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Structural bases of protein kinase CK2 function and inhibition.
No full textCK2, a member of the family of eukaryotic protein kinases (ePK), is ubiquitously present in eukaryotic cells and essential for their viability. With hundreds of sub- strates, the enzyme is implicated in many fundamental cellular processes. in particular, it is essential for cellular homeostasis: downregulation of CK2 leads to apoptosis, and abnormal over-activation has been found coupled to several diseases, in particular to cancer. the mechanism of regulation of CK2 is not firmly established yet; however, it is clear that it differs from those commonly utilized by other protein kinases. almost 15 years of intense crystallographic efforts, with dozens of crystal structures determined, have disclosed the structural bases of many key biochemical and functional properties of this enzyme. in this chapter, we review the progression in the structural biology of CK2 from the early discoveries to the current knowledge, giving our reasoned view of the state-of-art knowledge of the field. the basic structural features of the main CK2 entities—the catalytic subunit CK2α, the regulatory subunit CK2β, and the tetrameric α2β2 CK2 holoenzyme—are analyzed, in the broader context of the eukaryotic protein kinase family. from such an analysis, the picture of an anomalous protein kinase, “challenging the canons” proper of the vast majority of ePKs, clearly emerges. We further examine the issue of CK2 inhibition, a field fostered particularly by the involvement of CK2 in many pathologies and part of the wider topic of protein kinases inhibition, of particular interest for both the academia and pharmaceutical companies. Principles of CK2 inhibition by type I ATP-competitive inhibitors are now well established, and are reviewed and analyzed by means of several examples. the current state in the development of non-ATP-competitive inhibitors, which is very promising but still in an immature state, is also examined. alongside the critical review of the established knowledge, we finally address the still open questions, the perspectives, and the possible forthcoming developments in the field of CK2 structural biology
Die gläserne Zelle
No full textHeinz D, Bott M, Kalinowski J, Niefind K, Takors R, Wendisch VF. Die gläserne Zelle. In: BIOTECHNOLOGIE 2020 - Von der gläsernen Zelle zum maßgeschneiderten Prozess. DECHEMA; 2004: 6-13
The transparent cell
No full textHeinz D, Bott M, Kalinowski J, Niefind K, Rakors R, Wendisch VF. The Transparent Cell. In: BIOTECHNOLOGY 2020 – From the Transparent Cell to the Custom-designed Process. European Commision; 2005: 8-15
DNA-based biomimetics as modular tools to study reconstituted and cellular systems
No full textDie Desoxyribonukleinsäure (DNA) stellt die fundamentale Grundlage praktisch aller lebenden Organismen dar. Das zentrale Dogma der Molekularbiologie bezieht sich auf DNA als Träger der genetischen Information, die zunächst in Ribonukleinsäuren (RNA) transkribiert und anschließend in Proteine translatiert wird. Da Nukleinsäuren ebenfalls als strukturelle und regulatorische Komponenten innerhalb von Zellen wirken, wurde dieses Dogma überdacht. So entstand in den letzten Jahren das neue Forschungsfeld "DNA-Nanotechnologie", welches DNA als molekularen Baustein nutzt. Die vorhersehbare Basenpaarung ermöglicht die Herstellung selbstorganisierter zwei- und dreidimensionaler (2D und 3D) Nanostrukturen, welche zusätzlich mit einer Vielzahl verschiedener Biomoleküle im Nanometer-Maßstab funktionalisiert werden können. Auf Grund dieser einzigartigen Eigenschaft sowie der Vielseitigkeit, geringen Toxizität und biologischen Abbaubarkeit, fanden DNA-Strukturen verschiedene Anwendungen in einer Vielzahl von Bereichen. Darüber hinaus hat sich das Design DNA-basierter, biomimetischer Systeme als ein wertvolles Instrument zur systematischen Erforschung der Komplexität von Zellen erwiesen, welches ebenfalls im Mittelpunkt der hier gezeigten Arbeit steht. Im Rahmen dieser Arbeit wurden kurze funktionelle Peptide kovalent an DNA-Nanostrukturen gebunden. In einem ersten Ansatz wurden DNA-Tetraeder und DNA-Trimere kovalent an zellpenetrierende Peptide (CPP) gekoppelt, welche eine effizientere zelluläre Aufnahme vermittelten. Der zweite Ansatz, welcher den Großteil dieser Dissertation umfasst, konzentrierte sich auf die Generierung und in vitro-Charakterisierung des Einflusses synthetischer Aktin-Crosslinker sowohl auf rekonstituierte Aktinnetzwerke als auch auf Zellen. Die genaue Regulation struktureller und dadurch mechanischer Eigenschaften lebender Zellen ist essentiell für Funktionalitäten wie Motilität, Stabilität und Form. Diese Eigenschaften werden hauptsächlich dem Zytoskelett zugeschrieben, dessen Hauptbestandteile semiflexible Aktinfilamente sowie zahlreiche Aktin-bindende Proteine (ABP) sind, welche die Filamente in eine Vielzahl von Strukturen höherer Ordnung, wie z.B. Netzwerke oder Bündel, organisieren. ABP, die transiente, physikalische Vernetzungen zwischen Filamenten bilden, erlauben aufgrund ihrer empirischen Natur und Komplexität keine direkten systemischen Studien, in denen verschiedene Schlüsselparameter unabhängig voneinander verändert werden können. Um diese Einschränkung zu überwinden, wurden natürlich vorkommende Aktin-Crosslinker, wie a-Actinin und Fascin, durch DNA- und Peptid-basierte, synthetisch hergestellte Crosslinker nachgeahmt. Diese wurden durch die kovalente Bindung Aktin-bindender Peptide an beiden Seiten eines doppelsträngigen DNA-Spacers erzeugt und unterschieden sich daher nur in ihrer Affinität gegenüber filamentösem Aktin. Rheologische Untersuchungen rekonstituierter Aktin-Netzwerke zeigten, dass sowohl der schwach bindende LifeAct®-Crosslinker (wLX) als auch der stark bindende Phalloidin-Crosslinker (sPX) den gleichen charakteristischen mechanischen Fingerabdruck wie die natürlichen Crosslinker a-Actinin bzw. Fascin erzeugen. Darüber hinaus zeigten sie einen konzentrationsabhängigen Einfluss auf Struktur-morphologien von Aktin-Netzwerken sowie eine Hemmung der Aktin-Polymerisation. Interessanterweise interferierten synthetische Crosslinker ebenfalls mit intrazellulären Systemen und es zeigte sich, dass Crosslinker-behandelte Zellen einige veränderte Verhaltensweisen aufwiesen. Sowohl die Aktin-Remodellierungsdynamik als auch die Migration und Invasion waren reduziert, während Proliferations- und Apoptoseraten nicht beeinflusst wurden. Darüber hinaus beeinflussen synthetische Crosslinker möglicherweise den Prozess des epithelial-mesenchymalen Übergangs (EMT), wobei Zellen ihre epithelialen Eigenschaften verlieren und in Zellen mit mesenchymalen Charakteristika, u.a. einer erhöhten Invasivität, transformiert werden. Dieser Prozess umfasst komplexe Signaltransduktionswege, die von der Polymerisations- und Depolymerisationsdynamik von Aktin abhängen. EMT-induzierte Zellen, welche vorab mit wLX behandelt wurden, unterdrückten die Bildung charakteristischer Stressfasern, welche ein typisches Merkmal von EMT darstellen. Dies korrelierte zusätzlich mit Ergebnissen durchgeführter zellmechanischer Untersuchungen. Mit welchem Mechanismus die synthetischen Crosslinker zelluläre Funktionen beeinflussen, bleibt jedoch unklar. Um die zugrundeliegende Ursachen aufzudecken, sind fortführende Untersuchungen erforderlich. Dies umfasst ebenfalls eine potentielle Inhibierung von EMT, in welchem Fall synthetische Crosslinker zukünftig möglicherweise für die Behandlung von Fibrosen, z.B. im Auge, eingesetzt werden könnten.Deoxyribonucleic acid (DNA) is the fundamental basis of virtually all living organisms. The central dogma in molecular biology refers to DNA as the carrier of the genetic information that is first being transcribed into ribonucleic acids (RNA) and further translated into proteins. This dogma has been refined, as nucleic acids were also discovered to act as structural and regulatory components within cells. In recent years, the new research field DNA nanotechnology emerged, in which DNA is used as a molecular building block, whose predictable base pairing allows the fabrication of self-assembled two- and three dimensional (2D and 3D) DNA nanostructures, which moreover can be spatially functionalized with a broad range of biomolecules on the nanometer scale. This unique feature as well as its versatility, biodegradability and low toxicity has led to great interest for various applications in a wide range of areas. Moreover, the design of DNA-based biomimetic systems has emerged as a valuable tool for systematically exploring the complexity of cells, which is also at the center of the work shown here. In the course of this work, short functional peptides were covalently attached to wire-frame DNA nanostructures as well as simple three-arm branched DNA junctions and double-stranded (ds) DNA. In a first approach, DNA tetrahedra and DNA trimers were covalently coupled to cell-penetrating peptides (CPP), which mediated a more efficient cellular uptake. Thus, it can be assumed that CPP retain their function, even when they are covalently attached to DNA, which was one of the main questions within this thesis. The second approach, comprising the main part of this dissertation, focused on the generation and in vitro characterization of the impact of synthetic actin crosslinkers on both reconstituted actin networks and cells. The precise regulation of structural and, thus, mechanical properties of living cells is essential for functionalities such as motility, stability and shape. These properties are mainly attributed to the cytoskeleton, whose main constituents are semiflexible actin filaments as well as numerous actin-binding proteins (ABP), which organize the filaments into a variety of higher order structures, e.g. networks and bundles. ABP that form transient, physical crosslinks between filaments, due to their empirical nature and complexity, do not allow straightforward, systemic studies in which different key parameters can be altered independently. To overcome this limitation, naturally occurring actin crosslinkers such as a-actinin and fascin were mimicked by synthetically fabricated crosslinkers based on DNA and peptides. These were generated through the covalent attachment of actin-binding peptides on both sides of a double-stranded DNA spacer and thus solely differed in their affinity towards filamentous actin. Bulk shear rheology experiments on reconstituted actin networks revealed that both, the weakly-binding LifeAct® crosslinker (wLX) and the strongly-binding Phalloidin crosslinker (sPX) generated the same characteristic mechanical fingerprint as the natural crosslinkers a-actinin and fascin, respectively. Moreover, they showed a concentration-dependent impact on different structural morphologies of actin networks as well as an inhibition of actin polymerization. Interestingly, these synthetic crosslinkers also interfered with intracellular systems, as crosslinker-treated cells showed several altered behaviors. Actin remodeling dynamics, as well as migration and invasion were reduced, whereas proliferation and apoptosis rates were not affected. Additionally, synthetic crosslinkers possibly impact the process of epithelial-mesenchymal transition (EMT), in which cells lose their epithelial properties and become transformed into cells with enhanced motile and invasive functions. This process comprises complex signal transduction pathways, which also depend upon the polymerization and depolymerization status of actin. A typical signature of EMT, the formation of actin criss-cross stress fibers, was suppressed in wLX-treated, EMT-induced cells, which could also be correlated to results of advanced cell mechanical measurements. However, the exact mechanism of how synthetic crosslinkers affect cellular functions still remains unclear. Further investigations are required to reveal the underlying cause, and furthermore whether they suppress EMT, in which case they could become a potential candidate for the treatment of, for instance, ocular fibrosis
50 Jahre Proteinkinase CK2 - ein Beitrag zur Strukturbiologie eukaryontischer Proteinkinasen
No full textDie vorliegende Schrift gibt einen Überblick über die Forschungsgeschichte und über den strukturbiologischen Erkenntnisstand der Proteinkinase CK2 (früher "Caseinkinase 2" genannt). CK2 ist eine Serin/Threonin-Kinase aus der Superfamilie der eukaryontischen Proteinkinasen mit ausgeprägter Vorliebe für saure Substratproteine (Acidophilie). Sie besitzt eine heterotetramere Quartärstruktur und besteht aus zwei katalytischen Untereinheiten (CK2alpha) und zwei nicht-katalytischen Untereinheiten (CK2beta). Dieser (alpha)2(beta)2-Komplex wird auch als "CK2-Holoenzym" bezeichnet. Das Enzym wurde vor 50 Jahren als erste Proteinkinase der Biochemiegeschichte entdeckt. In den darauffolgenden Jahrzehnten hat es eine Fülle verschiedener Benennungen erfahren (Phosvitinkinase, Caseinkinase G, Caseinkinase 2, Glycogensynthase-Kinase 5 u.v.m.), in denen sich aktuelle Entwicklungen der CK2- und der allgemeinen Proteinkinaseforschung widerspiegelten. Diese Namens-und Forschungsgeschichte wird einleitend dargestellt. Der Hauptteil der Schrift ist dann der Strukturbiologie der CK2 gewidmet. Anhand von 3D-Strukturen ist es in den vergangenen Jahren gelungen, die markantesten Eigenschaften des Enzyms auf molekularer Grundlage zu verstehen. In erster Linie ist hier die konstitutive Aktivität der CK2 zu nennen, das ist das für eine Proteinkinase ungewöhnliche Fehlen inaktiver Zustände und von Regulationsprinzipien, wie sie von anderen Proteinkinasen bekannt sind. 3D-Strukturen von CK2alpha legen nahe, dass die konstitutive Aktivität eine ureigene, phylogenetisch optimierte Eigenschaft des Enzyms ist, die für seine physiologische Funktion unerlässlich ist. Für diese Schlussfolgerung spricht insbesondere auch ein Strukturvergleich von CK2alpha mit seinen nächsten Sequenzverwandten aus der sogenannten CMGC-Familie der eukaryontischen Proteinkinasen: den cyclinabhängigen Kinasen, den mitogenaktivierten Kinasen und der Glycogensynthase-Kinase 3. Diese funktionell bedeutenden Proteinkinasen werden streng reguliert. Die dabei erkennbaren molekularen Details sind zwar auch in CK2alpha noch rudimentär angelegt, jedoch sind sie im Sinne konstitutiver Aktivität und Acidophilie modifiziert. Eine weitere ungewöhnliche Eigenschaft der CK2 ist die Fähigkeit, außer ATP auch GTP als Phosphogruppendonor zu verwenden (duale Cosubstratspezifität). Die strukturelle Basis dieses Vermögens konnte durch Strukturaufklärungen binärer Komplexe von CK2alpha mit ATP- und GTP-Analoga geklärt werden. Ausgehend von diesem Ergebnis wurde eine CK2alpha-Mutante geplant und hergestellt, deren Cosubstratspezifität deutlich in Richtung ausschließlicher ATP-Nutzung verschoben war. Die Strukturanalyse dieser Mutante im Komplex mit einem ATP-Analogon zeigte, dass sich die Bindung des Nukleotids in der vorhergesagten Weise verändert hatte. Im Gegensatz zu CK2alpha ist die nicht-katalytische Untereinheit CK2beta ein Protein, von dem fast keine Sequenzverwandten bekannt sind. Diese Einzigartigkeit hat sich auf struktureller Ebene bestätigt: Während die Grundfaltung von CK2alpha mit einer N-terminalen Beta-Faltblatt-Domäne und einer C-terminalen Alpha-helikalen Domäne bei allen eukaryontischen Proteinkinasen zu finden ist, besitzt die CK2beta-Struktur keinerlei Ähnlichkeit zu den heute bekannten Proteinstrukturen. Die Strukturaufklärung von CK2beta als isoliertes Protein und gebunden an CK2alpha hat obendrein eine hochkonservierte Zinkbindungsstelle offenbart, deren Aufgabe darin besteht, eine stabile Dimerisierungsdomäne zu formen. Schließlich konnte durch Kristallstrukturanalyse Klarheit über die lange Zeit strittige Architektur des CK2-Holoenzyms erzielt werden. Es bestätigte sich, dass der Kern dieses Komplexes durch ein CK2beta-Dimer gebildet wird, an das zwei CK2alpha-Ketten angelagert sind, ohne miteinander Kontakt zu haben. Überraschend war dabei vor allem die geringe Größe der CK2alpha/CK2beta-Kontaktfläche, wie sie normalerweise für nicht-permanente Proteinkomplexe typisch ist. Nachdem das CK2-Holoenzym bis Mitte der 90er Jahre als äußerst stabiler und permanenter Komplex galt und CK2alpha und CK2beta nur im Zusammenhang mit diesem Holoenzym bekannt waren, passen diese Befunde zu verschiedenen, seither aufgetauchten Indizien, wonach die Untereinheiten unabhängig vom Holoenzym existieren und eigene Funktionen erfüllen können. Im Schlussteil dieser Schrift wird das Erklärungspotential der CK2-Kristallstrukturen noch einmal zusammengefasst. Es wird der Frage nachgegangen, welche Bedeutung die Strukturen für die spezifisch biologischen Aspekte der CK2-Forschung des Enzyms haben, und gezeigt, dass sie - obgleich ihrem Wesen nach von begrenzter Aussagekraft - dennoch nicht irrelevant sind, weil sie neben ihrer Erklärungskraft auch ein wichtiges Hypothesepotential besitzen
Unusual binding modes of two inhibitors to their target enzymes human leukocyte elastase (HLE) and protein kinase CK2 revealed by protein crystallography
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Primary and secondary interactions between CK2alpha and CK2beta lead to ring-like structures in the crystals of the CK2 holoenzyme
No full textUdgivelsesdato: 2005-JunProtein kinase CK2 predominantly exists as a heterotetrameric holoenyzme consisting of two catalytic subunits (CK2alpha) and two non-catalytic subunits (CK2beta). Early investigations which we review here had revealed the presence of two types of contacts between CK2alpha and CK2beta: a primary interaction responsible for the stability of the CK2 holoenzyme and stimulatory for the catalytic activity, and a secondary interaction which is inhibitory and in which the acidic loop of CK2beta associates with the basic stretch and the (p+1)-loop of CK2alpha. At the end of the last decade both types of interactions were assumed to occur within the same tetrameric complex. The CK2 holoenyzme structure, however, suggested that the secondary interactions must happen between different CK2 tetramers. Such a behaviour should lead to higher-ordered aggregates consistent with several previous reports about a distinct aggregation propensity of CK2. We demonstrate here that in the CK2 holoenzyme crystals contacts between different CK2 tetramers exists which provide structural details of the secondary CK2alpha/CK2beta interactions. These mainly ionic interactions lead to trimeric rings of CK2 holoenzymes in the crystal. In these rings each CK2 tetramer possesses one CK2alpha subunit open for substrate binding and another one whose active site is blocked by a secondary contact with CK2beta from a neighbouring tetramer. This observation fits to previous findings that salt-sensitive ring-like aggregates of CK2 holoenzymes can exist which possess significant catalytic activity. Furthermore it suggests that earlier ideas about a regulatory role of the enzyme's aggregation propensity may be worth to be revitalised
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