214 research outputs found
A Golgi PKD Activity Reporter Reveals a Crucial Role of PKD in Nocodazole‐Induced Golgi Dispersal
No full textThe protein kinase D (PKD) family comprises multifunctional serine/threonine-specific protein kinases with three mammalian isoforms: PKD1, PKD2 and PKD3. A prominent PKD function is the regulation of basolateral-targeted transport carrier fission from the trans-Golgi network (TGN). To visualize site-specific PKD activation at this organelle, we designed a molecular reporter consisting of a PKD-specific substrate sequence fused to enhanced green fluorescent protein (EGFP), specifically targeted to the TGN via the p230 GRIP domain. Quantitative analyses using a phosphospecific antibody and ratiometric fluorescence imaging revealed that Golgi-specific phosphorylation of the reporter was strictly dependent on stimulation of endogenous PKD or transient expression of active PKD constructs. Conversely, PKD-specific pharmacological inhibitors and siRNA-mediated PKD knockdown suppressed reporter phosphorylation. Using this reporter we investigated a potential role for PKD in the regulation of Golgi complex morphology. Interestingly, nocodazole-induced Golgi complex break-up and dispersal was associated with local PKD activation as measured by reporter phosphorylation and this was efficiently blocked by expression of a dominant-negative PKD mutant or PKD depletion. Our data thus identify a novel link between PKD activity and the microtubule cytoskeleton, whereby Golgi complex integrity is regulated
Inhibition of the PI3K-AKT-mTOR signaling pathway to overcome therapy resistance in malignant melanoma
No full textDas Melanom gehört zu den malignen Tumoren des Menschen, die im Verlauf der Erkrankung mit hoher Wahrscheinlichkeit Gehirnmetastasen ausbilden, die zum Tod des Patienten führen.
In der vorliegenden Arbeit wurde im ersten Teil dargelegt, dass die Inhibition des PI3K-AKT-mTOR-Signalwegs die Sensitivität von Melanomzellen gegenüber Chemotherapie erhöht. Der PI3K Inhibitor LY294002 und der mTOR Inhibitor Rapamycin kombiniert mit Cisplatin oder Temozolomid supprimierten das antiapoptotische Bcl-2 Familienprotein Mcl-1 und induzierten effizient Apoptose in Melanomzellen.
Im zweiten Teil der Arbeit wurde gezeigt, dass der FTI Lonafarnib in Melanomzellen den mTOR-Signalweg inhibiert und die proapoptotischen Effekte von Sorafenib in Melanomzellen verstärkt. Die Apoptoseinduktion durch Lonafarnib und Sorafenib ging mit einer Herunterregulation des Bcl-2 Familienproteins Mcl-1 einher. Darüber hinaus regulierten Lonafarnib und Sorafenib die ER-Stress Gene p8 und CHOP hoch und induzierten ER-Stress vermittelte Apoptose.
Im dritten Teil der Arbeit wurde dargelegt, dass die Hyperaktivierung des AKT-Überlebenssignalwegs in Melanomhirnmetastasen durch Mikromilieu-spezifische Faktoren, die von Astrozyten sezerniert werden, hervorgerufen wird. Die Inhibition des aktivierten PI3K-AKT-Signalwegs hemmte hocheffizient das Wachstum von Hirnmetastasen im Mausmodell.
Die in den drei Teilprojekten erarbeiteten Daten sprechen dafür, dass der PI3K-AKT-mTOR-Signalweg eine entscheidende Rolle bei der Therapieresistenz des Melanoms spielt und dass die effiziente Inhibition dieses Signalwegs eine vielversprechende Strategie zur Überwindung der Therapieresistenz des Melanoms darstellt.Brain metastases occur in over 70% of patients with metastatic melanoma and are the most common cause of cancer death.
In the first part of this thesis it is shown that the inhibition of the PI3K-AKT-mTOR signaling pathway could enhance the sensitivity of melanoma cells towards the tested chemotherapeutics (Cisplatin and Temozolomide). The PI3K inhibitor LY294002 and the mTOR inhibitor Rapamycin combined with Cisplatin or Temozolomide suppressed the expression of the Bcl-2 family protein Mcl-1 and induced apoptosis in melanoma cells efficiently.
In the second part we could show that the FTI Lonafarnib inhibits the mTOR signaling pathway and increased the antiapoptotic effects of Sorafenib in melanoma cells significantly. The apoptosis induction by Lonafarnib and Sorafenib was attended by the downregulation of the Bcl-2 family protein Mcl-1. Furthermore Lonafarnib and Sorafenib upregulated the ER stress genes p8 and CHOP and induced ER stress mediated apoptosis.
In the third part it could be demonstrated that the hyperactivation of the AKT survival pathway in melanoma derived brain metastasis is due to environmental factors which are secreted by astrocytes. Here we could show that the inhibition of the activated PI3K-AKT signaling pathway blocked efficiently the growth of brain metastasis in a mouse tumor model highly efficient.
In conclusion, our data demonstrate that the PI3K-AKT-mTOR signaling pathway plays an crucial role in therapy resistance of malignant melanoma. The results also suggest that the inhibition of this pathway is a promising strategy to overcome the therapy resistance of malignant melanoma
Neue Ansätze zur Prozessverbesserung bei der Herstellung von Biopharmazeutika in CHO Zellen
No full textThe optimization of production processes for therapeutic antibodies is a continuing challenge in pharmaceutical biotechnology. It has been demonstrated that vector design and host cell engineering can improve transcriptional and translational efficiency, resulting in the generation of high producer cell lines. However, the introduction of transgenes into production cell lines that regulate protein transport or affect post-translational modifications have been reported in the literature to lead to inconsistent results regarding the improvement of industrial processes.
The present study shows that heterologous expression of the spliced form of transcription factor X-box-binding protein 1 (XBP-1(s)) leads to an increase in ER content in adherently growing Chinese hamster ovary (CHO) cells. Furthermore, specific therapeutic antibody productivity was elevated by 60% in CHO cells grown in inoculum suspension cultures. This dose-dependent effect translated into significantly increased overall antibody titers in a fed-batch format where cells were grown in chemically defined serum-free media. Protein-A purified antibody products from mock cells and XBP-1 transfected cells were found to be of comparable quality with regard to glycosylation pattern and physicochemical characteristics. The data demonstrated the potential of XBP-1 engineering to improve mammalian cell culture production processes to yield high amounts of a therapeutic protein product of desired quality. However, only low numbers of cells expressing the transgene at high levels were found during the generation of stable cell lines. Additionally, XBP-1(s) expression in monoclonal cell lines was found to decrease over a prolonged period of seed-stock cultivation. These observations were verified by colony formation assays (CFA) where XBP 1(s) expression led to significantly lower colony counts. In an additional experimental setting it was demonstrated that XBP-1(s) expression enhanced apoptosis in CHO cells. Altogether, the data demonstrated a survival disadvantage upon XBP-1(s) overexpression in engineered CHO cells, hampering a possible commercial cell line development program based on XBP-1 engineered cells. To overcome the XBP-1(s) mediated apoptosis, co-expression of the anti-apoptotic protein x-linked inhibitor of apoptosis (XIAP) and XBP-1(s), combining secretion engineering and anti-apoptosis engineering, was evaluated. The proof-of-concept was demonstrated by colony formation assays (CFA), where concomitant XIAP and XBP-1(s) expression was able to restore colony counts. Moreover, when an mAb-producing CHO cell line was engineered, the bicistronic overexpression of both transgenes showed highest specific productivities and final titers in fed-batch cultures of polyclonal cell lines when compared with control cells. The data demonstrated a path toward optimized mammalian production processes. However, despite the proof-of-concept for the two transgenes approach on a pool level it proved challenging to transfer this idea from a model system to the final stages of industrial cell line development.
An additional building block for reproducible high-yielding production processes is sophisticated process monitoring. To be able to identify marker proteins which as a result of their concentration can indicate, for example, transitions between process phases during a production run, an analytical method was developed to investigate changes in the proteome of cell culture supernatant samples. In this approach, the proteome of the supernatant was analyzed by differential two-dimensional gel electrophoresis (2D-DIGE). In order to eliminate interfering effects of the protein product of producer cell lines on the separation method, a mock cell line was generated. This mock cell line was selected to closely simulate production processes with comparable cellular growth characteristics but without product formation. For the concentration of supernatant samples precipitation and ultrafiltration were compared and the filtration method was finally selected. A first analysis of supernatant samples derived from three different process times of a batch culture demonstrated the applicability of the method to separate and finally identify proteins with different abundance in process supernatant samples - a prerequisite for possible process marker proteins. Furthermore, the results of this first study were verified by Western blot analysis for one protein.
The established method based on separation of the proteins from the supernatant by 2D-DIGE and subsequent identification by peptide mass fingerprinting using mass spectrometry can now be used as a starting point for further characterization studies. The identification of such process marker proteins is the first step toward next-generation bioprocess monitoring and control and provides an opportunity for further improved high-yielding production processes.Die Verbesserung von Produktionsprozessen zur biotechnologischen Herstellung therapeutischer Proteine ist und bleibt eine ständige Herausforderung. Durch den Einsatz von optimierten Expressionsvektoren und die gezielte genetische Veränderung von Zellen auf den Ebenen der Transkription und Translation konnten deutliche Prozessverbesserungen erzielt werden. Dennoch waren zu Beginn des Projektes aus der Literatur keine eindeutigen Ergebnisse bekannt die belegen, dass der gezielte genetische Eingriff in die Post-translationale und Transportmaschinerie der Zelle zu einer weiteren Steigerung der Ausbeute führen kann.
In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Überexpression des humanen Transkriptionsfaktors X-box-binding protein 1 (XBP-1) in Ovarienzellen des Chinesischen Hamsters (CHO) zu einer Erweiterung des endoplasmatischen Retikulums führte. Ausserdem konnte die spezifische Produktivität von in Suspension wachsenden monoklonalen Antikörper (mAb) produzierenden CHO-Zellen durch heterologe Expression der gesplicten Form des Transkriptionsfaktors X-box-binding protein 1 (XBP-1(s)) um 60% verbessert werden. Dies führte auch in einem Fed-batch Produktionsprozess zu deutlich gesteigerten Antikörperausbeuten. Eine Analyse der Produktqualität zeigte keinerlei Veränderungen in Bezug auf das Glykosilierungsmuster und die physikochemischen Eigenschaften des produzierten monoklonalen Antikörpers. Damit konnte gezeigt werden, dass eine gezielte genetische Veränderung von Produktionszellen durch Engineering des Endoplasmatischen Retikulums zu verbesserten Prozessausbeuten führen kann. Während dieser Evaluierung wurden jedoch auch negative Einflüsse der XBP-1 Überexpression beobachtet. Diese Beobachtungen wurden anhand eines Koloniebildungstests überprüft. Deutlich geringere Koloniezahlen nach XBP-1 Überexpression bestätigten einen vermuteten Überlebensnachteil der Zellen durch die gezielte genetische Veränderung. Darüber hinaus konnte in einem weiteren Versuchsansatz gezeigt werden, dass die Überexpression von XBP-1 in CHO Zellen zu erhöhter Apoptose führt. Daher wurde versucht, durch die gemeinsame Expression des anti-apoptotisch wirkenden Proteins x-linked inhibitor of apoptosis (XIAP) zusammen mit XBP-1 dessen bereits gezeigte, negative Einflüsse zu kompensieren. Einen ersten Hinweis auf einen möglichen Erfolg dieses Ansatzes wurde erreicht, indem in Koloniebildungstests eine Koexpression beider Proteine zu höheren Koloniezahlen führte und damit der negative Einfluss der XBP-1(s) Expression ausgeglichen werden konnte. Des Weiteren wurde ausgehend von einem antikörperproduziereden Produktionsklon gezeigt, das auf Ebene von polyklonalen Zelllinien die kombinierte Expression beider Proteine zu einem verbesserten Prozess mit gesteigerter Ausbeute führt.
Die Daten zeigen, dass es prinzipiell möglich ist, Prozesse durch die kombinierte Expression von anti-apoptotischen und sekretionssteigernden Proteinen zu verbessern.
Ein weiterer, wichtiger Baustein für einen stabilen Produktionsprozess für Biopharmazeutika ist eine ausgereifte Prozesskontrolle. Ein zusätzliches Ziel dieser Arbeit war es, eine Methode zu etablieren, mit deren Hilfe Proteine im Zellkulturüberstand identifiziert werden können, die als Marker für bestimmte Prozessphasen dienen können. Hierzu sollte das Proteom im Zellkulturüberstand von Prozessen mit Hilfe der differenziellen zweidimensionalen Gelelektrophorese (2D-DIGE) untersucht werden. Um den Einfluß des Protein-Produktes von Produktionszellen auf die Proteintrennung der Methode zu eliminieren, wurde zuerst eine Modellzelle generiert. Diese zeigte die gleichen Wachstumseigenschaften wie Produktionszellen, ohne dabei ein Therapeutikum zu produzieren. Im Folgenden wurden verschiedene Wege getestet, um die Proteinkonzentration im Zellkulturüberstand zu erhöhen und schließlich wurde eine Ultrafiltrationsmethode ausgewählt. Für einen ersten Test des gesamten Analyseverfahrens wurden anschliessend Überstände von verschiedenen Prozesstagen eines Batch-Prozesses mit Hilfe der 2D-DIGE Methode analysiert. Mittels Massenspektroskopie konnten dabei Proteine identifiziert werden, die zu den verschiedenen Messzeitpunkten in unterschiedlichen Konzentrationen vorlagen, was die Voraussetzung für mögliche Prozessmarker darstellt. Anhand eines Proteins wurde das Ergebnis dieser Analyse mittels eines immunologischen Nachweises verifiziert und bestätigt. Damit konnte gezeigt werden, dass die in dieser Arbeit etablierte Methode für die Suche nach Markerproteinen im Überstand von biotechnologischen Prozessen geeignet ist. Sie kann somit als Grundlage für die weitere Charakterisierung des Proteoms im Überstand von Zellkulturprozessen herangezogen werden. Anhand möglicher identifizierter Markerproteine können so neue Verfahren zur Prozesskontrolle entwickelt werden, welche die Grundlage für weiter verbesserte Produktionsprozesse bilden
New retroviral vector systems for gene therapy: development of packaging cell lines growing in suspension
No full textMit den zur Zeit verfügbaren adhärenten Verpackungszellinien ist die Produktion retroviraler Vektoren sehr begrenzt. Das Ziel dieser Arbeit war es, retrovirale Verpackungszellinien zu entwickeln, die in Suspension wachsen und ein 'scale-up' der Vektorproduktion ermöglichen. Es wurde gezeigt, daß Suspensionszellinien fähig sind Retrovirusvektoren transient zu produzieren, doch aufgrund ihrer schlechten Transfizierbarkeit es schwierig ist, eine genügend hohe und stabile Expression der viralen Strukturproteine, sowie des rekombinanten Virusgenoms zu erzielen. Aus diesem Grund wurden adhärente Verpackungszellinien an Suspensionswachstum adaptiert. Dazu wurde eine sichere und hoch effiziente HEK293-Verpackungszellinie hergestellt. Diese sowie die HT1080 abgeleitete FLYA13 wurden unter Verwendung serumfreier Medien an Suspensionswachstum adaptiert. Die in Suspension wachsenden Zellinien waren weiterhin fähig Virusvektoren zu produzieren, wobei die FLYA13- sehr hohe, die HEK293-Suspensionsverpackungszellinie niedrigere Virustiter erzielten. Es wurde gezeigt, daß diese Unterschiede zum Teil auf den verwendeten Medien beruhten. Durch Verwendung optimierter Medien und Kulturbedingungen sollte daher eine Steigerung der Vektorproduktion möglich sein. Neben der Herstellung von Suspensionsverpackungszellinien wurden Studien zum Verhalten von Verpackungszellinien in Langzeitkultur durchgeführt. Es wurde gezeigt, daß eine Verpackungszellinie im Laufe der Kultivierung immer mehr Kopien an Provirusintegraten hinzubekommt. Die Vermehrung der rekombinanten Provirusintegrate könnte durch retrovirale Mechanismen innerhalb der Zelle und/oder auf Reinfektionen der Produzentenzellen mit den von ihr selbst gebildeten rekombinanten Virusvektoren beruhen. Das solche Reinfektionen möglich sind, wurde in mehreren Experimenten demonstriert. Weiterhin wurde eine Abnahme der Virusproduktionsleistung einer retroviralen Verpackungszellkultur im Laufe einer Langzeitkultivierung festgestellt.Using currently available adherent packaging cell lines the production of retroviral vectors is highly limited. We aimed to develop retroviral packaging cell lines growing in suspension, thus having a high scale-up potential. First, we demonstrated that suspension cell lines are able to produce retroviral vectors transiently.
However, the poor efficiency of transfection of suspension cells renders a high and stable expression of the viral proteins and of the recombinant vector genome difficult. To this end, adherent packaging cell lines were adapted to suspension growth. We established a safe and high efficient HEK293 packaging cell line. This as well as the HT1080-based FLYA13 packaging cell line were adapted to suspension growth using serum-free media. The suspension cell lines were still able to produce viral vectors. The titers of the FLYA13-derived packaging cell lines were high, whereas the HEK293-derived were lower. This decrease could be attributed in part to the suspension media used. Therefore, optimized media and culture conditions should further increase the vector production. Beside the development of suspension packaging cell lines long-term studies on packaging cell lines were conducted. We showed an increase of proviral integrates in packaging cell lines over culture time. This could be due to a yet unknown mechanism within these cells or due to reinfection events of the cells with their self-produced vectors.
The existence of such reinfections was shown in several superinfection experiments. Furthermore, we demonstrated that the vector production of retroviral packaging cell lines decrease over culture time
Protein Kinase D kontrolliert die mitotische Golgi-Komplex-Fragmentierung durch einen RAF-MEK1 Signalweg
No full textThe process of Golgi inheritance in mammalian cells involves multiple signaling pathways and proteins to ensure correct partitioning of Golgi membranes among dividing cells. As the Golgi apparatus is a single-copy organelle, the mechanism of separation is rather complex. First Golgi stacks become separated by the action of several key proteins such as BARS, MEK1 or GRASP-65. During cell cycle progression, Golgi stacks further break down into small vesicles that become dispersed throughout the cytoplasm. This fragmentation process is a prerequisite to allow equal distribution of Golgi membranes between daughter cells.
Essential for mitotic entry is the cleavage of Golgi inter stack connections. Since the blocking of this particular event causes an arrest of cells in G2, it defines the Golgi mitotic checkpoint.
In this work PKD was identified as a novel regulator in Golgi mitotic checkpoint control. The PKD family of protein kinases has a well characterized role at the trans-Golgi network regulating fission of cargo-containing vesicles en route to the plasma membrane. However, by now only few publications proposed a role for PKD in cell division.
In this study we provide evidence that siRNA-mediated depletion of PKD 1 and 2 delays the passage of synchronized HeLa cells into M phase. Furthermore, a semi-intact assay approach identified PKD as a regulator of Golgi fragmentation, since PKD inhibition abolished dispersion of Golgi stacks. Detailed microscopic analyses such as mitotic index determinations and Golgi integrity measurements, respectively, demonstrate that PKD acts on the level of Golgi ribbon cleavage during G2.
Finally, evidence is provided that PKD acts through a Raf-1-MEK pathway to exert its function during mitosis; however, Raf-1 appeared to be not a direct PKD substrate.
Taken together, this study demonstrates a novel role of PKD in Golgi mitotic checkpoint control by acting upstream of Raf-1/MEK1. The data further emphasize the importance of PKD in the maintenance of the structural integrity of the Golgi complex.Die Vererbung des Golgi-Komplexes in Säugerzellen erfordert das Zusammenspiel zahlreicher Signalwege und Proteine um sicherzustellen, dass gleich viele Golgi-Membranen zwischen den Tochterzellen verteilt werden. Durch das Einwirken verschiedener Schlüsselproteine, wie BARS, MEK1 oder GRASP-65 werden die Golgi Stapel in einem ersten Schritt voneinander getrennt. Während des folgenden Zellzyklusverlaufs werden die Stapel weiter aufgesplittet und als kleine Bläschen im Zytoplasma verteilt. Dieser Fragmentierungsprozess ist die Voraussetzung für eine gleichmäßige Aufteilung von Golgi-Membranen zwischen den Tochterzellen. Für den Eintritt in die Mitose ist das Abtrennen der Golgi-Stapel-Verbindungen erforderlich, da anderenfalls die Zellen in der G2 Phase arretieren. Dieser Schritt wird deshalb als „mitotischer Golgi Kontrollpunkt“ definiert.
In dieser Arbeit konnte PKD als neuer Regulator dieses Kontrollpunkts bestimmt werden. Am Trans-Golgi-Netzwerk sind die Mitglieder der PKD-Familie für das Abschnüren von Fracht-gefüllten Vesikeln, die für die Plasma Membran bestimmt sind, verantwortlich. Bis jetzt gibt es nur wenige Publikationen die PKD eine Rolle während der Zellteilung zuschreiben.
In dieser Studie wird gezeigt, dass der Verlust von PKD1 und 2 die Durchlaufzeit von HeLa Zellen in der Mitose erheblich verzögert. Experimente mit halb-intakten Zellen ergaben, dass PKD die mitotische Fragmentierung des Golgi-Komplexes reguliert, da eine PKD-Hemmung die Teilung der Golgi Stapel verhinderte. Mit mikroskopischen Analysen, wie beispielsweise die Bestimmung des mitotischen Indexes oder Messungen der Golgi Integrität, konnten wir darüber hinaus zeigen, dass PKD das Abtrennen der Golgi Stapel in der G2 Phase vermittelt. Zudem konnten wir nachweisen, dass PKD in der Mitose durch einen Raf-1-MEK Signalweg agiert. Allerdings scheint Raf-1 kein direktes PKD Substrat zu sein.
Diese Arbeit leistet einen wichtigen Beitrag für die Aufklärung der Regulation des mitotischen Golgi Kontrollpunkts
Generation of colo rectal cancer targeting TRAIL fusion proteins and a mesenchymal stem cell line for in situ expression of these proteins
No full textCharacterisation of recombinant cathepsin B-fluorescent protein chimeras in lung tumour cells. Potentialities of new fluorescence spectroscopic methods.
No full textGenetische Konversion bei simultaner Kotransfektion
GFP-Varianten mit hoher Sequenzidentität werden häufig für Mehrfachmarkierungen eingesetzt. Ihre simultane Kotransfektion kann zu einer Konversion der Fluoreszenzeigenschaften führen und so die Interpretation von Experimenten beeinträchtigen. Unter Standard-Transfektionsbedingungen ergaben ~8%, bei deren Variation bis zu 26% der permanent exprimierenden Zellen veränderte Fusionsproteine. Es wurde gezeigt, daß der Effekt auf der Rekombination homologer Nukleotidsequenzen basiert. Sukzessive Transfektion oder niedrige Sequenzidentität verhinderten die Rekombination. Die genaue und reproduzierbare Quantifizierung der Konversionsraten gestattet allgemeine Untersuchungen von Rekombinations- und Reparatur-Prozessen.
Zwei-Photonen-Anregung
Fluoreszenzspektren für zahlreiche zellbiologisch relevante abiotische Fluorochrome sowie Zellextrakte verschiedener GFP-Varianten wurden mittels der Zwei-Photonen-Anregung generiert. In den meisten Fällen gab es keine wesentlichen Unterschiede zwischen den Zwei-Photonen- und den Ein-Photonen-Emissionsspektren. Die Absorptionsmaxima der breiteren und differenzierteren Zwei-Photonen-Kurven waren jedoch meist um wenige Nanometer bis hin zu weitläufig abweichenden Spektralverläufen blau-verschoben. Die Fluoreszenzintensität der GFP-Varianten war bei beiden Anregungsarten pH-abhängig und hatte ihre maximale Emission im Alkalischen. Trotz einer unvollständigen Regenerierung der Fluoreszenz nach Ansäuerung blieb das Spektralprofil unverändert. Zwei-Photonen-Mikroskopie in Verbindung mit 3D-Rekonstruktion wurde erfolgreich eingesetzt, um subzelluläre Strukturen in vivo hochaufgelöst darzustellen.
In vivo-Charakterisierung von Kathepsin B (CB)
Entstehung und Verteilung von CB wurden unter Verwendung rekombinanter CB-Konstrukte und Fluoreszenzproteine (FP) untersucht. Das CB-FP-Fusionsprotein wurde nur in konstitutiv exprimierenden Zellen prozessiert. Es lokalisierte in retikulären und vesikulären Kompartimenten sowie in Assoziation mit der Plasmamembran. Versuche mit Transportinhibitoren sprechen für eine reguläre Sortierung via M6P-Weg. Fluorometrische Aktivitätsmessungen an Zellextrakten, Zellkulturüberständen und isolierten Zellkernen ergaben eine stark erhöhte CB-Aktivität in Zellklonen. Ein neuartiger Ansatz zur Inhibition der CB-Enzymaktivität wurde mit Hilfe rekombinanter Stefin B (StB)-Inhibitoren unternommen. Die Adressierung von StB ins ER/Golgi durch eine vorgeschaltete Zielsequenz ergab keine stärkere Inhibierung von CB gegenüber den zytoplasmatischen StB-Varianten. Die Überexpression des CB führte zu einer geringen Erhöhung der Enzymaktivitäten von endogenem Kathepsin K und L. Dies kann auf eine mögliche Koregulation mit CB bzw. eine generelle Hochregulierung degradierender Peptidasen aufgrund eines erhöhten Proteinpegels zurückgeführt werden. Die Verwendung FP-markierter rekombinanter CB-Konstrukte eignet sich daher gut als in vivo-Modell zur Charakterisierung von nativem CB.
Nukleäres CB und Zelltod
Alternative CB-Spleißvarianten führen zu einem Translationsprodukt, dem Signalpeptid und Teile des Pro-Peptids fehlen. Dieses nativ trunkierte d51CB kann daher nicht regulär prozessiert und sortiert werden. Statt dessen wird es über eine aktivierte N-terminale Zielsequenz in die Mitochondrien geleitet. Obwohl d51CB vermutlich keine typische CB-Enzymaktivität besitzt, könnte es unabhängig von der Funktion des regulären Enzyms eine Rolle bei Malignität spielen und Zelltod verursachen. Neben d51CB kann auch reifes CB als Folge beschädigter Lysosomen zytoplasmatisch auftreten. Solche "aberranten" CB-Formen wurden mit Hilfe künstlicher CB-FP-Mutanten untersucht. d51CB wurde überwiegend in Mitochondrien und z.T. im Zellkern nachgewiesen. Die künstlich trunkierte CB-Einzelkettenform wurde nicht prozessiert und zeigte keine reguläre CB-Enzymaktivität während transienter Expression in Lungentumorzellen. Sie kam im Zytoplasma, im Zellkern und in der Midbody-Matrix mitotischer Zellen vor. Bleichstudien wiesen mobile und immobile nukleäre Fraktionen nach. Die Anreicherung von künstlich trunkiertem CB im Zellkern führte zu dessen Auflösung und zu Zelltod. Vermutlich werden diese Phänomene nicht über die reguläre CB-Enzymaktivität, sondern über ein noch unbekanntes Aktivitätsprofil ausgelöst. Die Molekülregion, die den Kernimport vermittelt, ist gemäß einer Mutationsanalyse ein zusammengesetztes Signal innerhalb der schweren Kette des CB. Die Ergebnisse legen nahe, daß CB neben dem Signalpeptid und der mitochondrialen Zielsequenz weitere Signale enthält, die für seine differenzierte Adressierung in den Zellkern, in Vesikel oder in andere Organellen verantwortlich sind. Hier wird eine Hierarchie von Zielsignalen im CB-Molekül postuliert, die durch ihre Verfügbarkeit und Stärke bestimmt wird. Diese schließt alternative Transportmechanismen neben dem üblichen M6P-Weg ein.Genetic conversion during simultaneous co-transfection
GFP variants with high sequence identity are frequently used for multicolour labelling. Their simultaneous co-transfection can give false-positive results caused by a conversion of their spectral properties. Under standard transfection conditions, approximately 8%, depending on the conditions, up to 26% of cells expressed altered fusion proteins. It was shown that the effect is based on recombination between homologous nucleotide sequences. Consecutive transfection or low sequence similarities avoided recombination. The detailed and reproducible quantification of the conversion rates allows the investigation of recombination and repair processes in general.
Two-photon excitation
Fluorescence spectra for several abiotic fluorochromes relevant in cell imaging and for different GFP-variants produced in human tumour cells were generated by two-photon excitation. The majority of the investigated fluorochromes did not reveal significant discrepancies between the two-photon and the one-photon emission spectra. However, a blue-shift of the absorption maxima ranging from a few nanometres up to considerably differing courses of the spectrum was found for most fluorochromes. The emission intensity of the GFP variants was dependent on the pH for both types of excitation; its maximum was recorded in the alkaline range. Reconstitution of emission intensity after pH quenching was incomplete, albeit that the respective spectral profiles were identical to those prequenching. Non-linear laser scanning fluorescence microscopy combined with 3D reconstruction was used to visualize subcellular structures at high resolution in vivo.
In vivo characterisation of cathepsin B (CB)
Expression and distribution of CB were investigated using recombinant CB constructs and fluorescent proteins (FP). The CB-FP fusion protein was processed correctly in constitutively expressing cells only. It localised in reticular and vesicular compartments as well as in association with the plasma membrane. Experiments with transport inhibitors suggest a regular sorting via the M6P pathway. Fluorometric activity measurements of cell clones resulted in a highly elevated CB activity within the cell extracts, the supernatants, and the isolated cell nuclei. A novel approach for the inhibition of CB specific activity was performed using recombinant Stefin B (StB) inhibitors. The addressing of the inhibitor into the ER/Golgi by a preceding targeting sequence did not result in a stronger inhibition of CB in comparison to the cytoplasmic StB variants. Overexpression of CB led to a slight elevation of the enzymatic activities of intrinsic cathepsins K and L suggesting a possible co-regulation with CB or a general up-regulation of degrading peptidases due to a higher protein level, respectively. The use of FP-tagged recombinant CB constructs is thus suitable as an in vivo-model for the characterisation of native CB.
Nuclear CB and cell death
Splicing variants of human CB primary transcripts result in an expression product which lacks the signal peptide and parts of the propeptide. This naturally truncated d51CB is thus unable to follow the regular processing and sorting pathway. It is addressed to the mitochondria through an activated N-terminal mitochondrial targeting signal instead. Although d51CB is supposed to be devoid of the typical CB enzymatic activity, it might play a role in malignancies and trigger cell death/apoptosis independent from the function of the regular enzyme. Cytoplasmic presence of the mature CB might occur as a result of lysosomal damage. Such "aberrant" proteins were investigated by artificial CB-GFP chimeras. d51CB was found predominantly in mitochondria but also inside the nucleus. The artificial single chain form was not processed and did not reveal typical enzymatic CB activity during transient expression in lung carcinoma cells. It localized in the cytoplasm, inside the cell nucleus, and in the midbodies of dividing cells. Bleaching experiments revealed both mobile and immobile fractions in the nucleus. Nuclear accumulation of artificially truncated CB led to disintegration of nuclei, followed by cell death. Probably, these phenomena are not necessarily triggered by its regular enzymatic activity but by a yet unknown activity profile. According to a mutational analysis, the part of CB that mediates its nuclear import is a signal patch within its heavy chain domain. The results suggest that besides the N-terminal signal peptide also other CB domains contain patterns which are responsible for a differentiated targeting of the molecule, e.g. to the mitochondria, to the nucleus, or to vesicles. Here, a hierarchy of targeting signals depending on their strength and availability is postulated. This implies other possible transport mechanisms besides the usual trafficking via the M6P pathway
Analysis of p53-NFκB cross talk in UV irradiated human keratinocytes
No full textDurch UVB-Bestrahlung von Keratinozyten wird DNA-Schaden induziert, der durch Aktivierung des Transkriptionsfaktors p53 die Apoptose stark geschädigter Zellen initiieren kann. Der Verlust von wtp53 kann somit zur malignen Transformation beitragen. Mutationen in p53 können zu einem gegenteiligen Effekt führen (gain-of-function) und die Tumorprogression sogar noch verstärken. Auch konstitutiv aktives NFκB wirkt pro-tumorigen und vermittelt z. B. Resistenzen gegenüber Chemotherapie. An welchen Punkten ein cross talk zwischen p53 und NFκB stattfindet, wird stark diskutiert.
Mit Hilfe der spontan transformierten Keratinozytenzelllinie HaCaT konnte gezeigt werden, dass das Zusammenspiel von chronisch aktiviertem NFκB und mutp53 die UVB-induzierte Apoptose durch verstärkte TNF-Produktion nach IL-1-Stimulation erhöhte. Zum ersten Mal konnte über Chromatin Immunopräzipitation-Analysen nachgewiesen werden, dass nach Stimulation beide Transkriptionsfaktoren unabhängig voneinander an den humanen TNF-Promotor banden und dabei additiv zur TNF-Synthese beitrugen. In HaCaT-Zellen ohne intakten NFκB- und p53-Signalweg wurde folglich kein TNF mehr sezerniert und es konnte keine verstärkende apoptotische Wirkung von IL-1 mehr nachgewiesen werden. Wtp53 nahm keinen Einfluss auf die TNF-Sezernierung. Das Wildtypprotein band nicht an diesen Promotor, was zeigt, dass der cross talk von NFκB spezifisch mit mutp53 sattfindet.
UVB-Strahlung führt dabei nicht nur zu einer aktivierenden Phosphorylierung von mutp53, sondern auch zur Inhibierung der katalytischen Untereinheit c der Serin-Threonin-Phoshatase PP2A. Unsere Arbeitsgruppe konnte zeigen, dass dadurch der negative Rückkopplungs-mechanismus von NFκB inhibiert ist, da eine kontinuierliche proteasomale Degradation von IκBα stattfindet. Diese verlängerte NFκB-Aktivierung ist für die TNF-Synthese essentiell. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass PP2A einen direkten Einfluss auf die Phosphorylierungsdauer und somit die Aktivierung von NFκB und CREB, der ebenfalls für die TNF-Transkription notwendig ist, nahm. In HaCaT-Zellen mit inhibierter PP2A waren diese beiden Modifikationen auch in unstimulierten Zellen nachzuweisen und die Transkriptionsfaktoren stellen somit zelluläre Ziele für die Phosphatase dar. Damit nimmt das Enzym einen äußerst wichtigen Stellenwert in der Regulation der TNF-Synthese ein.
4 % der Keratinozyten tragen Mutationen in p53, jedoch entwickeln sich deutlich weniger Zellen zum Hautkrebs. Da die humane Haut als einziges Organ ständiger UVB-Bestrahlung ausgesetzt ist und dies zur IL-1-Produktion führt, kann möglicherweise über den cross talk von NFκB und mutp53 der Organismus vor Hautkrebs geschützt werden. Diese Zellen könnten durch die verstärkte TNF-Sezernierung gezielt die Apoptose induzieren, während Zellen, die wtp53 exprimieren davon nicht betroffen wären. Zwei initial anti-apoptotische Faktoren, NFκB und mutp53, sind somit gemeinsam in der Lage eine pro-apoptotische Antwort zu generieren und zur Elimierung von Präkanzerosen in einem sehr frühen Stadium beizutragen.UVB radiation induces DNA damage in human keratinocytes. Apoptosis can be induced in cells harboring irreparable DNA damaged by activation of the tumor suppressor p53 after UVB exposure. Loss of wtp53 function contributes to malignant transformation. Furthermore, p53 gain-of-function mutants result in the opposite wildtyp effect and can even enhance tumor progression. Constitutive NFκB activation is pro-tumorigenic and leads to resistance against chemotherapy. Still under debate is the point at which cross talk of these two transcription factors occurs.
In the spontaneously transformed keratinocyte cell line HaCaT it was shown for the first time that chronically activated NFκB combined with mutp53 promotes apoptosis via cooperative TNF production in response to UVB+IL-1 treatment. After stimulation both transcription factors bind independently to the TNF promoter, shown by chromatin immunoprecipitation, and trigger additional TNF production. No secreted TNF or enhanced apoptotic response to IL-1 treatment could be detected in HaCaT cells without NFκB and p53 signaling pathways. Wtp53 does not affect TNF secretion. The wildtyp protein does not bind to the promoter, showing that the cross talk of NFκB is specific with mutp53.
UVB does not only induce an activating phosphorylation of mutp53 but also an inhibition of the catalytic subunit c from the serin/threonine phosphatase PP2A. It was shown by our research group that this disrupts the negative feedback regulation of NFκB because IκBα is continuously degraded. The prolonged NFκB activation is essential for TNF synthesis. In the context of this work it could be shown that PP2A also directly influences the phosphorylation time and therefore the activation of NFκB and CREB, a transcription factor which is important for TNF transcription. Even in unstimulated HaCaT cells with inhibited PP2A both modifications were detected, indicating that these proteins are cellular targets of the phosphatase and PP2A is an important factor in the regulation of the TNF synthesis.
4 % of all keratinocytes harbor mutations in p53 but only a few cells develop skin cancer. As the human skin is the only organ which is constantly exposed to UVB radiation causing IL-1 production, the cross talk of NFκB and mutp53 might protect the human being from getting skin cancer. Other than wtp53 expressing cells, cells with mutp53 might induce apoptosis via enhanced TNF secretion. Two anti-apoptotic factors, NFκB and mutp53, are thus able to possibly generate pro-apoptotic responses which may serve as protective function to eliminate precancerous cells at an early stage
Aspekte der Aktivierung der Mitogen-aktivierten-Protein-Kinase (MAPK)-Kaskade durch den Epidermiswachstumsfaktor (EGF): Kinetiken und Crosstalk-Mechanismen mit Tumor-Nekrose-Faktor alpha (TNFalpha)
No full textUsing a mathematical/computational model developed on known components of epidermal growth factor (EGF) signaling pathway (Schoeberl, 2002), several aspects of the EGF signaling pathway could be evaluated and validated when compared to experimental data. The model provided insight into signaling response relationships between the ligand binding to the EGF receptor at the cell surface and the activation of downstream responses, for example, the phosphorylation of ERK-1/2 and expression of the target gene, c-fos. Concentration dependent-inhibition of MEK1 kinase reflected on inhibition of EGF-induced ERK-1/2 phosphorylation and the experimental data correlated well with mathematical model simulation.
TNF was able to induce ERK-1/2 phosphorylation in a manner dependent on MEK-1 activation but, unlike EGF-mediated MAPK activation, it seemed independent of Ras, Raf or MEKK1. Despite ERK activation, induction of Elk-1 transcriptional activity and c-fos expression were not observed following TNF stimulation in contrast to EGF-treated cells. These data indicate, first, the existence of an alternative route to ERK phosphorylation by TNF other than the classical Ras-Raf pathway and, second, the existence of transcriptional response specificity which may depend on the amplitude and duration of ERK activation induced by diverse stimuli.
Besides activating fairly known specific signaling transduction pathways which lead among others to NF-kB and JNK activation, TNF has been shown to be involved in crosstalk with other receptors, a phenomenon much less understood. In the work presented here the features of crosstalk mechanisms between EGF and TNF signaling pathways were investigated. Short time TNF pre-incubation (3 min) prior to EGF stimulation resulted in additive ERK-1/2 phosphorylation whereas 30 minutes pre-incubation induced decrease on EGF-mediated ERK-1/2 phosphorylation as well as on Raf-1 kinase activation of HeLa cells. However, no apparent differences were observed in the levels of EGF-induced EGFR phosphorylation. Moreover, confocal microscopy showed no physical interaction between the two receptors. Although ceramide formation has been regarded as an important mediator of some TNF-dependent responses, it seems not to play any role in the inhibitory effect in the EGF response of HeLa cells observed after 30 min TNF pre-treatment as no increase in cellular ceramide was detected during this time. In addition, inhibitors of the de novo pathway of ceramide formation did not revert TNF-mediated inhibition of EGF-induced Raf kinase activation and ERK-1/2 phosphorylation in HeLa cells. Taken together, these results suggest that TNF negatively regulates EGF-induced ERK-1/2 activation at the level of c-Raf kinase, in a manner independent of ceramide formation.Diverse Aspekte des EGF-Signaltransduktionswegs konnten durch den Vergleich experimenteller Daten, die mit der humanen Karzinomzellinie HeLa gewonnen wurden, mit der Simulation eines mathematischen Computer-Modells, dessen Entwicklung auf bekannten Komponenten des EGF-Signaltransduktionswegs basiert ausgewertet und nachvollzogen werden. Dieses Modell ermöglicht einen Einblick in die Beziehungen innerhalb des Signaltransduktionswegs zwischen der Bindung des Liganden an den membranständigen EGF-Rezeptor und der Aktivierung von im Signalweg stromabwärts gelegenen Komponenten, z.B. der Phosphorylierung von ERK-1/2 und der Expression des Zielgens c-fos. Eine gute Korrelation zwischen den experimentellen biologischen Daten und der Simulation durch das mathematische Modell konnte bei der konzentrationsabhängigen Inhibition von MEK1 durch den Inhibitor (PD 98031) gezeigt werden. Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, daß mathematische Modelle in Kombination mit experimenteller Datenanalyse hilfreiche Instrumente sein können, um neue Einblicke in die komplexen Mechanismen der intrazellulären Signalregulation zu ermöglichen.
TNF ist ein potentes Zytokin, das von mehreren Zelltypen, unter ihnen Makrophagen, Monozyten und Fibroblasten, als Antwort auf Entzündung, Infektion und andere Umweltstimuli produziert wird. TNF ruft ein breites Spektrum an systemischen und zellulären Antworten hervor, wie z.B. Fieber, die Aktivierung und Migration von Lymphocyten und Leukocyten, Zellproliferation, -differenzierung und Apoptose. Als Antwort auf die Behandlung mit TNF werden in den meisten Zelltypen der Transkriptionsfaktor NF-kappaB und JNK aktiviert. Unter gewissen Umständen kann in Folge der Caspase-Kaskade Aktivierung auch Apoptose induziert werden. In dieser Arbeit konnte in HeLa-Zellen gezeigt werden, daß TNF, in einer MEK-1 aktivierungsabhängigen Weise, diPhosphorylierung von ERK-1/2 induzieren kann, diese jedoch anders als bei der EGF abhängigen MAPK Aktivierung, unabhängig von der Aktivität von Ras, Raf oder MEKK1 erscheint. Im Unterschied zu EGF behandelten Zellen, konnte nach einer TNF Stimulierung trotz ERK Aktivierung keine Induktion von Elk-1 Transkriptionsaktivität oder c-fos Expression beobachtet werden. Diese Daten weisen auf die Existenz eines alternativen Weges zum klassischen Ras-Raf Signalweg hin, die zur ERK Phosphorylierung durch TNF führt. Andere Arbeiten haben gezeigt, daß TNF ebenfalls in crosstalk-Mechanismen mit anderen Rezeptoren verwickelt ist, ein bisher noch wenig verstandenes Phänomen. In dieser Arbeit wurde der crosstalk-Mechanismus zwischen den Signalwegen von EGF und TNF untersucht. Eine kurze Vorinkubation (3 Minuten) mit TNF vor der EGF Stimulation führte zu einer additiven ERK-1/2 Phosphorylierung, während eine Vorinkubation mit TNF von 30 Minuten eine Verringerung der EGF-vermittelten ERK-1/2 Phosphorylierung sowie der Raf-1 Kinase Aktivierung ergab. Es konnte jedoch kein ersichtlicher Unterschied in der EGF-induzierten Phosphorylierung des EGF-Rezeptors beobachtet werden. Ebenfalls konnte mittels konfokaler Mikroskopie keine räumliche Nähe zwischen den beiden Rezeptoren gezeigt werden. Zusammengenommen legen diese Ergebnisse nahe, daß TNF die EGF-induzierte MAP-Kinase Aktivierung auf c-Raf Ebene negativ reguliert. Obwohl die Bildung von Ceramid als wichtiger Botenstoff für einige TNF-vermittelte Antworten beschrieben ist, scheint Ceramid bei dem durch die TNF-Vorbehandlung erzielten inhibitorischen Effekt auf MAPKKK keine Rolle zu spielen, da kein Anstieg des zellulären Ceramidspiegels beobachtet wurde. Hinzu kommt, daß Inhibitoren des de novo Ceramid-Syntheseweges die TNF vermittelte Inhibition der EGF-induzierten Raf-Kinase Aktivierung und ERK-1/2 Phosphorylierung nicht aufheben konnten. Trotzdem kann bei diesem Effekt eine mögliche Rolle des endogenen basalen Ceramids nicht ausgeschlossen werden, da theoretisch die Möglichkeit besteht, daß endogenes Ceramid als Antwort auf eine TNF-Behandlung transloziert und auf diese Weise Signale aus spezifischen zellulären Kompartimenten zu andere Positionen innerhalb der Zelle gelangen könnten. Die Tatsache, daß TNF je nach Behandlungslänge einerseits die ERK-1/2 Phosphorylierung induzieren und anderseits die EGF-induzierte Raf-1 Kinase Aktivierung inhibieren kann, zeigt die duale Funktion dieses vielfältigen Moleküls. So kann erwartet werden, dass die zelluläre Antwort sowohl vom Zelltyp, als auch von der durch externe Stimuli beeinflußten Balance zwischen Zellzyklusarrest/Apoptosis und Überlebens-Signale/Zellproliferation abhängt
Die Rolle der Deleted-in-Liver-Cancer-Proteinfamilie bei der Transformation von Brustepithelzellen
No full textThree genes of the human genome encode for a subfamily of Rho GTPase-activating proteins (RhoGAPs) termed "deleted in liver cancer" (DLC) proteins. Rho GTPases participate in a complex set of intracellular signaling pathways including the regulation of cytoskeleton dynamics and cell motility. Since RhoGAPs accelerate the transfer of active GTP-bound Rho proteins to the inactive state, they are able to attenuate signal transduction activities of Rho GTPases. In vitro the DLC proteins show GAP activity towards the Rho proteins RhoA and Cdc42 but not for Rac1. DLC proteins have furthermore been identified as binding partners for tensin proteins and localize to focal adhesions. As the name implicates, loss of DLC protein expression has been first observed in hepatocellular carcinomas. Meanwhile, their down-regulation has also been found in a variety of other human cancers, indicating a possible role for the three DLC family members as tumor suppressors. Studies with overexpressed DLC1-3 suggest that they share common cellular functions. Ectopic expression of DLC1, for example, has been shown to inhibit cell migration, proliferation, anchorage independent growth and even metastasis. However, whether the loss of DLC family members is the cause of aberrant Rho signaling in transformed cells has not been investigated. To elucidate the functions of endogenous DLC proteins we silenced DLC1-3 expression in breast cancer cell lines using a RNA interference (RNAi) approach and compared the cellular alterations. We demonstrate that the loss of each DLC family member leads to a distinct cellular phenotype. For instance, knockdown of DLC1 and DLC3 enhanced cell motility in transwell assays, but had a differential impact on random cell migration and RhoA activity. By contrast, DLC2 down-regulation failed to affect cell locomotion, although it led to an enhanced level of active RhoA. Furthermore, we provide data supporting the involvement of DLC1 in the control of directed cell migration through a Dia1- and not Rho kinase (ROCK)-dependent pathway. In summary, we show that despite their overlapping substrate specificity towards RhoA in vitro, DLC family members have non-redundant cellular functions. We assume that this is most likely due to their multimodular structures, distinct spatial distributions and interaction with different signaling proteins in intact cells.Drei Gene des humanen Genoms kodieren für eine Unterklasse der Rho GTPase aktivierenden Proteine (RhoGAPs), die man als "deleted in liver cancer" (DLC) Proteine bezeichnet. Rho GTPasen sind an einer Reihe komplexer intrazellulärer Signalwege beteiligt, welche auch die Regulation von Zytoskelettveränderungen und die Zellmigration miteinschließen. Da RhoGAPs die Überführung aktiver GTP-gebundener Rho-Proteine in den inaktiven Zustand vermitteln, können sie die Signalgebung der Rho GTPasen vermindern. DLC-Proteine weisen in vitro GAP-Aktivität hinsichtlich der Rho-Proteine RhoA und Cdc42 auf, aber nicht für Rac1. Außerdem sind sie als Bindungspartner für Tensin-Proteine identifiziert worden und in fokalen Adhesionspunkten lokalisiert. Wie der Name impliziert, wurde der DLC-Expressionsverlust zuerst in Leberkarzinomen beobachtet. Mittlerweile wurde ihre reduzierte Expression auch in einer Vielzahl anderer humaner Krebsarten gefunden. Dies deutet auf eine mögliche Rolle der drei DLC-Familienmitglieder als Tumorsuppressoren hin. Studien mit überexprimierten DLC1-3 lassen vermuten, dass sie überlappende zelluläre Funktionen aufweisen. Es wurde gezeigt, dass die Expression von DLC1 die Zellmigration, die Proliferation, das Wachstum unabhängig von Matrixkontakten und selbst die Metastasenbildung unterdrücken kann. Ob allerdings der Verlust der DLC Familenmitglieder eine veränderte Rho-Signalgebung in transformierten Zellen bewirkt,wurde noch nicht untersucht. Um die Funktionen von endogenen DLC-Proteinen zu untersuchen, haben wir die DLC1-3 Expression in Brustkrebszelllinien mit Hilfe von RNA Interferenz ausgeschaltet und die zellulären Veränderungen verglichen. Wir konnten zeigen, dass der Verlust der einzelnen DLC-Familienmitglieder zu unterschiedlichen zellulären Phänotypen führt. So erhöhte sowohl der Verlust von DLC1 als auch von DLC3 die Zellmigration in Transwell Assays, allerdings ließen sich im Falle von ungerichteter Zellmigration und RhoA-Aktivität Unterschiede feststellen. Dem gegenüber steht DLC2, dessen Expressionsverlust nicht die Zellmigration beeinflusste, obwohl eine erhöhte RhoA-Aktivität zu beobachten war. Außerdem beweisen wir durch unsere Daten, dass DLC1 durch einen Dia1-abhängigen und ROCK-unabhängigen Signalweg an der gerichteten Zellmigration beteiligt ist. Zusammenfassend kann man sagen, dass DLC-Familienmitglieder, abgesehen von ihrer überlappenden Substratspezifiät hinsichtlich RhoA in vitro, individuelle zelluläre Funktionen aufweisen. Wir vermuten, dass dies auf ihren mehrmoduligen strukturellen Aufbau, ihre unterschiedliche subzelluläre Lokalisation und die Interaktion mit spezifischen Signalmolekülen zurückzuführen ist
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