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An inducible mouse model of late onset Tay-Sachs disease
No full textMouse models of the GM2 gangliosidoses, Tay–Sachs and Sandhoff disease, are null for the hexosaminidase ? and ? subunits respectively. The Sandhoff (Hexb?/?) mouse has severe neurological disease and mimics the human infantile onset variant. However, the Tay–Sachs (Hexa?/?) mouse model lacks an overt phenotype as mice can partially bypass the blocked catabolic pathway and escape disease. We have investigated whether a subset of Tay–Sachs mice develop late onset disease. We have found that not, vert, similar65% of the mice develop one or more clinical signs of the disease within their natural life span (n = 52, P < 0.0001). However, 100% of female mice with repeat breeding histories developed late onset disease at an earlier age (n = 21, P < 0.0001) and displayed all clinical features. Repeat breeding of a large cohort of female Tay–Sachs mice confirmed that pregnancy induces late onset Tay–Sachs disease. Onset of symptoms correlated with reduced up-regulation of hexosaminidase B, a component of the bypass pathway
Synthesis and analysis of conformationally restricted ceramide analogs : (Synthese und Untersuchung konformativ fixierter Ceramidanaloga)
No full textCeramide (e.g. (2S,3R,4E)-2-Octadecanoylamino-octadec-4-en-1,3-diol) is a structural component of membrane glycosphingolipids and sphingomyelin, and occurs in free form as well as bound to proteins in the human skin (Kolter and Sandhoff, 1999). Certain conformationally rigid analogs of this lipid, such as 5b and 24, showed an unexpected interference with the biosynthesis of complex glycosphingolipids such as that of ganglioside GM2 (GalNAcβ1,4-(NeuAcα2,3)Galβ1,4Glcβ1Cer; Figure 1.2). To get insight into the molecular mechanism of this apparent inhibition, a series of experiments have been carried out in this work: 1) New structural analogs of the halogenated oxazinanone (5a) and oxazolidinone (5b) have been prepared, and analysed in cultured cells. 1a) The preparative route that gave access to these compounds was used for the preparation of the brominated compounds 7.2a and 7.2b. At least in cultured fibroblasts, the biosynthetic incorporation of 3-[14C]L-serine into cellular glycosphingolipids in the presence of 5b and 7.2b were similar. 1b) To further address the role of the halogen atom, oxazinanones bearing a hydroxyl group instead of a halogen (18a,b) were prepared from phytosphingosine. As has been shown before, these substances were not accessible on the route used otherwise due to a competing rearrangement reaction. 18a and 18b showed entirely different lipid labelling patterns, when glycosphingolipid biosynthesis is analysed in cultured neurons. These data indicate a vital role of the halogen atom for the observed effects. 1c) Other structural analogs of 5a and 5b were prepared and analyzed: Title compounds bearing an additional methyl group in the head group were prepared from L-threonine. 23.2a behaved similar to 5a when analysed in cultured fibroblasts, indicating that the substituent does not hinder the molecular interaction leading to the observed effects. 2) An appropriate way to investigate metabolism of 5a or 5b, was well as to address the question, if these substances are covalently bound to certain cellular proteins, is the incorporation of a suitable radioisotope into these substances. In model experiments, conditions for two reactions were found, under which incorporation of a tritium atom into newly synthesized suitable precursor substances should be possible, at least in low yields. 3) Oxazinanone 12 with an azide group within the alkyl chain was prepared. This substance should allow the identification of potential metabolites via Staudinger ligation, together with the identification of putative protein targets after affinity purification. 4) Initially, 5a and 5b, as well as potential glycosidated metabolites, have been investigated on their effect of ganglioside GM2 synthase, a membrane bound N-acetylgalactosaminyltransferase of the Golgi-apparatus. Baculovirus-infected insect cells overexpressing this enzyme were used as enzyme-source to investigate 5b in a liposomal assay system, since alteration of membrane properties caused by the compound has to be excluded as reason for the observed effects. Due to the instability of the enzyme in the proteoliposome preparation, no conditions could be found to analyse this possibility. Also a micellar GalNAc transferase assay in the presence of lipid extracts derived from fibroblast cells incubated with 5b showed no inhibition. 5) Metabolites of 5b were searched for by thin layer chromatography and mass spectrometry. For this purpose, fragmentation pattern of 5a, 5b, and a glucosylated potential metabolite were recorded and used for parent ion- and neutral loss-scans in the lipid extract of cultured fibroblasts. No metabolites could be found by this method. For glycolipid quantification and analysis of molecular species distribution in the lipid extract of cells by electrospray (ESI) and atmospheric pressure chemical ionisation (APCI) mass spectrometry, a ganglioside GM3 and a sulfatide derivative were prepared as glycolipid standards with appropriate alkyl chain lengths for further investigation. 6) It could be demonstrated by fluorescence microscopy, that the Golgi apparatus is fragmented in response to 5b in cultured human fibroblasts. Although it cannot be distinguished at the moment, if this is cause or effect of altered sphingolipid metabolism induced by 5b, this observation points to a protein target of 5a and 5b that is required for vesicular transport through the Golgi apparatus. 7) To investigate the role of the benzene substituent in another conformationally rigid ceramid analogue, the benzazepinone 24, phenylacetylsphingosine was prepared as an open-chain analog and analyzed in cultured murine granule cells and human fibroblasts. Since the ganglioside patterns in the presence of both compounds are similar, glycosyltransferase inhibition by this substance is not caused by conformational restriction, but by the presence of the benzene moiety. Analysis of the substances in fibroblasts indicated a higher toxicity of the open chain compound, which is in agreement with the current view on cytotoxicity of cell-permeable ceramide analogs. 8.) In chapter 4.9, a direct influence of 5b and 24 on protein kinase C as another potential mediator of the indirect effect on glycosphingolipid metabolism has been ruled out experimentally. Although the molecular target of 5a,b could not been identified, novel tools to address this question have been prepared in this work, several possibilities have been ruled out, and the integrity of the Golgi apparatus has been shown to be affected by these substances.</p
Entwicklung eines kombinierten Lipidtransfer- und Membranfusions-Assays zur Untersuchung membranaktiver Proteine : Untersuchung der Funktionsweise des GM2-Aktivatorproteins und der Auswirkung des, zur Aufreinigung rekombinant exprimierter Proteine verwendeten, Hexahistidin-Restes auf die Aktivatorfunktion
No full textGlykosphingolipide, die aus der Plasmamembran stammen, erreichen nach ihrer Endozytose intraendosomale und intralysosomale Vesikel, auf deren Oberfläche sie von lysosomalen Exohydrolasen abgebaut werden (Übersichtsartikel: Sandhoff und Kolter, 1996). Die intralysosomalen Vesikel unterscheiden sich von der begrenzenden Membran durch das Fehlen einer schützenden Glykokalix und besitzen annähernd kein Cholesterol, dafür aber das lysosomale Markerlipid Bis(monoacylglycero)phosphat. Zum effektiven Abbau von Lipiden mit nur wenigen Zuckerresten werden zudem wasserlösliche Hilfsproteine, die Sphingolipid-Aktivatorproteine benötigt, welche an der Phasengrenze die Interaktion zwischen membranständigem Substrat und wasserlöslichem Enzym vermitteln. Zu diesen Hilfsproteinen zählen die vier Saposine A-D, kleine, enzymatisch inaktive Glykoproteine, die trotz ihrer hohen Sequenzhomologie unterschiedliche Spezifitäten und Mechanismen aufweisen, und das GM2- Aktivatorprotein. Das GM2-Aktivatorprotein vermittelt beim Abbau des Gangliosides GM2 die Reaktion mit der β-Hexosaminidase A (3.2.1.52, HexA). Die physiologische Relevanz dieses Proteins wird durch das Auftreten von genetisch bedingten GM2-Aktivatorprotein- Defizienzen (AB-Variante der GM2-Gangliosidosen) belegt, welche zur massiven lysosomalen Speicherung von GM2 und zum frühen Tod führen. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Funktion des GM2-Aktivatorproteins beim lysosomalen Abbau zu untersuchen. Von besonderem Interesse war die Frage, inwieweit verschiedene Membranlipide die Interaktion des GM2-Aktivatorproteins mit membrangebundenem GM2 in einem detergenzfreien, liposomalen System beeinflussen und ob der zur Reinigung rekombinant exprimierter Proteine verwendete Hexahistidin-Rest die Funktion membranaktiver Proteine beeinflussen kann. Ein bereits vorliegendes Präparat aus menschlichem Nierengewebe wurde bezüglich Homogenität und Aktivität untersucht. Zudem wurde ein rekombinantes GM2- Aktivatorprotein mit Hexahistidinrest mittels des Baculovirus-Expressionsvektor-Systems in Insektenzellen exprimiert, dem Präparat aus Gewebe entsprechend charakterisiert und mit diesem verglichen. Die Wechselwirkung beider GM2-Aktivator-Präperate mit Lipiddoppelschichten wurde mit Hilfe der Oberflächenplasmonresonanz (surface plasmon resonance, SPR) untersucht. Hierbei wies das GM2-Aktivatorprotein aus Gewebe eine stark membrandestabilisierende Wirkung auf. Noch während der Überleitung des Proteins kam es zur Ablösung von Lipidmaterial von Chip. Das rekombinante Präparat mit Hexahistidin-Rest zeigte deutlich andere Eigenschaften. Hier konnte nur Anbindung an die Liposomen, aber keine membranauflösende Aktivität nachgewiesen werden. Um das Verhalten der beiden Proteinpräparate gegenüber Membranen genauer untersuchen zu können, wurde ein neues Verfahren entwickelt, welches den Förster- Resonanz-Energie-Transfer-Assay (Schwarzmann et al., 2005) und den Fusions-Assay mittels magnetischer Separation (Abdul-Hammed et al., 2010) in einem Assay kombinierte. Der entwickelte Assay besteht somit aus zwei Teilen, wodurch es ermöglicht wird zwischen Lipidtransfer und Membranfusion zu unterscheiden, sowie Einblick in die Kinetik der Reaktion zu gewinnen. Anhand dieses kombinierten Lipidtransfer- und Membranfusions-Assays sollten die Eigenschaften des GM2-Aktivatorproteins aus menschlichem Nierengewebe und des rekombinant gewonnenen Präparates mit Hexahistidin-Rest untersucht werden. Das aus Gewebe gewonnene GM2-Aktivatorprotein vermittelte sowohl Vesikelfusion als auch Transfer von 2-NDB-GM1 zwischen Donor- und Akzeptorvesikeln. Beide Eigenschaften waren abhängig von pH, Ionenstärke und der Lipidzusammensetzung der Modelmembranen. Anionische Lipide, wie das lysosomale BMP, steigerten den Transfer von 2-NBD-GM1 deutlich. Dieses bestätigte vorhergegangene Messungen, welche zeigten, dass für den membrangebundenen Abbau von GM2 beide Komponenten, das GM2-Aktivatorprotein und anionische, lysosomale Phospholipide, benötigt wurden (Werth et al., 2001). Cholesterol, Sphingomyelin und hoher pH-Wert senkten den Lipidtransfer. Wir konnten zeigen, dass das rekombinant erzeugte GM2-Aktivatorprotein mit Hexahistidin-Rest grundsätzlich stärkere Vesikelfusion vermittelt. Absenkung der Ionenstärke sowie Variation des Cholesterol- oder des BMP-Gehaltes hatten nur sehr geringen Einfluss auf diese fusogenen Eigenschaften. Der Grund dafür schien in der zusätzlichen elektrostatischen Interaktion der bei pH 4,2 negativ geladenen Vesikeloberfläche und dem sechsfach positiv geladenen Hexahistidin-Rest zu liegen. Die einzig signifikante Veränderung bezüglich der Vesikelfusion wurde bei rGM2AP-His6 durch pH-Variation erreicht: Erhöhung des pHs führt zu verringerter Vesikelfusion. Dieses sprach stark dafür, dass die Interaktion der Histidin-Reste mit der Vesikeloberfläche die Vesikelfusion verstärkt, da die positive Ladung des Hexahistidin- Restes bei pH-Erhöhung abnahm. Die vorliegende Arbeit stellt somit ein neues System vor, welches es in einem Assay ermöglicht die Wechselwirkung von Proteinen mit Lipidvesikeln hinsichtlich ihrer Lipidtransfer- und Vesikelfusionseigenschaften zu untersuchen und zeigt, dass der Hexahistidin-Rest bei der Untersuchung von Lysosomalen Lipid Bindungs Proteinen und anderen membranaktiven Proteinen berücksichtigt werden muss
Der Stoffwechsel der Sphingolipide : Einfluss von Substratanaloga der Dihydroceramid-Desaturase auf den Sphingolipidstoffwechsel humaner Keratinozyten und Untersuchungen zum Lipidstoffwechsel bei Spinocerebellärer Ataxie Typ 2
No full textDie Dihydroceramid-4-Desaturase ist ein membrangebundenes Enzym höherer Eukaryonten, das auf der zytosolischen Seite des Endoplasmatischen Retikulums lokalisiert ist. Sie katalysiert mit der Einführung der 4,5-(E)-Doppelbindung in das Sphingoid-Rückgrat den letzten Schritt der Ceramid-Biosynthese. Im ersten Teil der Arbeit wurde der Einfluss zweier Substratanaloga der Dihydroceramid-4-Desaturase auf den Sphingolipidstoffwechsel humaner Keratinozyten untersucht. Bei den beiden Verbindungen handelte es sich um modifizierte Dihydroceramide mit einem Cyclopropyl-Rest (Cp-DHC) bzw. einer Dreifachbindung (Db-DHC) zwischen den Positionen 5 und 6 der Sphingoidbase. Nach enzymatischer Bildung eines Radikals in Position 4 und Umlagerung der reaktiven Zwischenstufe ist die Ausbildung einer kovalenten Bindung zwischen Cp-DHC bzw. Db-DHC und der Dihydroceramid-4-Desaturase und damit eine Hemmung des Enzyms denkbar. Zunächst wurden metabolische Markierungsstudien mit L-[3-14C]-Serin, dem radioaktiv markierten Ausgangsmolekül der Ceramid-Biosynthese, und radiomarkierten zellgängigen Analoga von Dihydroceramid und Ceramid unter Zusatz verschiedener Konzentrationen Cp-DHC und Db-DHC an differenzierten Keratinozyten durchgeführt. Dabei konnte eine von der Konzentration der beiden Verbindungen abhängige Zunahme des Dihydroceramid- und eine Abnahme des Ceramidanteils nachgewiesen werden. Dieser Befund spricht für eine Inhibierung der Dihydroceramid-4-Desaturase. Bei der [3-14C]-Serin-Markierung differenzierter Keratinozyten zeigte sich in Gegenwart von Cp-DHC bzw. Db-DHC zudem eine Erhöhung der Menge biosynthetisierten Phytoceramids. Außerdem wurden als Stoffwechselprodukte von Cp-DHC und Db-DHC Sphingomyelin-Analoga und mit verschiedenen endogenen Fettsäure acylierte N-Acyl-Metabolite massenspektrometrisch identifiziert. Im Gegensatz zu Ceramid ruft Dihydroceramid in der Regel keine antimitogenen Effekte hervor. Daher wurde untersucht, welche Konsequenzen die durch Cp-DHC hervorgerufene Abnahme des Ceramid- zugunsten des Dihydroceramidanteils auf den Übergang von Proliferation zu Differenzierung in humanen Keratinozyten hat. Dazu wurde die Expression von Genen einiger Proteine, die am Ceramidstoffwechsel und an der Differenzierung von Keratinozyten beteiligt sind, mittels real-time Polymerase-Kettenreaktion untersucht. Dabei zeigte sich, dass während der durch 1.1 mM Ca2+ und 10 µM Linolsäure induzierten Differenzierung der Keratinozyten in Gegenwart von Cp-DHC die Expressionsraten von Differenzierungsmarkerproteinen herunter- und die eines Proliferationsmarkers hochreguliert wurde. Außerdem führte der Zusatz von Cp-DHC zu einer Hochregulierung der Expressionsrate aller untersuchten Ceramid-metabolisierenden Enzyme, wodurch der Zellstoffwechsel in Richtung einer vermehrten Bildung von Sphingosin dirigiert wurde, das nach Phosphorylierung mitogene Effekte vermittelt. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass der Mangel an 4,5-ungesättigten Sphingolipiden zu einer Störung der Differenzierung führt, die zur Folge hat, dass die Keratinozyten in einem proliferierenden Zustand verbleiben. Im zweiten Teil der Arbeit wurden Untersuchungen zur Spinocerebellärer Ataxie Typ 2 (SCA2) durchgeführt. SCA2 gehört zur Gruppe der neurodegenerativen Polyglutaminkrankheiten. Das bei SCA2 betroffene Protein Ataxin-2 wird ubiquitär exprimiert. Seine Funktion und der zur Erkrankung führende Pathomechanismus sind unbekannt. Da sich in jüngerer Zeit die Hinweise mehren, dass Polyglutaminkrankheiten mit Störungen des Lipidstoffwechsels verbunden sind, wurde die Lipidzusammensetzung in Hirngewebe einer SCA2-Patientin analysiert. Dazu wurden Proben aus dem Cortex, der bei SCA2 weitgehend erhalten bleibt, und aus dem Kleinhirn, das von der Krankheit hauptsächlich betroffen ist, untersucht. Dabei ergab sich als wichtigstes Ergebnis ein starker Mangel an Lipiden, die typischerweise im Myelin vorkommen, im Kleinhirn der Patientin. Nur unwesentlich verändert war dagegen der Gehalt an Gangliosiden, die nur in geringen Konzentrationen im Myelin, sondern hauptsächlich in der neuronalen Plasmamembran und damit in der grauen Hirnsubstanz zu finden sind. Die Ergebnisse sind Zeichen einer Demyelinisierung im Kleinhirn der Patientin. Während SCA2-Patienten u. a. an einer starken Reduktion des Unterhautfettgewebes leiden, zeigen drei Monate alte SCA2-knock out-Mäuse Fettleibigkeit und Insulinresistenz. Dies weist darauf hin, dass Ataxin-2 eine regulierende Funktion in den durch Insulin vermittelten Signalwegen haben könnte. Zur Klärung der Frage, ob die für SCA2 verantwortliche Expansion des Polyglutaminstrangs in Ataxin-2 zu einem Funktionsverlust des Proteins führt, wurden die Lipidzusammensetzung in Cortex und Kleinhirn der knock out-Mäuse analysiert. Dabei zeigte sich im Kleinhirn der knock out-Mäuse kein Mangel Myelin-typischer Lipide, sondern im wesentlichen ein deutlich erhöhter Gangliosidgehalt. Der Verlust von Ataxin-2 in Mäusen führt also nicht zu den gleichen Lipidveränderungen im Gehirn wie die Existenz von variantem Ataxin-2 mit expandierter Polyglutaminkette in SCA2-Patienten. Da jedoch erhöhte Konzentrationen von Ceramid oder höheren Sphingolipiden in verschiedenen Geweben häufig mit der Vermittlung von Insulinresistenz in Zusammenhang stehen, bekräftigen die im Kleinhirn der SCA2-knock out-Mäuse gefunden erhöhten Gangliosidmengen das Bild von Ataxin-2 als einen Regulator der durch Insulin vermittelten Signalwege
Neural precursor cell cultures from GM2-gangliosidosis animal models recapitulate the biochemical and molecular hallmarks of the brain pathology
No full textIn this work we showed that genotype-related patterns of hexosaminidase activity, isoenzyme composition, gene expression and ganglioside metabolism observed during embryonic and postnatal brain development are recapitulated during the progressive stages of neural precursor cell (NPC) differentiation to mature glia and neurons in vitro. Further, by comparing NPCs and their differentiated progeny established from Tay-Sachs (TS) and Sandhoff (SD) animal models with the wild-type counterparts, we studied the events linking the accumulation of undegraded substrates to hexosaminidase activity. We showed that similarly to what observed in brain tissues in TS NPCs and progeny, the stored GM2 was partially converted by sialidase to GA2, which can be then degraded in the lysosomes to its components. The latter can be used in a salvage pathway for the formation of GM3. Interestingly, results obtained from ganglioside feeding assays and from measurement of lysosomal sialidase activity suggest that a similar pathway might work also in the SD model
Role of membrane lipids in regulation of Alzheimer’s disease associated proteins and vice-a-versa
No full textAlzheimer’s disease (AD) is associated with extracellular deposits of the amyloid β- peptide (Aβ) and intraneuronal aggregates of hyperphosphorylated tau protein in the brain. Aβ is generated by sequential proteolytic processing of the β-amyloid precursor protein (APP) by β- and γ-secretases. γ-secretase is a multimeric protein complex with presenilins as catalytic subunits, which cleave APP C-terminal fragments (APP-CTFs) generated by β-secretase cleavage of APP. Several studies have indicated dysregulation of protein transport and lipid metabolism as an important aspect of AD. The cleavage of APP by secretases which occurs predominantly in post-Golgi secretory and endocytic compartments is influenced by cholesterol, indicating a role of the membrane lipid composition in the processing of APP. Moreover, γ-secretase activity has been shown to be dependent on membrane lipids. In the present study, on one hand the effects of perturbations in membrane lipid composition on APP processing were analyzed in detail. On the other hand, the role of presenilins in maintenance of membrane lipid homeostasis was investigated as well. By various approaches, it was established that APP transport, stability, maturation and processing is affected by glycosphingolipids (GSLs). Importantly, the inhibition of GSL biosynthesis decreased secretion of Aβ, whereas addition of exogenous GSLs lead to higher Aβ levels as well as strong accumulation of APP-CTFs. Thus, the presented studies identified GSL metabolism as a novel target to regulate the levels of Aβ. Moreover, there is a growing perception that the increased levels of APP-CTFs contribute to AD pathology by exerting toxic effects. Elevated levels of APP-CTFs were also detected in various sphingolipid storage disorders (SLSDs). Interestingly, tau pathology and inflammation caused by microgliosis is observed both in AD as well as some sphingolipid storage disorders (SLSDs). Therefore, an accumulation of APPCTFs associated with altered sphingolipid metabolism might be an important common aspect of these disorders, which contributes to the observed neurodegeneration. In the course of these studies, a novel way by which presenilins regulate the cholesterol and sphingolipid metabolism was also revealed. Inhibition of γ-secretase activity results in inefficient endocytosis of LDL, which led to increased cellular de novo cholesterol biosynthesis via transcriptional up-regulation of CYP51. Evidence is provided for the global role of presenilins in regulation of endocytosis and degradation of membrane lipids and a broad range of proteins. The lack of γ-secretase activity causes an accumulation of membrane sphingolipids as well as membrane proteins. Thus, results validate the previously proposed hypothesis that presenilin are necessary for membrane protein clearance. Moreover, familial Alzheimer’s disease (FAD) associated mutations in presenilin disturbed the membrane lipid-protein homeostasis in a similar fashion by blocking endocytosis, indicating loss of function. The inhibition of γ-secretase activity is a rational strategy to decrease Aβ generation in AD therapy. However, since γ-secretase is involved in the cleavage of different substrates, a general inhibition of this enzyme could affect different biological processes. The finding that the inhibition of γ-secretase activity also impaired membrane lipid-protein homeostasis underscores the necessity of targeting γ-secretase cleavage of APP, without affecting other cellular pathways
Humane saure Ceramidase : Baculovirus-Expression, Prozessierung, Reinigung, Charakterisierung und Strukturanalyse mittels MALDI-TOF und ESI-Massenspektrometrie
No full textDie humane saure Ceramidase katalysiert den letzten Schritt des lysosomalen Sphingolipid-Abbaus, die Hydrolyse von Ceramid zu Sphingosin und Fettsäure. Mutationen im Gen der sauren Ceramidase führen zur Farberschen Krankheit. Die saure Ceramidase ist ein heterodimeres Glykoprotein, das nach Abspaltung einer Signalsequenz aus einem monomeren Vorläufer-Protein durch Spaltung zwischen Isoleucin121 und Cystein122 hervorgeht. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine Methode entwickelt, ausschliesslich prozessiertes, aktives Enzym im Milligramm-Maßstab herzustellen. Infektion von Sf-9 Zellen mit rekombinantem Baculovirus, der die cDNA des Vorläufers der humanen sauren Ceramidase enthält, führte zu einem Gemisch von Vorläufer und prozessierter saurer Ceramidase im Expressionsüberstand. Der Vorläufer wurde durch Ansäuern des Expressionsüberstands prozessiert und die reife saure Ceramidase in einem 3-Schritt-Verfahren bis annähernd zur Homogenität gereinigt. Durch massenspektrometrische Analyse der tryptischen Glykopeptide konnte die N-Glykosylierung an 4 der 6 potentiellen N-Glykosylierungsstellen identifiziert werden. An N152 wurde eine fucosylierte Core-Struktur GlcNAc2(Fuc)Man3 identifiziert. N174 und N238 liegen wahrscheinlich auch glykosyliert vor, da Hinweise auf die entsprechenden deglykosylierten Peptide gefunden wurden. Die glykosylierte Spezies wurden nicht identifiziert. N265 wurde im MALDI-Massenspektum sowohl unglykosyliert, als auch mit GlcNAc2Man3 nachgewiesen. An N321 liegt eine heterogene Glykosylierung aus GlcNAc2(Fuc)Man3 und GlcNAc2Man3 vor. N327 ist nicht glykosyliert. Die Disulfidverknüpfung der insgesamt 6 Cystein-Reste der sauren Ceramidase konnte in der vorliegenden Arbeit aufgeklärt werden. Durch proteolytische Spaltung und massenspektrometrische Analyse der durch reversed phase-HPLC getrennten Peptide wurden Disulfidbrücken zwischen C10 und C319, zwischen C122 und C271 und zwischen C367 und C371 nachgewiesen. Die Verknüpfung von C122 wiederspricht der Vermutung, dass es sich bei C122 um ein freies Cystein im katalytisch aktiven Zentrum des Enzyms handelt. Ob C122 in der gesamten Proteinpräparation als Teil einer Disulfid-Brücke vorliegt, oder ob ein kleiner Teil der Proteinpräparation über ein freies C122 verfügt, konnte mit den angewendeten Methoden nicht festgestellt werden. Tritium-markiertes 2N-(p-(3-(Trifluormethyl)diazirinyl)phenyl)propanoyl-sphinganin wurde auf seine Eignung, als Photoaffinitätsligand kovalent an Aminosäurereste im aktiven Zentrum der sauren Ceramidase zu binden, untersucht. Das Sphinganin-Derivat wurde jedoch von der sauren Ceramidase nicht als Substrat erkannt, was ein Vorraussetztung für die Markierung des aktiven Zentrums ist. Es konnte lediglich das Wasserinsertionsprodukt des Photoaffinitätsliganden nachgewiesen werden. N-Bromacetylsphingosin wurde bereits als kovalenter Inhibitor der sauren Ceramidase beschrieben. Allerdings erfolgt die Reaktion mit dem Enzym unspezifisch. Es konnte daher keine Proteinregion isoliert werden, die bevorzugt mit dem Liganden reagiert
Overexpression of human acid ceramidase precursor and variants of the catalytic center in Sf9 cells : Analysis of ceramidase maturation, autocatalytic processing and interaction with Sap-D
No full textCeramides are important building blocks of eukaryotic membranes and primarily serve as membrane anchors of GSLs and sphingomyelins. The lysosomal degradation of ceramide is catalyzed by acid ceramidase and requires the interaction with Sap-D in vivo. Acid ceramidase is synthesized as a monomeric precursor followed by proteolytic processing into mature enzyme which is a heterodimer consisting of α- and β- subunits. The main goal of this study was to establish the recombinant expression in insect cells and purification of only the human acid ceramidase precursor for further crystallization studies. In order to generate the recombinant baculovirus expressing only the human acid ceramidase precursor, a fusion protein was constructed with SEAP. However, this strategy failed and proteolytic processing of acid ceramidase still occurred. Subsequently, the amino acids near the cleavage site were substituted by point mutation to avoid proteolytic processing. It only worked with the mutant of the nucleophilic Cys143, which did not show any proteolytic cleavage, whereas all other variants were still cleaved. Therefore, proteolytic processing of acid ceramidase seems to occur autocatalytically by self-cleavage into α- and β- subunits, similar to other members of the N-terminal nucleophile (Ntn) hydrolase superfamily. We established the overexpression and purification of the variant Cys143Ala fusion protein to produce a large amount of acid ceramidase precursor for further crystallization experiments. Treatment of wild-type fusion protein “SEAP-haCerase” with the cysteine protease inhibitor, p-chloromercuribenzoic acid (pCMB), inhibited both self-cleavage and enzymatic activity. More importantly, Cys143 residue was also confirmed to be in a free state. Therefore, we suggest that acid ceramidase also belong to the superfamily of Ntn-hydrolases
From cell penetrating peptides to peptoids and polyamines as novel artificial molecular transporters : Entwicklung neuer Delivery-Strategien für siRNAs ; Von zellpenetrierenden Peptiden zu Peptoiden und Polyaminen als neuartige molekulare Transporter
No full textIn recent years, RNA interference has gained a lot of importance as a tool for posttranscriptional silencing of genes due to its high specificity, efficiency and ease of application. In mammalian cells RNAi is triggered by the application of 21 bp short dsRNAs, so-called short interfering RNAs (siRNAs). Numerous studies indicate the great potential of RNAi in the therapy of viral infections and inherited diseases. Cell-penetrating peptides can be used to apply siRNAs to primary cells, non-dividing cells or fully grown organisms, that are diffcult to transfect. These short positively charged peptides are internalized by cells. They can be detected in the endosomes, lysosomes but also in the cytosol. If attached to CPPs, large cargo molecules can be taken up with a high efficiency that surpasses that of most conventional transfection methods. In the work presented here, peptide-coupled siRNAs (pepsiRNAs) have been developed as a novel tool for transient RNAi in mammalian cells. The peptides were attached to the siRNA by a disulfide bond, that is cleaved under the reducing conditions of the cytosol and thus releases the siRNA cargo. PepsiRNAs are readily taken up by many cell types that are difficult to address by conventional transfection methods. An siRNA-induced downregulation of the targeted genes was observed at concentrations between 10 and 100 nM. SiRNAs with a 5´-thiol modification upon their sense-strand were generated by in vitro transcription, for which a thiol-modified nucleotide was synthesized via an optimized route. The cell-penetrating peptides Penetratin and Tat were recombinantly expressed as fusion-proteins with glutathione-S-transferase (GST) and purified with a modified procedure to overcome the strong membrane interaction of the GST-tagged CPPs. Recombinant TEV protease was expressed to cleave the CPPs from the fusion tag, and the cleavage activity was assessed by comparison with commercially obtained TEV protease. Thus, alternative routes to the building blocks for pepsiRNAs have been provided to scale up the amount of pepsiRNAs. Finally, small molecules with cell-penetrating properties have been developed as a future replacement of the peptide moiety. Fluorescently labeled peptoids of differing length with amine-functionalized side chains have been shown to enter different mammalian cells lines at concentrations in the lower micromolar range by an endocytosis dependent mechanism. Cationic molecules as small as spermine attached to fluorescein are taken up by an endocytosis-related mechanism. By the same approach porphyrins were delivered into the interior of the cells, where they exhibited a cytotoxic effect upon illumination, so that spermine-coupled porphyrins may be developed into a novel drug for photodynamic therapy.Entwicklung neuer Delivery-Strategien für siRNAs - Von zellpenetrierenden Peptiden zu Peptoiden und Polyaminen als neuartige molekulare Transporter In den vergangenen Jahren, hat die RNA Interferenz (RNAi) aufgrund ihrer Spezifität, Effizienz und einfachen Anwendbarkeit eine große Bedeutung als Technik für das posttranskriptionale Gene-Silencing gewonnen. In Säugerzellen wird RNAi durch die Gabe von 21 bp kurzen doppelsträngigen RNAs, sogenannten short interfering RNAs (siRNAs), ausgelöst. Zahlreiche Studien belegen das große Potential dieser Methode für die Therapie viraler Infektionen und Erbkrankheiten. Um siRNAs auch in schlecht transfizierbare Systeme wie primäre und nicht-teilende Zellen bzw. ausgewachsene Organismen einzubringen, können zellpenetrierende Peptide (CPPs) verwendet werden. Diese kurzen positiv geladenen Peptide werden von Zellen aufgenommen, wo sie in Endosomen, Phagosomen, aber auch im Zytosol detektierbar sind. Verknüpft mit CPPs werden große Moleküle mit hoher Effizienz von Zellen aufgenommen, die die der meisten konventionellen Transfektionsmethoden übertrifft. In dieser Arbeit wurden peptidgekuppelte siRNAs (pepsiRNAs) als neue Methode zur transienten RNAi in Säugerzellen entwickelt. Hierzu wurden die Peptide über eine Disulfidbrücke mit den siRNAs verknüpft, unter den reduzierenden Bedingungen des Zytosols gespalten wird und , so dass die siRNA im Innern der Zelle freigesetzt wird. PepsiRNAs werden von einer Reihe von Zelltypen aufgenommen, die mit konventionellen Techniken nur schlecht behandelbar sind. Eine deutliche Herunterregulation der Ziel-Genprodukte wurde in einem Konzentrationsbereich von 10 -100 nM beobachtet. SiRNAs mit einer 5´-Thiolmodifikation am sense-Strang wurden durch in vitro Transkription gewonnen, für die ein thiolmodifizierten Nucleotid synthetisiert und dessen Synthese optimiert wurde. Die zellpenetrierenden Peptide Penetratin und Tat wurden rekombinant als Fusionproteine mit Gluatathion-S-Transferase (GST) exprimiert und mit modifizierten Verfahren gereinigt, um die starken Wechselwirkungen der GST-CPPs mit den Zellmembranen zu überwinden. Um die CPPs vom GST-Fusionstag zu trennen, wurde rekombinante TEV-Protease exprimiert und die Aktivität mit der von kommerziell erhältlicher TEV-Protease verglichen. Somit stehen nun Alternativen zur Festphasensynthese zur Verfügung, um die Bestandteile der pepsiRNAs in größeren Mengen herzustellen. Schließlich wurden kleine Moleküle mit zellpenetrierenden Eigenschaften als Ersatz für die Peptideinheit entwickelt. Es konnte gezeigt werden, dass fluoreszenzmarkierte Peptoide verschiedener Länge mit aminofunktionalisierten Seitenketten in Konzentrationen von einigen 10 µM von verschiedenen Säugerzelllinien durch einen endozytoseabhängigen Mechanismus aufgenommen werden. Selbst kleine positiv geladene Moleküle wie fluoresceinmarkiertes Spermin werden über einen endozytoseartigen Mechanismus aufgenommen. Auf diese Weise konnten auch Porphyrine ins Innere der Zellen gebracht werden, wo sie bei Belichtung ihre zytotoxische Wirkung entfalten, so dass sie als neuartiger Wirkstoff für die Photodynamische Therapie weiterentwickelt werden können
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