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Ruolo delle proteine Gas/Phr nella morfogenesi e virulenza di Candida albicans
No full textLe proteine Gas, Phr e Gel, rispettivamente di Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans e Aspergillus fumigatus, catalizzano l’allungamento e il rimodellamento del beta(1,3)-glucano della parete cellulare. Appartengono alla famiglia GH72 assieme ad altre 90 proteine di origine unicamente fungina. Questi enzimi condividono la presenza di un glicosilfosfatidilinositolo (GPI) che li ancora alla membrana plasmatica. In C. albicans le proteine GH72 sono codificate da una famiglia multigenica costituita da due geni regolati in modo opposto dal pH ambientale, PHR1 e PHR2, e dai geni PHR3, PGA4 e PGA5. Il gene PHR1 è stato oggetto dei nostri studi. E’ espresso in modo pH-dipendente a partire da pH 5.5. A valori di pH ambientale leggermente alcalini (7.5-8) i mutanti nulli phr1 presentano un ridotto livello del beta(1,3)-glucano di parete e marcati difetti morfologici. Inoltre sono avirulenti in modelli di infezione sistemica nel topo. Finora non sono state esplorate le ragioni della ridotta virulenza anche se è stata riscontrata un’accresciuta accessibilità dello strato di glucano all’interazione con le cellule immuni. Poiché l’adesione e l’invasione sono di fondamentale importanza nella virulenza di C. albicans, abbiamo determinato il contributo di Phr1p in questi processi. I mutanti nulli phr1 hanno presentato una riduzione dell’adesione di circa il 70 % rispetto al ceppo isogenico e l’ incapacità di invadere lo strato di cellule epiteliali in modelli di epiteli umani ricostituiti. Per poter correlare questi difetti con il ruolo della proteina abbiamo proceduto allo studio della localizzazione di Phr1p. Abbiamo creato una proteina ibrida costituita dalla Phr1 e dalla Green Fluorescence Protein (GFP). Durante la crescita sotto forma di lievito, la proteina Phr1-GFP si localizzava in siti discreti della membrana plasmatica in accordo con la sua associazione ai lipid rafts. Dopo induzione della crescita ifale, Phr1-GFP era concentrata all’apice dei germ tubes e delle ife. Questi risultati complessivamente suggeriscono che Phr1p sia richiesta nelle aree di crescita polarizzata, probabilmente per facilitare l’incorporazione del glucano nella parete in fase di espansione. Inoltre, il mancato rimodellamento del beta(1,3)-glucano causa difetti di adesione e invasione che possono in parte spiegare la ridotta virulenza del mutante nullo phr1.
Questo lavoro è stato in parte finanziato dal PRIN 2005 e contratto Cantrain EU RTN N. 5124
Enzimi di rimodellamento della parete cellulare quali potenziali target per antifungini
No full textLa formazione della parete, esoscheletro essenziale per la vita dei funghi, dipende dalla costruzione di una rete di beta-(1,3)-glucano alla quale si legano gli altri costituenti quali le mannoproteine e la chitina. Diverse attività enzimatiche concorrono al processo di costruzione della parete e ai suoi dinamici cambiamenti in risposta a stimoli morfogenetici, a condizioni ambientali avverse, all’interazione con le cellule dell’ospite o al trattamento con farmaci antifungini. Molti enzimi presiedono alla biosintesi, degradazione e rimodellamento della parete. Gli enzimi appartenenti alla famiglia GH72 (database CaZy) svolgono una funzione essenziale poiché tagliano e rilegano fra loro porzioni di beta-(1,3)-glucano, conferendo alla parete la resistenza richiesta per accompagnare processi fondamentali quali la crescita polarizzata e l’allungamento delle ife. L’assenza di questi enzimi determina aberrazioni morfologiche, incapacità di sostenere la crescita apicale e avirulenza nei funghi patogeni per l’uomo testati in modelli animali d’infezione fungina sistemica. Gli enzimi GH72 sono ancorati alla membrana plasmatica attraverso un glicolipide (GPI). Sono presenti sotto forma di famiglie multigeniche in tutte le specie fungine la cui sequenza genomica è stata annotata ma sono assenti nell’uomo. Tra le famiglie piu’studiate vi sono la famiglia GAS del lievito Saccharomyces cerevisiae (5 geni), la famiglia GEL del fungo patogeno Aspergillus fumigatus e la famiglia PHR di Candida albicans, a cui appartengono 5 geni: PHR1, PHR2, PHR3, PGA4 e PGA5.
Per caratterizzare le funzioni di queste proteine, capire il significato della loro ridondanza e valutare il loro potenziale uso quali target per nuovi antifungini abbiamo intrapreso diversi studi mirati a localizzare le proteine nella cellula e alla messa a punto di metodi per saggiare la loro attività in modo semplice. Gli studi delle proprietà biochimiche basilari delle varie isoforme enzimatiche sono utili in previsione di possibili applicazioni quali l’allestimento di saggi cell-free in formato micro-titer da utilizzarsi per la ricerca di inibitori.
La proteina Phr1, sotto forma di ibrido con la GFP (Phr1-GFP), si localizza nella gemma in espansione, all’apice delle ife e nel setto di divisione. L’attività GH72 è quindi richiesta nei siti dove avviene un’intensa sintesi di nuova parete cellulare. Abbiamo perturbato la formazione del setto attraverso l’uso di un inibitore della chitina sintasi 1 (Chs1p), enzima essenziale in C. albicans, e concluso che la proteina Phr1p si localizza lungo tutto lo spessore del setto di divisione in stretta dipendenza con la formazione del disco di chitina ai due lati del quale si deposita nuova parete.
Per lo studio delle proprietà biochimiche abbiamo sviluppato un saggio fluorescente per la determinazione dell’attività transferasica utilizzando le proteine Phr prodotte via DNA ricombinante in un organismo eterologo e purificate
Phr1p: un nuovo componente del setto in Candida albicans
No full textPHR1 appartiene a una famiglia di 5 geni di C. albicans (PHR1-3, PGA4 and PGA5). L’espressione di PHR1 dipende dal pH ambientale e si attiva a valori di pH > 5.5. Phr1p è dotata di attività di β(1,3)-glucanosil-transferasica (Famiglia GH72) simile a quella delle proteine Gas di S. cerevisiae e delle proteine Gel di A. fumigatus. A pH restrittivo, la perdita di PHR1 induce gravi difetti morfologici, un aumento compensativo di chitina, incapacità di condurre crescita ifale, di aderire e invadere gli epiteli umani ricostituiti. I mutanti nulli PHR1 sono avirulenti in modelli di topo di infezione sistemica. Tramite l’uso di una proteina ibrida Phr1p-GFP, abbiamo localizzato la proteina a livello della gemma, dell’apice delle ife e nel setto sia di divisione che dei setti presenti nelle ife. Quando Phr1p si localizza nel setto crea delle linee molto brillanti ad indicare che la proteina si concentra in grandi quantità lungo la struttura del setto. Questi risultati suggeriscono che Phr1p sia sempre presente laddove avviene sintesi di nuova parete.
Abbiamo ulteriormente analizzato il ruolo di Phr1p quale componente del setto. Abbiamo utilizzato il mutante deleto nel gene codificante per Chs3p, l’enzima responsabile della formazione del chitin ring, un anello che circoscrive il setto di divisione (setto primario) e che rimane, una volta terminata la divisione cellulare, sotto forma di cicatrice (bud scar) sulla superficie della cellula madre. A differenza di Gas1p di S. cerevisiae, la proteina Phr1p non si lega covalentemente al chitin ring. Quindi il meccanismo che opera in lievito e trattiene Gas1p nel chitin ring non è presente in C. albicans.
Infine, Phr1p-GFP si localizza in stretta vicinanza del setto primario suggerendo che potrebbe essere richiesta per la formazione e il remodeling del setto secondario che si deposita ad ambo i lati del setto primario. Concentrazioni citostatiche di un inibitore altamente specifico per l’enzima chitina sintasi 1 (Chs1p), essenziale per la sintesi del setto primario e per l’integrità della cellula, diventano citocida in assenza di Phr1p. Gli studi hanno evidenziato gravi difetti nella segregazione nucleare e suggeriscono che Phr1p e Chs1p cooperino nel mantenere l’integrità della cellula e nell’acccoppiare la morfogenesi al ciclo di divisione nucleare
Glucan remodelling enzymes : expression, localization and replacement during morphological transitions in fungi
No full textThe formation of a core beta(1,3)-glucan is crucial for cell wall functions in fungi. The glucan network results from a vast array of biosynthetic, degradative and remodeling activities. Enzymes classified as GH72 in the CaZy database are glucanosyltransferases that cleave and relegate beta(1,3)-glucan chains. The elongation of branching points in glucan chains creates anchoring sites for cell wall components and is crucial for the maintenance of cell integrity. In general, these enzymes are plasma membrane GPI-anchored proteins but can be also covalently linked to the cell wall. A phylogenetic analysis indicates that GH72 enzymes are uniquely present in the Kingdom Fungi and form redundant families of orthologous proteins suggesting specialized roles among various species. The best characterized enzymes belong to the Gel/Gas/Phr families of Aspergillus fumigatus (7 members), Saccharomyces cerevisiae (5) and Candida albicans (5), respectively. ScGas1p-Gas5p are specialized in cell wall remodelling whereas Gas2p-Gas4p are essential for the formation of the spore wall, a process that takes place in the citoplasm of a diploid cell. ScGas family is regulated at the level of transcription, protein stability and localization. Recently, using a new enzyme assay, we found that optimum pH for activity is different for Gas1p-Gas5p compared to Gas2p-Gas4p. This suggests that different isoforms are required in order to function optimally at the interface between the cell and the extracellular space or the spore surface and the cytosol. We also studied PHR1 and PHR2, two-pH responsive genes of C.albicans. Phr1p-GFP concentrates at the bud periphery, hyphal apex and septum indicating that Phr1p activity is required at sites of active wall synthesis. The effects of defective septum formation on Phr1-GFP localization were studied in detail. The role of Phr1p in septum formation and in the biology of the human fungal pathogen C. albicans is currently under investigation
The Gas1 glycoprotein, a putative wall polymer cross-linker
No full textThe yeast cell wall, which for years has been regarded as a static cellular component, has been revealed to be dynamic in its structure and composition and complex in its enzymatic activity. The S. cerevisiae cell wall is composed of beta-1,3/beta-1,6-glucans, mannoproteins, and chitin, which are assembled into an extracellular matrix essential for maintenance of cell integrity. Gas1p, a glycoprotein anchored to the outer leaflet of the plasma membrane through a glycosylphosphatidylinositol, plays a key role in cell wall assembly. Loss of Gas1p leads to several morphogenetic defects and to a decrease in the amount of cross-links between the cell wall glucans. These defects in turn trigger a compensatory response that guarantees cell viability. Several Gas1p homologs have been isolated from Candida species and S. pombe. The Gas1p family also includes two plant proteins with endo-beta-1,3-glucanase activity. Sequence comparisons reveal that Gas1p family proteins have a modular organization of domains. The genetic and molecular analyses reviewed here suggest that Gas1p could play a role as a polymer cross-linker, presumably by catalyzing a transglycosylation reactio
Defects in assembly of the extracellular matrix are responsible for altered morphogenesis of a Candida albicans phr1 mutant
No full textAnalysis of Candida albicans cells using antibodies directed against Gas1p/Ggp1p, Saccharomyces cerevisiae homolog of Phr1p, revealed that Phr1p is a glycoprotein of about 88 kDa whose accumulation increases with the rise of external pH, This polypeptide is present both in the yeast form and during germ tube induction, In the Phr1(-) cells at pH 8 the solubility of glucans in alkali is greatly affected. In the parental strain the alkali-soluble/-insoluble glucan ratio shows a 50% decrease at pH 8 with respect to pH 4.5, whereas in the null mutant it is unchanged, indicating the lack of a polymer cross-linker activity induced by the rise of pH, The mutant has a sixfold increase in chitin level and is hypersensitive to calcofluor. Consistently with a role of chitin in strengthening the cell wall, Phr1(-) cells are more sensitive to nikkomycin Z than the parental strain
Identification of a labile protein involved in the G1 to S transition in Saccharomyces cerevisiae
No full textThe biochemical nature of the start process that commits budding yeast to DNA synthesis is not known. Kinetic evidence has suggested recently that short-lived protein(s) may have to accumulate to a critical level before the cell cycle may progress towards DNA synthesis and cell division. We investigated by high-reslution two-dimensional electrophoresis whether, in a cdc25-1 mutant strain of Saccharomyces cerevisiae that had been blocked at the regulatory step called 'start' by growth at a restrictive temperature, short-lived proteins are synthesized during the recovery of growth at a permissive temperature. Of the ~500 proteins resolved by the two-dimensional electrophoresis, 6 were short-lived. Only one of them (M(r) = 100,000 pI ~ 4.8-5) appears to be specifically made during the G1-to-S transition at start. A regulatory role for cell cycle progression in yeast is suggested for this protein, p100
Localization of Phr1p to the septum and glucan remodeling in Candida albicans
No full textPHR1 belongs to a family of five genes of C. albicans (PHR1-3, PGA4 and PGA5). PHR1 expression is triggered at external pH values > 5.5. Phr1p is endowed with β(1,3)-glucan elongase activity (GH72) similarly to Gas1p of S. cerevisiae and Gel proteins of A. fumigatus. At the restrictive pH, loss of PHR1 induces morphological defects, a compensatory increase of chitin, inability to support hyphal growth, to adhere and invade human epithelia. PHR1 mutants are avirulent in mouse models of systemic infection. By use of a GFP-Phr1 hybrid protein, we detected the protein preferentially at the bud periphery, bud-neck and septum. During hyphal growth Phr1p-GFP concentrated at the tip of the germ tubes and gradually distributed along the lateral side of the hyphae. Phr1p also localized to the septa of the hyphae appearing as a bright line. These results indicate that Phr1p localizes preferentially to sites of active wall formation. We further studied the localization of Phr1p in the septum region by analyzing cells lacking Chs3p, that synthesizes the chitin ring at the rim of the primary septum. Differently from ScGas1p, that is cross-linked to the chitin ring and remains in the bud scars even after several generations, Phr1p-GFP did not persist indicating that the mechanisms active in tethering Gas1p to the bud scars in S. cerevisiae are not operative in C. albicans. Further, Phr1p-GFP was localized at/or in close proximity of the primary septum indicating that it could be required for glucan remodeling of the secondary septa. Further, cytostatic concentrations of a highly specific inhibitor of the activity of Chs1p, essential for the synthesis of the primary septum and for cell integrity, proved to be fungicidal in the absence of Phr1p. The results of these studies and the detection of defects in nuclei segregation, suggest that Phr1p and Chs1p synergically cooperate in maintaining cell integrity and coupling morphogenesis with nuclear division
Protein Synthesis, Processing and Trafficking
No full textThe final step in the transfer of the genetic information stored in DNA into proteins is the translation of the intermediary messenger molecules, mRNAs (see Chapter 3). Protein synthesis occurs in the cytoplasm and generates a great variety of products endowed with a wide spectrum of functions. The complete set of proteins produced by a cell is called “proteome” and is responsible for the remarkable diversity in cell specialization that is typical of metazoan organisms. In order to be functional, proteins need to be properly folded, assembled and transported to the final destination if required. The cell has in its interior several membrane-bound compartments, termed organelles, such as the mitochondria, the peroxisomes, the nucleus and the endoplasmic reticulum to which the proteins may be targeted. Since each compartment serves a particular purpose, protein transport is crucial to maintain the identity and functions of each organelle. The intracellular physiology depends on the proper functioning of the organelles. In many cases protein folding and processing are coupled with protein trafficking so that the targeting process is unidirectional and irreversible.
This chapter briefly describes how proteins are synthesized and then focuses on their processing and delivery to their appropriate destinations within the cell. An understanding of the machines that catalyze protein folding, assembly, and targeting is relevant to the study of hematology providing a basis for an explanation of how malfunctions in these processes can cause blood disorder
The yeast cell-wall salvage pathway
No full textThe integrity of the cell wall depends on the synthesis and correct assembly of its individual components. Several environmental factors, such as temperature up-shift, treatments with mating factors or with specific cell wall-perturbing drugs, or genetic factors, such as inactivation of cell wall-related genes (for example FKS1 or GAS1) can impair construction of the cell wall. As the cell wall is essential for preserving the osmotic integrity of the cell, several responses are triggered in response to cell-wall damage. This review focuses on the activation of salvage pathways that guarantee cell survival through remodeling of the extracellular matrix. These researches have useful implication for the study of similar pathways in human fungal pathogens, and for the evaluation of the efficacy of new antifungal drugs
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