigation of components and mechanisms involved in CNS-specific autoimmunity.Yi Cao, Catherine Toben, Shin-Young Na, Kirsten Stark, Lars Nitschke, Alan Peterson, Ralf Gold, Anneliese Schimpl, and Thomas Hüni
The immunoglobulin tail tyrosine motif upgrades memory-type BCRs by incorporating a Grb2-Btk signalling module
No full textThe vigorous response of IgG-switched memory B cells to recurring pathogens involves enhanced signalling from their B-cell antigen receptors (BCRs). However, the molecular signal amplification mechanisms of memory-type BCRs remained unclear. Here, we identify the immunoglobulin tail tyrosine (ITT) motif in the cytoplasmic segments of membrane-bound IgGs (mIgGs) as the principle signal amplification device of memory-type BCRs in higher vertebrates and decipher its signalling microanatomy. We show that different families of protein tyrosine kinases act upstream and downstream of the ITT. Spleen tyrosine kinase (Syk) activity is required for ITT phosphorylation followed by recruitment of the adaptor protein Grb2 into the mIgG-BCR signalosome. Grb2 in turn recruits Bruton's tyrosine kinase (Btk) to amplify BCR-induced Ca2+ mobilization. This molecular interplay of kinases and adaptors increases the antigen sensitivity of memory-type BCRs, which provides a cell-intrinsic trigger mechanism for the rapid reactivation of IgG-switched memory B cells on antigen recall
Author Correction: Towards community-driven metadata standards for light microscopy: tiered specifications extending the OME model (Nature Methods, (2021), 18, 12, (1427-1440), 10.1038/s41592-021-01327-9)
No full text\ua9 The Author(s), under exclusive licence to Springer Nature America, Inc. 2022. In the version of this article initially published, the affiliation for author Roland Nitschke was incorrectly formulated. The affiliation has been corrected to read “Life Imaging Center and Signalling Research Centres CIBSS and BIOSS, University of Freiburg, Freiburg, Germany” in the online version of the article
Optimised multicomponent geothermometer MulT_predict
No full textGeothermometry is used for reservoir temperature estimation since the 1960s. Different kind of solute, gas, and isotopic geothermometers has been evolved and further developed. We are focusing on solute geothermometery, using the multicomponent approach by Reed and Spycher (1984) and combined it with an optimisation process suggested by Nitschke et al. (2017). Therefore, IPhreeqC by Parkhurst and Appelo (2013) and Matlab were coupled. Thus, the geochemical output of IPhreeqC is numerically evaluated and optimised with Matlab. Sensitive parameters, e.g. pH-value, and aluminium concentration etc. are varied simultaneously to minimise the temperature difference between multiple mineral phases, used as geothermometer. MulT_predict with its implemented optimisation leads to more accurate temperature estimations with lesser variance of error
Europaeische Werte in Globalisierung? Kritische Repraesentationen des Selbst und des/der Anderen
No full textIn the essay the author approaches and debunk some of the most relevant normativ challenges the West (s), to be named in the plural, and Europe in particular, has to cope with in the present. because of the 'remotion' and oblivion of its most gravious faults coming from its past.. 'Collective Memory', 'Symbolic Violence', 'Collective Trauma', 'Identity/alterity/difference', 'Asymmetrical Recognition' are the constitutive components of the critical toolkit employed here to reframe the debate about European Self-understanding, that's to say about legacy and the intercultural future of the liberal, emancipatory and democratic narratives in globalisation
Regulation der Signalleitung durch CD22 und seine Liganden 2, 6 Sialinsäure
No full textinhibitory co-receptor CD22 binds specifically with its amino terminal V-set immunoglobulin domain to alpha 2, 6 -linked sialic acid (2, 6 sia). In majority of B cells CD22 is bound to its ligands in cis (i.e. to ligands expressed on the same cellular surface) and this cis ligand binding regulates CD22 signaling. In this study, we analysed several synthetic sialosides which were synthesized to block the CD22 ligand binding domain efficiently. Addition of biphenyl carbonyl group at C-9 position of naturally occurring sialic acid, Me-Neu5Ac was shown to increase its binding efficiency to CD22-lectin domain and blocks the inhibitory function of CD22 on BCR-triggered Ca2+ flux (Kelm et al., 2002). Using this BPC-Neu5Ac as backbone, we modified at C-9 position, C-2 position and also at Neu5Ac group to derive new compounds having higher affinity and avidity towards the lectin binding domain of CD22. When biotinylated, BPC-Neu5Ac, showed increase in binding efficiency of hCD22 by 10 fold, this compound BPC-Neu5Ac-Bio, was then used to study the effect of inhibitors in signaling. We found, higher Ca2+ flux in BPC- Neu5Ac-Bio treated Daudi cells when compared to Me-Neu5Ac and BPC-Neu5Ac. In conclusion, here these findings showed binding of ligands to CD22-lectin domain support the inhibitory function of CD22. By using these inhibitors, an attempt was made to investigate the transmembrane glycoprotein ligands to which CD22 interacts via lectin domain and control signaling. Our initial studies in human B cell lines points out that pre-treatment of cells with sialic acid analogues did not affect the association of CD22 with either CD45 or IgM (known ligands of CD22 on B cell surface). Therefore, in order to find other possible ligands to which CD22 is associated in sia-dependent manner, we used a technique of simultaneous cross linking and biotinylation of cell surface proteins. On analysis of CD22 immune-precipitates, after simultaneous cross linking and biotinylation of cell surface proteins, major proteins found co-precipitated were IgM and CD45. Pre-treatment with sialosides (known to interrupt ligand binding) did not affect association of CD22 with either IgM or with CD45. Therefore, although CD22 binds to CD45 as well as IgM but in presence of sialosides, there seems to be no effect on this binding either before or after BCR stimulation. This suggests that association of CD22 with IgM and CD45 is not mediated by 2, 6 Sia-binding. Since the sialyltransferase ST6Gal I is the only enzyme that generate the ligand for CD22, Sia-alpha-2-6Gal-beta-1-4GlcNAc-terminus, the alpha2, 6 -linked sialic acid, we generated mice double-deficient for both CD22 and ST6Gal1. Previously, (Hennet et al., 1998) showed ST6Gal-/- mice have a contrasting feature compared to CD22-/- mice. Therefore it was of interest to study these double knock out mice to understand the mechanism of regulation of signaling by CD22 and its ligands alpha 2, 6 Sia. From these studies of CD22 x ST6GalI double-deficient mice, we find rescue of defective signaling in ST6Gal-/- mice by the CD22-deficiency. In the CD22 x ST6GalI double-deficient mice, the Ca2+ responses as well as most proliferative responses were elevated to the same level as in CD22-deficient mice. Another interesting finding from this study was migration defect of recirculating B cells in bone marrow of both CD22-/- and ST6Gal-/- mice. The cell transfer experiments point out that homing of recirculating B cells in bone marrow is controlled by this receptor/ ligand pair. Finally, we analysed whether the negative regulation of signaling by CD22 is BCR-isotype dependent. A recent study claimed that CD22 did not inhibit IgG-mediated responses. By using a new IgG1 knockin mouse (provided by A. Waismann), and generating IgG1i/IgG1i x CD22-/- and IgG1i/IgG1i x CD22-/+, we studied the role of CD22 inhibition on IgG1 signaling. Our mouse model showed an enhanced IgG1-mediated Ca2+ signaling, in absence of CD22 and normal activation of CD22, as detected by tyrosine phosphorylation and SHP-1 activation, in its presence. This showed that CD22 inhibits IgG1 responses normally. Also, IgG+ B cells have an intrinsic ability to trigger higher BCR signals which must be due to the expression of the unique cytoplasmic tail of this isotype. This stronger signaling capacity of IgG is relevant to explain the elevated and fast responses of memory B cells.Der inhibitorische Ko-Rezeptor CD22 bindet mit seiner N-terminalen V-Set Domäne spezifisch an alpha2, 6 verknüpfte Sialinsäuren (2, 6 Sia). In den meisten B-Zellen ist CD22 an seine Liganden in cis gebunden (d.h. an Liganden auf der gleichen Zelloberfläche), und diese cis-Ligandenbindung reguliert die CD22 Signalleitung. In dieser Arbeit untersuchten wir verschiedene synthetische Sialoside, die als hochaffine Liganden-Analoga hergestellt wurden. Kopplung einer Biphenyl-Carbonylgruppe (BPC) an die C-9 Position der natürlichen Sialinsäure Me-Neu5Ac erhöht die Bindungs Affinität an die CD22-Lektin Domäne und blockiert die inhibitorische Funktion von CD22 auf BCR-vermittelte Ca2+ Mobilisierung (Kelm et al. 2002). Ausgehend von BPC-Neu5Ac, führten wir weitere Modifikationen an der C-9 Position, an der C-2 Position und auch an der Acetyl-Funktion von Neu5Ac ein, um Verbindungen mit höherer Affinität und Avidität für CD22 zu erhalten. Die biotinylierte BPC-Neu5Ac-Verbindung zeigte eine ca. 10-fach höhere Bindungsaffinität für hCD22. Der Ca2+ Flux in Daudi-Zellen wurde durch diese biotinylierte Verbindung im Vergleich zu Me-Neu5Ac und BPC-Neu5Ac erhöht. Diese Ergebnisse zeigten, dass Liganden-Bindung der Lektindomäne von CD22 dessen inhibitorische Funktion unterstützt. Mit Hilfe dieser Inhibitoren wurden potentielle Transmembran-Glykoprotein Liganden von CD22 untersucht. Unsere Studien an menschlichen B-Zellen zeigte, dass Behandlung mit Sialinsäure-Analoga die Assoziation von CD22 mit CD45 oder mit IgM, die als Liganden für CD22 beschrieben waren, nicht beeinträchtigte. Wir verwendeten auch eine Technik der simulaten Oberflächen-Biotinylierung und chemischen Kreuzvernetzung von Oberflächenproteinen. Nach einer solchen Bahandlung fanden wir in CD22 Immunopräzipitaten ausschliesslich CD45 und IgM als ko-präzipitierte Proteine. Vorbehandlung mit den Sialosiden beeinträchtigte die Ko-Präzipitation von CD22 mit IgM oder CD45 nicht. Diese Ergebnisse bedeuten vermutlich, dass die Interaktion von CD22 an IgM und an CD45 nicht über 2,6 Sia -Bindung erfolgt. Die Sialinsäuretransferase ST6Gal I ist das einzige Enzym, das Liganden für CD22, genauer gesagt, die N-verknüpfte Kohlenhydratstruktur Sia alpha2-6Gal-beta1-4GlcNAc, herstellen kann. Wir stellten Mäuse her, die doppelt-defizient für ST6Gal I und CD22 waren. Vorher war bereits gezeigt worden, dass ST6Gal-/- Mäuse einen gegenteiligen Phänotyp zu CD22-/- Mäuse zeigen (Hennet et al. 1998). Deshalb war es interessant, doppel-defiziente Mäuse zu untersuchen, um die Regulation der Signalleitung durch CD22 und seine Liganden 2, 6 Sia analysieren zu können. In den Untersuchungen der CD22 x ST6 Gal I-doppel-defizienten Mäuse fanden wir eine Normalisierung der defekten Signalleitung von ST6Gal-/- Mäusen durch die CD22-Defizienz. In CD22 x ST6Gal I-doppel-defizienten Mäusen waren die Ca2+ Antworten und die proliferativen Antworten auf die gleichen Werte wie in CD22-defizienten Tieren erhöht. Ein interessanter anderer Befund war ein Defekt von rezirkulierenden B-Zellen ins Knochenmark von sowohl CD22-/- als auch ST6Gal I-/- Mäusen. Zelltransferexperimente zeigten, dass das „homing“ von rezirkulierenden B-Zellen durch dieses Rezeptor/ Ligandenpaar kontrolliert wird. Schließlich untersuchten wir, ob die negative Regulation der Signalleitung durch CD22 BCR Isotyp-abhängig ist. Eine frühere Veröffentlichung behauptete, dass CD22 IgG-abhängige Antworten nicht inhibiert. Durch Verwendung einer neuen IgG1 knockin-Mauslinie (IgG1i) (von Ari Waisman zur Verfügung gestellt), und durch Herstellung von IgG1i x CD22-/- Mäusen, untersuchten wir die Rolle von CD22 in der IgG1 Signalleitung in vivo. Unser Mausmodell zeigte erhöhte IgG1-vermittelte Signalleitung in Abwesenheit von CD22, und normale CD22 Aktivierung und SHP1 Aktivierung in seiner Anwesenheit. Das bedeutet, CD22 inhibiert IgG1 Signale genauso wie IgM/ IgD Signale. Zusätzlich wurde eine verstärkte IgG1 Signalleitung gefunden, vermutlich erklärbar durch den spezifischen zytoplasmatischen Schwanz von IgG. Diese stärkere Signalleitung von IgG ist revelant, um die erhöhte und schnelle Antwort von Gedächtnis B-Zellen zu erklären
Die Rolle von Butyrophilin subfamily 2 member A2 (Btn2a2) bei der Reifung von T Zellen
No full textButyrophilins (BTNs) and Butyrophilin-like molecules (BTNLs) constitute a family of
transmembrane molecules with structural and functional resemblance to the B7 family
of molecules. Recently, a co-inhibitory role of Btn2a2 on ab T cell activation has been
recognized. In addition, Btn2a2 deficient mice exhibited enhanced effector T cell responses
to immunization and exacerbated disease in a CD4+ T cell-dependent experimental autoimmune
encephalomyelitis (EAE) model. These effects were attributed to hematopoietic
antigen presenting cells (APCs), and Btn2a2 was co-regulated with MHC class II genes.
However, the generality of such observations, the exact role of Btn2a2 in T cell activation,
as well as the cell type responsible for these effects remain unknown. Therefore, in this
study, we aimed to characterize the effects of Btn2a2 in health and disease and delineate
its expression pattern. We found that, rather than showing increased susceptibility
to induced autoimmune disease in murine models of experimental lupus and arthritis,
Btn2a2-/- mice showed spontaneous autoimmunity that occurred with increasing age. This
was manifested by the production of autoantibodies against nuclear antigens and severe
lymphocytic organ intrusions in lacrimal and salivary glands, which were accompanied
by physiological impairments, such as decreased production of lacrimal fluid. In addition,
Btn2a2-/- mice mounted enhanced immune responses against intestinal pathogens, resulting
in superior clearance. Moreover, we show that under physiological conditions, Btn2a2
expression was mainly restricted to the thymus, and this was not due to hematopoietic
APCs but almost exclusively to thymic epithelial cells (TECs). Expression was dependent
on RANKL and, at least in medullary TECs (mTECs), was CIITA-mediated, suggesting
co-regulation with MHC II genes. Mechanistically, we reveal co-inhibitory properties of
Btn2a2 on thymocytes as Btn2a2-Fc interfered with activation-induced apoptosis of DP
and SP thymocytes in vitro, while the lack of Btn2a2 resulted in higher TCR signaling
and activation of OT-II thymocytes, as shown by elevated CD5 levels, a direct measure
of TCR signal strength. Consistently, the peripheral T cell pool of Btn2a2-/- mice was is
skewed towards CD5hi cells, and these cells showed increased basal TCR phosphorylation
in steady-state. Further, we show that Btn2a2-/- mice display reduced T cell numbers, a
state that is associated with lymphopenia-induced proliferation and correlates with autoimmunity
in mice and humans. Thus, we conclude that a CD5-skewed, activation-prone
T cell repertoire incident to a proliferation-promoting, lymphopenic environment, perhaps
in concert with another, yet unknown factor, precipitate in autoimmunity.Butyrophiline (BTNs) und Butyrophilin-ähnliche Moleküle (BTNLs) bilden eine Familie
von Transmembranmolekülen mit struktureller und funktioneller Ähnlichkeit mit der
B7-Familie von Molekülen. Kürzlich konnte eine inhibitorische Rolle von Btn2a2 auf
ab T Zellen in vitro festgestellt werden. Darüber hinaus zeigten Btn2a2-deziente Mäuse
verstärkte Effektor-T-Zell-Reaktionen auf Immunisierung und einen verschlimmerten
Krankheitsverlauf im Modell der CD4+ T-Zell-abhängigen experimentellen Autoimmun-
Enzephalomyelitis (EAE). Diese Effekte wurden hämatopoetischen Antigen-präsentierenden
Zellen (APCs) zugeschrieben, und Btn2a2 wurde zusammen mit MHC-Klasse-II-Genen
reguliert. Die Allgemeingültigkeit dieser Beobachtungen, die genaue Rolle von Btn2a2 bei
der T-Zell-Aktivierung sowie der für diese Effekte verantwortliche Zelltyp sind jedoch
nach wie vor unbekannt. In dieser Studie wollten wir daher die Effekte von Btn2a2 in
Gesundheit und Krankheit charakterisieren und sein Expressionsmuster untersuchen. Obwohl
Btn2a2-/- Mäuse keine erhöhte Anfälligkeit für induzierte Autoimmunkrankheiten
in experimentellen Lupus- und Arthritis-Modellen zeigten, konnten wir eine spontane
Autoimmunität bei Btn2a2-/- Mäusen feststellen, die mit zunehmendem Alter auftrat.
Diese äußerte sich in der Produktion von Autoantikörpern gegen nukleäre Antigene
sowie schweren lymphozytären Organintrusionen in Tränen- und Speicheldrüsen, die mit
physiologischen Beeinträchtigungen einhergingen, wie beispielsweise einer verminderten
Produktion von Tränenflüssigkeit. Darüber hinaus zeigten Btn2a2-/- Mäuse eine verstärkte
Immunantwort gegen Darmpathogene, die mit einer verbesserten Clearance einherging.
Zudem konnten wir zeigen, dass unter physiologischen Bedingungen Btn2a2-Expression
hauptsächlich auf den Thymus begrenzt war, und diese war nicht etwa auf hämatopoietische
Antigen-präsentierende Zellen zurückzuführen sondern fast ausschließlich auf
Thymusepithelzellen (TECs). Reguliert wurde die Expression durch RANKL und war, zumindest
in medullären TECs (mTECs), CIITA-vermittelt, was auf eine Co-Regulation mit
MHC II Gene hindeutet. Mechanistisch beobachteten wir co-inhibitorische Eigenschaften
von Btn2a2 auf Thymozyten, denn Btn2a2-Fc konnte die aktivierungsinduzierte Apoptose
von DP- und SP-Thymozyten in vitro beeinträchten, während das Fehlen von Btn2a2 zu
einem höheren TCR-Signal und stärkeren Aktivierung von OT-II-Thymozyten führte, wie
durch erhöhte CD5 Levels, einem direkten Maß für die TCR-Signalstärke, gezeigt wird.
Im Einklang damit haben wir festgestellt, dass der periphere T-Zell-Pool von Btn2a2-/-
Mäusen einen erhöhten Anteil an CD5hi T Zellen aufweist, und diese Zellen zeigten eine erhöhte basale TCR-Phosphorylierung im Steady-State. Außerdem zeigen wir, dass
Btn2a2-/- Mäuse eine reduzierte T-Zellzahl aufweisen, ein Zustand, der mit Lymphopenieinduzierter
Proliferation einhergeht und mit Autoimmunität bei Mäusen und Menschen
korreliert. Aus diesen Beobachtungen schließen wir, dass ein CD5-verschobenes, aktivierungsanfälliges
T-Zell-Repertoire in einer proliferationsfördernden, lymphopenischen
Umgebung, vielleicht in Verbindung mit einem anderen, noch unbekannten Faktor, Autoimmunität
auslöst
Aufklärung des Tio-NF-kappaB Signalosoms in humanen T-Zellen
No full textNF-kappaB transcription factors are pleiotropic regulators of lymphoid proliferation. Deregulation of NF-kappaB signaling is associated with malignant lymphoproliferative diseases. Whereas ample evidence has accumulated for oncogenic NF-kappaB signaling in tumors of the B cell lineage, only little is known about its role in T-lymphoid malignancies. Herpesvirus ateles is a T-lymphotropic gamma-herpesvirus that induces fulminant T-cell leukemias and lymphomas in New World primates. Its oncogenic phenotype is mediated by the oncoprotein Tio, which is membrane-anchored and mimics a constitutively active, ligand-independent receptor interfering with host-cellular signaling. Infection of human T cells with Tio-expressing herpesviruses induces in vitro growth transformation and leads to the outgrowth of stable cell lines. These T-cell lines can serve as a model system to better understand T-cellular signaling pathways involved in oncogenesis. This work discloses Tio as a potent activator of canonical and non-canonical NF-kappaB signaling. Induction of the canonical NF-kappaB route premises recruitment of the ubiquitin ligase TRAF6 to the N-terminus of Tio. Signal transmission via the IKK complex proceeds through ubiquitin-mediated activation of NEMO and IKK activity. Tio-induced canonical NF-kappaB activity targets the cellular proto-oncogenes cIAP2, IL-8, p100 and RelB. Notably, the inhibition of constitutive canonical signaling in virus-transformed human T-cell lines leads to downregulation of cIAP2, p100 and RelB expression and results in cell death. Thus, Tio-induced canonical NF-kappaB activity is required for the maintenance of a transformed phenotype, i.e. sustained survival and proliferation. Activation of the non-canonical NF-kappaB route is induced independently of TRAF6, NEMO and IKK. Tio triggers processing of the p100 precursor to p52 and leads to subsequent nuclear translocation and DNA binding activity of p52 together with its dimeric partner RelB. These effects are accompanied by stabilization of the central non-canonical regulator NIK. Moreover, the essential modulators of NIK destabilization, TRAF3 and TRAF2, are complexed with Tio and thereby likely sequestered from NIK to foster its stabilization. In addition, Tio causes a decrease of TRAF3 protein levels. This depletion of cellular TRAF3 pools may further augment stabilization of NIK. The induction of non-canonical NF-kappaB activity by Tio was mapped to a C-terminal proline-anchored seven-amino-acid motif. The integrity of this motif is dispensable for canonical NF-kappaB activity, but is required for induction of p100 processing as well as TRAF3 decay. Taken together, Tio triggers each NF-kappaB pathway by a distinct, spatially separable mechanism without any apparent signs of cross-talk. Therewith, Tio provides a tool to dissect oncogenic NF-kappaB signaling pathways in human T cells. Identification of pathway-specific target genes might allow to define novel therapeutic approaches to malignant T-lymphoid diseases associated with aberrant NF-kappaB activation.NF-kappaB Transkriptionsfaktoren sind pleiotrope Regulatoren lymphoider Proliferation. Ihre Deregulation ist mit malignen, lymphoproliferativen Erkrankungen assoziiert. Zahlreiche Hinweise sprechen für eine onkogene Aktivität von NF-kappaB in Tumoren der B-Zell-Reihe, wogegen im Hinblick auf T-lymphoide Tumore nur wenig bekannt ist. Herpesvirus ateles ist ein T-lymphotropes gamma-Herpesvirus, das T-Zell-Leukämien und Lymphome in Neuwelt-Primaten induziert. Sein onkogener Phänotyp wird dem Onkoprotein Tio zugeschrieben, welches membrangebunden vorliegt und einen konstitutiv-aktiven, liganden-unabhängigen Rezeptor imitiert. Die Infektion mit Tio-exprimierenden Herpesviren transformiert humane T-Zellen zu permanentem Wachstum in vitro. Die resultierenden T-Zell-Linien dienen als Modellsysteme zur Aufklärung onkogener, T-zellulärer Signalwege. Diese Arbeit beschreibt Tio als Aktivator des kanonischen und nicht-kanonischen NF-kappaBSignalwegs. Die Induktion des kanonischen NF-kappaB Signalwegs basiert auf der Rekrutierung der Ubiquitin-Ligase TRAF6 an den N-Terminus von Tio. Die Signaltransmission über den IKK-Komplex erfordert eine Ubiquitin-vermittelte Aktivierung von NEMO und die Kinase-Aktivität von IKK. Auf diesem Weg induziert Tio die zellulären Proto-Onkogene cIAP2, IL-8, p100 und RelB. Die Inhibition des konstitutiven, kanonischen Signals in Virus-transformierten humanen T-Zellen führt entsprechend zu einer Herunterregulation der cIAP2-, p100- und RelB-Expression und bemerkenswerterweise auch zum Zelltod. Folglich ist die Tio-vermittelte, kanonische NF-kappaB Aktivität für die Aufrechterhaltung des transformierten Phänotyps notwendig, also für das Überleben und die Proliferation der Zellen. Die Aktivierung des nicht-kanonischen NF-kappaB Signalwegs durch Tio ist unabhängig von TRAF6, NEMO und IKK. Typischerweise induziert Tio die Prozessierung des p100 Vorläuferproteins zu p52, sowie die nukleäre Translokation und DNA-Bindungsaktivität von p52 und RelB. Diese Effekte gehen mit einer Stabilisierung des zentralen, nicht-kanonischen Regulators NIK einher. Des Weiteren komplexiert Tio die essentiellen Modulatoren der NIK-Stabilität, TRAF3 und TRAF2. Dadurch wird NIK wahrscheinlich von diesen Modulatoren getrennt und stabilisiert. Zusätzlich führt Tio zu einer Reduktion des TRAF3-Proteingehalts, was die NIK-Stabilisierung weiter verstärken könnte. Die Induktion der nicht-kanonischen NF-kappaB-Aktivität durch Tio konnte auf ein C-terminales, Prolin-verankertes, sieben Aminosäuren langes Motiv eingegrenzt werden. Die Integrität dieses Motives ist verzichtbar für die kanonische NF-kappaB-Aktivität, aber unabdingbar für die p100-Prozessierung und den TRAF3-Abbau. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass Tio die beiden NF-kappaB-Signalwege unabhängig voneinander durch unterschiedliche, räumlich separierbare Mechanismen auslöst. Damit stellt sich Tio als Instrument zur Aufklärung onkogener NF-kappaB-Signalwege in humanen T-Zellen dar. Die Identifikation Signalweg-spezifischer Zielgene kann neue therapeutische Ansätze für maligne T-lymphoide Erkrankungen eröffnen, die mit abnormer NF-kappaB-Aktivierung einhergehen
Hsc70 Reguliert Den Interzellulären Transfer Des Y-Chromosom Antigens DBY via Mikrovesikel
No full textRecent studies have demonstrated that CD4 T lymphocytes (T cells) can efficiently reject major histocompatibility complex (MHC) class II-negative tumors in vivo. This requires presentation of tumor-associated antigens on surrounding antigen-presenting cells, but the mechanism of intercellular antigen transfer is poorly understood. We hypothesized that intercellular transfer of proteins is not the sole consequence of cell death-mediated protein release but requires an active transfer which depends on KFERQ-like binding motifs on target proteins and the process of microautophagy. To prove this, we used the human Y-chromosome antigen DBY as a model-antigen and identified two putative KFERQ-like motifs. We found that mutation of the first KFERQ-like motif significantly impaired indirect T cell recognition. Moreover, indirect recognition was completely abolished when the peptide was truncated and only encoded the DBY epitope, indicating additional regulatory elements located outside of the T cell epitope are required. Also, we provide evidence that indirect presentation of DBY relies on protein-protein interaction between DBY and heat shock cognate protein 70 and that intercellular transfer is mediated via CD63-positive exosomes. Our data indicate that indirect recognition of tumor-associated antigens on surrounding antigen-presenting cells requires an active process of antigen transfer. Furthermore, by screening a random mutagenesis library, we obtained preliminary data that an additional protein-site in DBY might be important for the selective antigen transfer. Finally, to demonstrate the in vivo relevance of this mechanism, a mouse model of MHC class II-negative tumor rejection was successfully established.Aktuelle Forschungen haben gezeigt, dass CD4 T-Lymphozyten (T-Zellen) Major-Histokompatibilitätskomplex (MHC) Klasse II-negative Tumore in vivo effizient abstoßen können. Dieses Ereignis setzt jedoch die Präsentation von tumor-assoziierten Antigenen auf umliegenden Antigen-präsentierenden Zellen (APZ) voraus, wobei der Mechanismus des interzellulären Antigentransfers weitestgehend unverstanden ist. Möglichkeiten der unkontrollierten Antigenfreisetzung sind beispielsweise durch nekrotische Zellen aber auch nach externen Eingriffen, wie durch Strahlentherapien, gegeben. Im Gegensatz dazu bildet die zellvermittelte Absonderung membranumhüllter Vesikel eine Quelle kontrollierter Antigenfreisetzung. Insbesondere Exosomen gelten dabei als wichtige, interzelluläre Kommunikationsvehikel von denen bekannt ist, dass sie Nukleinsäuren, Lipide und Proteine transportieren. Erst kürzlich wurde beschrieben, dass zytosolische Proteine durch das artverwandte Hitzeschockprotein 70 (hsc70) zu intraluminalen Vesikeln des späten Endosoms transportiert werden können. Mechanistisch geschieht dies durch einen mikroautophagie-ähnlichen Signalweg, bei dem die Erkennung sogenannter KFERQ-like Signalmotive auf Zielproteinen von entscheidender Bedeutung ist. Die vorliegende Arbeit hat den Fokus, den Mechanismus des interzellulären Antigentransfers zu charakterisieren. Dabei wurde die Hypothese aufgestellt, dass dem interzellulären Antigentransfer ein aktiver Transport zugrunde liegt, welcher mechanistisch durch hsc70 und in mikroautophagie-ähnlicher Art und Weise vermittelt wird. Um dieser Annahme nachzugehen, wurden zunächst Tumorzelllinien generiert, die mit dem vollständigen humanen Y-Chromosom Antigen DBY, dessen X-Chromosom Homolog DBX, dem CD4 T-Zellepitop von DBY (Polypeptid, DBY 25-mer) und dem vollständigem DBY mit Mutationen (in jeweils einer oder beiden putativen hsc70 Bindungsstellen) transduziert wurden. Nach interzellulärem Transfer konnte eine T-Zellaktivierung für das vollständige DBY und für eine der beiden Einzelmutanten gemessen werden. Hingegen war die T-Zellerkennung der anderen Einzelmutante und der Doppelmutante signifikant reduziert, sowie im Falle des DBY 25-mers sogar vollständig abwesend. Weitere Untersuchungen, die mit Hilfe eines Immunassays durchgeführt wurden, ergaben, dass die Protein-Protein Interaktion zwischen hsc70 und der sensitiven DBY Einzelmutante deutlich reduziert war, während keine Interaktion mit dem kurzen DBY 25-mer beobachtet wurde. Diese Daten unterstützen die Hypothese, dass der interzelluläre Antigentransfer spezifisch reguliert werden kann, wobei hsc70, wie initial vermutet, eine wichtige Rolle zu spielen scheint. Da es nach Übertragung von Kulturüberständen transgenpositiver HeLa-Zellen auf Antigennegative APZ zur T-Zellaktivierung kam, konnte gezeigt werden, dass es sich um einen zellkontaktunabhängigen Transfer des Antigens handelte. Darüber hinaus zeigte eine elektronenmikroskopische Untersuchung der transduzierten Zellen eine Assoziation von DBY mit dem exosomen-assoziierten Tetraspanin-30 (CD63). Um dies im Detail zu analysieren, wurden Exosomen aus Zellkulturüberständen transgenpositiver HeLa-Zellen mittels differentieller Ultrazentrifugation aufgereinigt und auf antigennegative APZ übertragen, um anschließend die T-Zellerkennung zu untersuchen. Dabei fiel auf, dass das vollständige DBY den T-Zellklon aktivieren konnte, während die sensitive DBY Mutante eine deutlich reduzierte T-Zellerkennung aufwies und das DBY 25-mer wiederum nicht zur T-Zellaktivierung führte. Außerdem konnte das vollständige DBY in isolierten CD63-positiven Exosomen auf Proteinebene nachgewiesen werden. Diese Daten zeigen, dass die indirekte Erkennung von tumor-assoziierten Antigenen auf umliegenden APZ das Ergebnis eines aktiven Antigentransfers via sezernierte Mikrovesikel sein kann. Da die Mutation der putativen hsc70 Bindungsstellen jedoch nur zu einer Reduktion des interzellulären Transfers und nicht zu einer vollständigen Blockade führten, wurden Klonbibliotheken mit mutierten DBY Konstrukten zur Identifikation weiterer regulatorischer Elemente generiert. Interessanterweise wiesen die Daten darauf hin, dass der selektive Antigentransfer von DBY durch eine weitere Stelle in der Proteinsequenz reguliert sein könnte. Um diesbezüglich genauere Aussagen treffen zu können, werden künftig weitere Untersuchungen durchgeführt. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass die Bindung von hsc70 an putative KFERQ-like Motive in der Proteinsequenz des humanen DBY mit dem interzellulären Transfer korreliert. Die in dieser Forschungsarbeit erhobenen Daten weisen außerdem darauf hin, dass die interzelluläre Übertragung von DBY spezifisch durch sekretierte, CD63-positive Exosomen erfolgt. Diese Ergebnisse stellen hsc70 als möglichen Regulator für den interzellulären Antigentransfer bestimmter zytosolischer Proteine dar. Um die in vivo Relevanz des hier beschriebenen Mechanismus beantworten zu können, wurde im abschließenden Teil dieser Arbeit ein Mausmodell zur Untersuchung der Abstoßung von MHC Klasse II-negativen Tumoren etabliert. Künftige Forschungsarbeiten werden sich daher mit der in vivo Immunantwort beschäftigen, um den Einfluss der Bindung von hsc70 an tumor-assoziierte Antigene bei der Eradikation von MHC Klasse II-negativen Tumoren beurteilen zu können
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