1,721,022 research outputs found
Growth promoter modulation of drug metabolizing enzymes gene expression in primary cultures of cattle hepatocytes
No full textEffetto del desametasone, impiegato come promotore della crescita, sull'espressione di geni glucocorticoido-responsivi nel fegato e nel testicolo di bovino
No full textNegli ultimi anni particolare importanza ha assunto la tossicogenomica, cioè lo studio delle correlazioni tra la struttura e l’attività del genoma e gli effetti tossici degli xenobiotici [1].
Il bovino, rappresenta una delle specie di interesse veterinario economicamente più importanti. Proprio per questo l’incremento delle performance zootecniche tramite la somministrazione di promotori della crescita (PC) resta uno dei temi più impegnativi da affrontare nell’ambito della Sanità Pubblica. A livello di Unione Europea l’uso dei PC è vietato (Dir. CEE 96/22 e 96/23); ciononostante, risultati ottenuti a seguito di controlli ufficiali sembrano indicare un uso continuo di sostanze quali ormoni anabolizzanti, β-agonisti e corticosteroidi come il desametasone (DEX) [2]. Da qui la necessità di chiarire gli effetti dei PC sulla specie bovina nonché, eventualmente, individuare potenziali biomarcatori molecolari di trattamento illecito tramite metodiche diagnostiche specifiche e sensibili.
Nel corso del presente studio sono state condotte prove sperimentali in cui il DEX è stato somministrato, nel bovino, utilizzando protocolli di trattamento illecito presumibilmente utilizzati nell’allevamento intensivo del bovino da carne. In particolare, il DEX è stato somministrato a basse dosi e per almeno tre settimane durante la fase di finissaggio (quella che precede la macellazione). Al termine della fase sperimentale, gli animali sono stati macellati e aliquote di fegato e testicolo sono state prelevate, poste in RNA-later e congelate a -80°C sino al momento dell’analisi. Gli effetti del corticosteroide sono stati indagati su geni notoriamente classificati come DEX-responsivi nell’uomo e nelle specie da laboratorio, quali il recettore per i glucocorticoidi (GR), il fattore di trascrizione pregnane X receptor (PXR), la tirosina aminotransferasi (TAT) ed il citocromo P450 3A4-like (CYP3A4-like). Le eventuali variazioni dei profili di espressione genica imputabili al trattamento con PC sono state determinate ricorrendo alla tecnica della RT-real time PCR ed utilizzando la chimica/fluoroforo del Sybr Green.
Entrambe le matrici considerate hanno in primis palesato lo stesso pattern di modulazione a seguito della somministrazione di DEX. In particolare, e sorprendentemente, si è riscontrata una generale riduzione delle quantità di RNA messaggero che, nel caso del CYP3A4-like, è risultata essere significativa (p<0.01) a livello testicolare.
Tali risultati sembrano apparentemente in contrasto con quanto riportato in letteratura. Il desametasone, infatti, è in grado di indurre l’espressione del CYP3A4 in epatociti umani in coltura primaria mediante l’attivazione di GR e PXR secondo un processo bifasico: a basse concentrazioni (10-7 M) il CYP3A4 viene indotto indipendentemente dallo xenobiotico grazie all’attivazione GR-mediata di PXR; a concentrazioni maggiori (10-5 M), invece, il DEX lega e attiva il PXR, che a sua volta induce il CYP3A4 per la presenza di alte concentrazioni del ligando specifico [3]. I risultati ottenuti nel corso del presente studio e relativi a GR e PXR sarebbero confermati anche dalla TAT, un gene considerato un ottimo modello per la valutazione degli effetti degli xenobiotici sull’espressione del GR [4], sebbene risultati contraddittori siano stati già riportati in letteratura [5-6].
Pertanto, l’effetto riscontrato nel bovino a seguito del trattamento con DEX potrebbe essere imputato: a) alle basse dosi impiegate; b) ad un diverso meccanismo d’azione di questa molecola nella specie bovina, analogamente a quanto è già stato riscontrato tra coniglio e ratto [7]. Infatti, indagini filogenetiche sulla famiglia del CYP3A hanno evidenziato differenze di sequenza dell’isoforma proteica tali per cui il CYP3A4-like di bovino dovrebbe essere più correttamente denominato CYP3A28, indice di un potenziale diverso comportamento biochimico tra bovino e altre specie (Giantin et al., dati personali). Infine, uno studio recente ha dimostrato la presenza di differenze di specie nel ligand binding domain di PXR e di conseguenza nell’affinità di ligandi specifici nei confronti di questo stesso recettore [8].
Nel complesso rimangono aperti più spunti di ricerca e le prospettive future saranno dunque quelle di approfondire i risultati preliminari ottenuti e di chiarire alcuni degli aspetti di difficile interpretazione qui riscontrati, nel tentativo di apportare nuove conoscenze sugli effetti dei PC sul trascrittoma del bovino
Identificazione di specie in soggetti appartenenti alla famiglia Soleidae mediante tecnica PCR-RFLP
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Proposed new nomenclature for Bos taurus cytochromes P450 involved in xenobiotic drug metabolism
No full textThe cytochrome P450 (CYP) superfamily of drug metabolizing enzymes (DMEs) plays a central role in the oxidative metabolism of xenobiotics to which living organisms are exposed. In Bos taurus (cattle), a definitive nomenclature for CYP proteins is still lacking, and to unambiguously settle cattle nomenclature a phylogenetic analysis of proteins belonging to CYP 1-4 families was performed. Sequences collected from GenBank and Dr Nelson's P450 homepage databases were analyzed according to the maximum likelihood method. Phylogenetic outputs showed that CYPs sharing the same name and collected from different species did not form, in several instances, monophyletic groups. Some cattle CYPs did not group with their supposed human orthologous counterparts, thus requiring a new nomenclature. Name changes mostly mirrored the orthologous counterparts established for other species, and new names were created when no clear orthologous sequences were identified. The new nomenclature will allow a more appropriate investigation of biochemical and molecular mechanisms involved in the expression and regulation of these DMEs
Metabolism of boldenone by primary cultures of bovine hepatocytes
No full textTo complete our investigation on the in vitro metabolism of 17b-Boldenone (b-BOLD),
the biotransformation of b-BOLD and androsta-l,4-diene-3,17-dione (ADD) was studied
. using primary bovine hepatocyte cultures incubated for 3,6 and 24 hours with 100uM of
b-BOLD or 100uM of ADD or a combination of both (90 uM b-BOLD + 10 uM ADD).
The metabolites were separated and identified by liquid chromatography-high resolution
mass spectrometry. After 6 h of incubation with b-BOLD a significant amount was oxidized
into ADD or transformed into hydroxylated metabolites. After 24 h, the production of
hydroxylated (OH) metabolites of b-BOLD (6b-OH, 17b-BOLD, 6b-OH, 17a-BOLD and
l 6a-OH,17a-BOLD) and ADD (6-0H-ADD) was confirmed; 17a-Boldenone (a-BOLD)
was among the main metabolites detected, and ADD was found to a minor extent only.
When culture cells were incubated with both b-BOLD and ADD, the metabolic pattern of
BOLD prevailed. When ADD alone was added to celi cultures, after 6 hours the formation of
b-BOLD was observed, a-BOLD was the main metabolite found after 24 h, and 6-0H-ADDs
were also detected. As observed with other anabolic steroids, dihydroxylated metabolites of
boldenone were also detected
Comparative evaluation of DNA extraction methods for detection of GMO in food
No full textExtraction of DNA from the sample matrix is a critical step in the detection of transgenic DNA in
food and feed. The extraction efficiency can be affected by several factors such as the degree of processing of the foodstuffs and the presence of PCR inhibitors in the food sample.
The aim of this work was the comparative analysis of the following five commercial DNA extraction and purification methods: Wizard“ Minipreps DNA Purification Resin (Promega), Custom
Magnetic DNA Purification Reagents (Promega), Generation TM Capture Column Kit (Gentra
Systems), Puregene“ DNA Isolation Kit (Gentra Systems), Gene Elute Plant Genomic DNA Purification Kit (Sigma-Aldrich). DNA was isolated from simple (flours), complex ( feeds) and processed matrixes (bread, cakes and cookies) containing maize and/or soy among the ingredients. The
quality and the concentration of the extracted DNA were determined spectrophotometrically
while its suitability to PCR reaction was examined using a PCR system based on the amplification
of two endogenous DNA sequences of maize and soy (zein and lectin, respectively). If amplifiable
DNA was found, samples were then checked for the presence of the 35S promoter and of the cryia
(Bt176 maize) and GTS (Roundup Ready soy) genes. As expected, the efficiency of DNA extraction
was related to the type of matrix and to extraction method used. When compared for efficiency,
the Wizard method showed the best results in terms of recovery and quality of DNA. Furthermore, by introducing some modifications to the standard procedure, the Wizard method allowed the
recovery of amplifiable DNA also from highly processed food matrixes such as cookies and cakes.
However, when the speed of the methods was compared, the Wizard method and the DNA Elution Kit (Gentra) showed the longest processing times. Finally, from a few processed matrixes
(corn flakes and chocolate wafers) it was not possible to obtain DNA with any of the five tested
method
Steroidogenic enzyme gene expression profiles in the testis of cattle treated with illicit growth promoters
No full textRecently, the effect of illicit growth promoters (GPs) upon the cattle transcriptome has drawn the increasing attention of the scientific community. In the present study, the pre-transcriptional effects of three different illicit protocols on a set of target genes, including steroidogenic enzymes and three related transcription factors, were estimated in cattle testis. Beef cattle were administered with dexamethasone (DEX) orally (group D(1)) or intramuscularly in experiment 1 (group DIM). In experiment 2, DEX was orally administered alone (group D(2)) or with 17β-estradiol (group DE), and in experiment 3, dehydroepiandrosterone and boldione were orally administered alone (group DHEA and group ADD) or in combination (group DHAD). The GP effects were measured by quantitative real time RT-PCR. The results of our study were significant but not univocal. A GP-dependent effect on target gene mRNA levels was noticed for 3β-hydroxysteroid dehydrogenase type 1 (HSD3β1,p<0.05 and p<0.01 for the D(2), DE and DHAD groups, respectively), the cytochrome P450 side chain cleavage (DHAD, p<0.05), the cytochrome P450 17A1 (DIM and D(2), p<0.05), HSD17β3 (DE, p<0.05), aromatase (DHEA, p<0.05), the androgen receptor (DHAD, p<0.05) and the mineralocorticoid receptor-like (DIM, p<0.05). Our present results suggest that different GP schedules are likely to affect genes involved in steroid synthesis and regulation in cattle testis. Thus, this tissue might be considered a potential surrogate tissue that warrants further study into its usefulness in the screening of GP abuse
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