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Phénotypes majeurs de l’haptoglobine humaine et stress oxydant induit par l’hémoglobine extra-érythrocytaire sur le globule rouge
No full textLes travaux menés au cours de cette thèse se sont articulés autour de l’étude des phénotypes de l’haptoglobine (Hp) humaine, de leur purification, de leurs interactions avec l’hémoglobine (Hb) et des implications in vitro dans le stress oxydant induit par l’Hb extra-érythrocytaire. Les résultats ont été appliqués à l'autotransfusion utilisant la récupération sanguine péri-opératoire.
Nous avons mis au point un protocole de phénotypage de l’Hp humaine par électrophorèse en gel de polyacrylamide, que nous avons appliqué à l’étude de la répartition des trois phénotypes dans une population de patients hospitalisés. Par la suite, nous avons purifié par FPLC l’Hp à partir de plasmas humains phénotypés (échange d’ions et exclusion-diffusion).
L’interaction de chacun des trois phénotypes purifiés d’Hp avec l’Hb humaine a été étudiée en spectrophotométrie, à travers le pouvoir peroxydasique du complexe Hp-Hb. Les résultats obtenus ont montré que l’affinité de Hp 1-1 pour l’Hb était supérieure à celle de Hp 1-2, qui était elle-même supérieure à celle de Hp 2-2. La constatation du fait que l’interaction de l’Hp avec l’Hb était exothermique nous a conduit à réaliser des études complémentaires en microcalorimétrie. Dans une étude clinique, nous avons démontré que l’affinité de l’Hp pour l’Hb pouvait avoir pour conséquence une sous-estimation de la concentration réelle d’Hp présente dans des spécimens de patients. Cette interférence, non dépendante du phénotype, a été observée lorsque l’Hp était déterminée en immuno-néphélémétrie.
Par la suite, nous avons étudié les effets délétères de l’Hb extra-érythrocytaire sur le globule rouge in vitro sur deux modèles. Le premier a utilisé des préparations de membranes de globules rouges, avec suivi de la peroxydation lipidique par la formation de diènes conjugués et des substances réagissant avec l’acide thiobarbiturique (TBARS). Le deuxième modèle a utilisé des globules rouges intacts, maintenus dans un milieu de conservation (SAGM), avec suivi du potassium et de l’activité lactate déshydrogénase libérés, comme marqueurs d’atteinte de l’intégrité membranaire. L’effet protecteur de chacun des trois phénotypes de l’Hp vis-à-vis du stress oxydant induit par l’Hb extra-érythrocytaire a été étudié sur ces deux modèles. Les résultats ont mis en évidence le rôle anti-oxydant de l’Hp et ont démontré qu’il existait des différences significatives selon le phénotype, l’effet protecteur de Hp 1-1 étant supérieur à celui de Hp 1-2, qui était lui-même supérieur à celui de Hp 2-2.
Enfin, nous avons évalué la qualité des poches de sang destinées à être re-transfusées lors de la récupération sanguine péri-opératoire et les conséquences de l’hémolyse en terme de stress oxydant sur le globule rouge. Nos résultats ont montré que les poches destinées à être re-transfusées contenaient des concentrations élevées d’Hb libre. Un stress oxydant a été mis en évidence au niveau des globules rouges des poches, mais également dans la circulation générale des patients après transfusion. Ce stress oxydant s’accompagnait d’une baisse des concentrations plasmatiques en thiols non protéiques et en Hp, ainsi que d’une altération des propriétés mécaniques des membranes de globules rouges. L’ensemble de ces résultats souligne l’importance de maîtriser l’hémolyse lors de la récupération sanguine péri-opératoire, pour limiter ses effets délétères.This thesis focuses on the study of human haptoglobin phenotypes (Hp), their purification, their interactions with hemoglobin (Hb), and on in vitro implications in oxidative stress induced by free Hb. The results were applied to the autologous transfusion using perioperative blood salvage.
We developed a protocol of human Hp phenotyping using polyacrylamide gel electrophoresis, which was applied to the study of the distribution of the three phenotypes in patients in hospital. Then, we purified the phenotyped human plasmas by FPLC (ion exchange chromatography and gel filtration). The interaction of the three purified Hp phenotypes with human Hb was studied in spectrophotometry, through the peroxidase activity of Hp-Hb complex. The results obtained showed that the affinity of Hp 1-1 for Hb was higher than that of Hp 1-2, which was itself higher than that of Hp 2-2. The interaction of Hp with Hb was proved to be exothermic, which allowed us to conduct complementary studies in microcalorimetry. In a clinical study, we found that the affinity of Hp for Hb could lead to underevaluating the real Hp concentrations in specimens of patients. This interference, which was independent of the phenotype, was observed when Hp was determined by immuno-nephelemetry.
Then, we studied the deleterious effects of extracellular Hb on red blood cells in vitro on two models. The first one used preparations of red blood cells membranes, in which we followed the lipid peroxidation by combined dienes formation and substances reacting with thiobarbituric acid (TBARS). The second model used intact red blood cells, maintained in a conservation medium (SAGM), with follow-up of released potassium and lactate dehydrogenase activity, as markers of attack on membrane integrity. The protective effect of each of the three phenotypes of Hp with respect to oxidative stress induced by extracellular Hb was studied on these two models. The results confirmed the antioxidant role of Hp and showed that there were significant differences according to the phenotype, the protective effect of Hp 1-1 being higher than that of Hp 1-2, which was itself higher than that of Hp 2-2.
Finally, we evaluated the quality of the blood-pack units during perioperative autologous transfusion and the consequences of hemolysis in terms of oxidative stress on red blood cells. Our results indicated that the blood units intended to be transfused contained high concentrations of free Hb. An oxidative stress was found on the red blood cells contained in the blood bags and in the general circulation of patients after transfusion. This oxidative stress was accompanied by a decrease in plasmatic non-protein thiols and Hp concentrations, as well as a deterioration of the mechanical properties of red blood cells membranes. All the results showed the importance of hemolysis control during perioperative blood salvage, in order to limit its deleterious effects
Using Shareholder Notes to Eliminate Section 357(c) Gain: Lessinger v. Commissioner, 872 F.2d 519 (2d Cir. 1989), Correct Result, Wrong Reason
No full textDespite the rather specific statutory framework of Subchapter C of the Internal Revenue Code, which addresses the tax consequences of corporate formation, the courts have repeatedly been called upon to provide a gloss to the statutes to address situations not contemplated by Congress.\u27 In Lessinger v. Commissioner, the Second Circuit encountered a factual situation that compelled the court to again gloss over the plain meaning of the words in the applicable Internal Revenue Code sections to reach the appropriate result. This Article examines the action taken by the Second Circuit in Lessinger and addresses the propriety of the judicial manipulation of statutory language. Further, it examines whether the court arrived at the correct result by using an incorrect approach. Lastly, the author proposes an alternative to the currently accepted interpretation of the statutory language that would make the Second Circuit\u27s approach in Lessinger unnecessary and would not necessitate further legislative action to bring the factual pattern presented by Lessinger within the ambit of the existing statutory objective
Using Shareholder Notes to Eliminate Section 357(c) Gain: Lessinger v. Commissioner, 872 F.2d 519 (2d Cir. 1989), Correct Result, Wrong Reason
No full textDespite the rather specific statutory framework of Subchapter C of the Internal Revenue Code, which addresses the tax consequences of corporate formation, the courts have repeatedly been called upon to provide a gloss to the statutes to address situations not contemplated by Congress.\u27 In Lessinger v. Commissioner, the Second Circuit encountered a factual situation that compelled the court to again gloss over the plain meaning of the words in the applicable Internal Revenue Code sections to reach the appropriate result. This Article examines the action taken by the Second Circuit in Lessinger and addresses the propriety of the judicial manipulation of statutory language. Further, it examines whether the court arrived at the correct result by using an incorrect approach. Lastly, the author proposes an alternative to the currently accepted interpretation of the statutory language that would make the Second Circuit\u27s approach in Lessinger unnecessary and would not necessitate further legislative action to bring the factual pattern presented by Lessinger within the ambit of the existing statutory objective
Major phenotypes of haptoglobin and oxidative stress induced by extracellular hemoglobin on red blood cells
No full textLes travaux menés au cours de cette thèse se sont articulés autour de l'étude des phénotypes de l'haptoglobine (Hp) humaine, de leur purification, de leurs interactions avec l'hémoglobine (Hb) et des implications in vitro dans le stress oxydant induit par l'Hb extra-érythrocytaire. Les résultats ont été appliqués à l'autotransfusion utilisant la récupération sanguine péri-opératoire. Nous avons mis au point un protocole de phénotypage de l'Hp humaine par électrophorèse en gel de polyacrylamide, que nous avons appliqué à l'étude de la répartition des trois phénotypes dans une population de patients hospitalisés. Par la suite, nous avons purifié par FPLC l'Hp à partir de plasmas humains phénotypés (échange d'ions et exclusion-diffusion). L'interaction de chacun des trois phénotypes purifiés d'Hp avec l'Hb humaine a été étudiée en spectrophotométrie, à travers le pouvoir peroxydasique du complexe Hp-Hb. Les résultats obtenus ont montré que l'affinité de Hp 1-1 pour l'Hb était supérieure à celle de Hp 1-2, qui était elle-même supérieure à celle de Hp 2-2. La constatation du fait que l'interaction de l'Hp avec l'Hb était exothermique nous a conduit à réaliser des études complémentaires en microcalorimétrie. Dans une étude clinique, nous avons démontré que l'affinité de l'Hp pour l'Hb pouvait avoir pour conséquence une sous-estimation de la concentration réelle d'Hp présente dans des spécimens de patients. Cette interférence, non dépendante du phénotype, a été observée lorsque l'Hp était déterminée en immuno-néphélémétrie. Par la suite, nous avons étudié les effets délétères de l'Hb extra-érythrocytaire sur le globule rouge in vitro sur deux modèles. Le premier a utilisé des préparations de membranes de globules rouges, avec suivi de la peroxydation lipidique par la formation de diènes conjugués et des substances réagissant avec l'acide thiobarbiturique (TBARS). Le deuxième modèle a utilisé des globules rouges intacts, maintenus dans un milieu de conservation (SAGM), avec suivi du potassium et de l'activité lactate déshydrogénase libérés, comme marqueurs d'atteinte de l'intégrité membranaire. L'effet protecteur de chacun des trois phénotypes de l'Hp vis-à-vis du stress oxydant induit par l'Hb extra-érythrocytaire a été étudié sur ces deux modèles. Les résultats ont mis en évidence le rôle anti-oxydant de l'Hp et ont démontré qu il existait des différences significatives selon le phénotype, l'effet protecteur de Hp 1-1 étant supérieur à celui de Hp 1-2, qui était lui-même supérieur à celui de Hp 2-2. Enfin, nous avons évalué la qualité des poches de sang destinées à être re-transfusées lors de la récupération sanguine péri-opératoire et les conséquences de l'hémolyse en terme de stress oxydant sur le globule rouge. Nos résultats ont montré que les poches destinées à être re-transfusées contenaient des concentrations élevées d'Hb libre. Un stress oxydant a été mis en évidence au niveau des globules rouges des poches, mais également dans la circulation générale des patients après transfusion. Ce stress oxydant s'accompagnait d'une baisse des concentrations plasmatiques en thiols non protéiques et en Hp, ainsi que d'une altération des propriétés mécaniques des membranes de globules rouges. L'ensemble de ces résultats souligne l'importance de maîtriser l'hémolyse lors de la récupération sanguine péri-opératoire, pour limiter ses effets délétères.This thesis focuses on the study of human haptoglobin phenotypes (Hp), their purification, their interactions with hemoglobin (Hb), and on in vitro implications in oxidative stress induced by fre Hb. The results were applied to the autologous transfusion using perioperative blood salvage. We developed a protocol of human Hp phenotyping using polyacrylamide gel electrophoresis, which was applied to the study of the distribution of the three phenotypes in patients in hospital. Then, we purified the phenotyped human plasmas by FPLC (ion exchange chromatography and gel filtration). The interaction of the three purified Hp phenotypes with human Hb was studied in spectrophotometry, through the peroxidase activity of Hp-Hb complex. The results obtained showed that the affinity of Hp 1-1 for Hb was higher than that of Hp 1-2, which was itself higher than that of Hp 2-2. The interaction of Hp with Hb was proved to be exothermic, which allowed us to conduct complementary studies in microcalorimetry. In a clinical study, we found that the affinity of Hp for Hb could lead to underevaluating the real Hp concentrations in specimens of patients. This interference, which was independent of the phenotype, was observed when Hp was determined by immuno-nephelemetry. Then, we studied the deleterious effects of extracellular Hb on red blood cells in vitro on two models. The first one used preparations of red blood cells membranes, in which we followed the lipid peroxidation by combined dienes formation and substances reacting with thiobarbituric acid (TBARS). The second model used intact red blood cells, maintained in a conservation medium (SAGM), with follow-up of released potassium and lactate dehydrogenase activity, as markers of attack on membrane integrity. The protective effect of each of the three phenotypes of Hp with respect to oxidative stress induced by extracellular Hb was studied on these two models. The results confirmed the antioxidant role of Hp and showed that there were significant differences according to the phenotype, the protective effect of Hp 1-1 being higher than that of Hp 1-2, which was itself higher than that of Hp 2-2. Finally, we evaluated the quality of the blood-pack units during perioperative autologous transfusion and the consequences of hemolysis in terms of oxidative stress on red blood cells. Our results indicated that the blood units intended to be transfused contained high concentrations of fre Hb. An oxidative stress was found on the red blood cells contained in the blood bags and in the general circulation of patients after transfusion. This oxidative stress was accompanied by a decrease in plasmatic non-protein thiols and Hp concentrations, as well as a deterioration of the mechanical properties of red blood cells membranes. All the results showed the importance of hemolysis control during perioperative blood salvage, in order to limit its deleterious effects
Cellular distribution of the nucleocapsid protein of HIV-1 NCp7 and characterization of its interaction with the nucleolar protein hNoL 12
No full textLa protéine de nucléocapside (NC) du virus de l’immunodéficience humaine (VIH-1) joue un rôle majeur dans les différentes étapes du cycle viral du VIH-1 : soit comme domaine fonctionnel de la polyprotéine Gag (NC-Gag) dans les phases tardives du cycle viral, soit sous sa forme mature NCp7 dans les phases précoces. Afin de mieux comprendre le rôle de la forme mature dans le cycle viral, nous avons cherché de nouveaux partenaires cellulaires spécifiques de la NCp7 et identifié la protéine nucléolaire, hNoL12, impliquée dans la maturation des ARNs ribosomaux. L’interaction NCp7/hNoL12 a été confirmée par co-IP, FRET-FLIM et double hybride chez la levure et le domaine d’interaction a été localisé entre les a.a. 22 et 61 correspondant au domaine 5’-3’-exonucléase de hNoL12. Nous avons développé un test pour caractériser cette activité et montré qu’elle est spécifique des ARN simples brins. Enfin, l’extinction de l’expression de hNoL12 entraine une diminution significative de l’infection par un lentivecteur modèle des phases précoces de l’infection soulignant l’implication fonctionnelle de hNoL12 dans cette phase de l’infection. Dans un second projet, nous nous sommes intéressés au devenir de la NCp7 dans les cellules infectées, suite à la transcription inverse. Nous avons généré des vecteurs lentiviraux composés de protéines NCp7 fusionnées à une étiquette tétracysteine permettant son marquage spécifique avec le dérivé de la fluorescéine (FlAsH). Nous avons alors étudié, par microscopie confocale, la distribution intracellulaire de la NCp7 dans des conditions proches de l’infection. Nos résultats indiquent qu’une grande partie de la NCp7 se dissocie du PIC durant son transport dans le cytoplasme. Toutefois, la perte de la NCp7 est une étape tardive qui se déroule proche du noyau confirmant ainsi que la décapsidation a lieu à la membrane nucleaire juste avant l’entrée du complexe de préintegration dans le noyau. Le troisième projet a porté sur le développement d’antiviraux ciblant la NCp7. Nous avons travaillé sur la vectorisation et la caractérisation des propriétés antivirales en milieu cellulaire, d’un peptide sélectionné in vitro pour sa capacité à inhiber l’action chaperonne de la NCp7. L’activité antivirale du peptide vectorisé vis-à-vis d’une infection par un vecteur lentiviral basé sur le VIH-1 s’est révélée décevante.The Human Immunodeficiency Virus-1 (HIV-1) nucleocapsid protein (NC) plays a major role in the different steps of theviral lifecycle under its two forms; either as a domain of the polyprotein Gag (NC-Gag) in the late phase or as a matureNCp7 protein in the early phase. In order to better understand the role of the mature form in the viral cycle, we searchedfor new NCp7 specific cellular partners and identified the nucleolar protein hNoL12 which is known to be involved inthe maturation of ribosomal RNAs. The NCp7/hNoL12 interaction was confirmed by co- IP, FRET-FLIM, and yeast twohybrid. The interaction domain was localized between a.a. 22 and 61 on hNoL12; which corresponds to its putative 5’-3’-exonuclease domain. We developed an assay to monitor this activity and found it to be specific of single strand RNA.Finally, the cellular knockdown of hNoL12 resulted in a significant decrease in the infection by a pseudovirus mimickingthe early phase of the infection, emphasizing the functional involvement of hNoL12 in this phase. In a second project, wewere interested in the fate of the viral incoming NCp7 in the infected cells, after reverse transcription. We thus generatedlentiviral vectors composed of NCp7 fused to a tetracysteine tag enabling its specific labeling with the fluoresceinderivative FlAsH. We then studied by confocal microscopy, the intracellular distribution of NCp7 containing viralparticles in conditions close to the infection. Our results showed that an important proportion of the NCp7 moleculesdissociates from the PIC during its transport in the cytoplasm. However, the loss of NCp7 is a late step of this processand seems to take place close to the nucleus suggesting that the dissociation of the capsid occurs at the nuclear membranejust before the nuclear entry of the PIC. The third project concerns the development of antiviral inhibitors targetingNCp7. We worked on the vectorization and the characterization of the antiviral properties of a peptide selected in vitrofor its ability to inhibit the NCp7 chaperone activity. The inhibitory activity of the vectorized peptide on infection ofHeLa cells by a HIV-1 based lentiviral vector was found deceiving
Activite lipasique dans le plasma de sujets atteints de pancreatite aiguee : optimisation de sa determination et calibration
No full textSIGLECNRS T Bordereau / INIST-CNRS - Institut de l'Information Scientifique et TechniqueFRFranc
Molecular mechanism of the hepatitis C vitus core protein chaperone properties : physicochemical investigation by fluorescence and surface plasmon resonance
No full textLa protéine core de virus de l’hépatite C (HCV) est l’une des dix protéines codées par l’ARN génomique de 9.6kb du virus. C’est une protéine chaperonne multifonctionnelle impliquée dans plusieurs processus viraux comme la prolifération cellulaire, la différentiation, l’encapsidation de l’ARN, la formation de la nucléocapside, et la variabilité génétique. Grâce à ses propriétés de chaperonne, le domaine D1 dimérise la région 3’ non traduite (3’UTR) de l’ARN génomique. Cependant le mécanisme de cette activité chaperonne ainsi que l’interaction entre la protéine Core et différents oligonucléotides de la partie 3’ de l’ARN restent inconnus. Dans ce but, nous avons utilisé différentes approches de fluorescence et la
résonance plasmonique de surface. Ainsi, en utilisant le peptide D1, correspondant à un fragment de la protéine core, ainsi que plusieurs dérivés de ce peptide nous avons caractérisé les paramètres de l’interaction et montré que la protéine core se lie spécifiquement aux oligonucléotides en tige-boucle de la partie 3’. Ensuite, nous avons suivi la conformation de ces oligonucléotides et montré que la protéine core n’est pas capable de déstabiliser leur
structure secondaire. Enfin, nous avons décrit au niveau moléculaire le mécanisme permettant à la protéine core d’hybrider des oligonucléotides complémentaires et montré que la cinétique d’hybridation repose sur une réaction à deux étapes impliquant un contact boucle-boucle. Ce
travail devrait nous permettre de mieux comprendre le rôle de la protéine core lors de l’encapsidation et la transcription de l’ARN et notamment dans les mécanismes de
recombinaison expliquant les variations génétiques du virus.Open reading frame (ORF) of 9.6kb HCV genomic RNA encodes at least 10 proteins, 4 structural and 6 non-structural, during translation process. The core is one of those 4 structural proteins and considered as a multifunctional chaperone involving in several viral processes like cell proliferation, differentiation, RNA packaging, nucleocapsid formation and recombinant genetic variability. With the virtue of its chaperone properties, Domain D1 dimerises the 3’ untranslated region (3’ UTR) of the genomic RNA. However, the mechanism of the core chaperone activity in the dimerisation of the genomic RNA and in binding with its
target nucleic acids are still unknown and were investigated in this present project. To reach this objective, we used fluorescence and surface plasmon resonance (SPR) techniques. By using the native D1 domain and peptides derived from this domain, we first characterized the binding parameters and the conformational changes associated with the binding of these peptides to the native and mutated sequences from HCV 3’ UTR sequences. Next, we investigated the destabilization of model and HCV ODNs secondary structure by the D1 domain and its mutants and found that core peptides only marginally destabilise the secondary structures of ODNs. In a last step, we described the molecular mechanisms of the core chaperone properties based on the hybridization kinetics of various HCV and model oligonucleotides. These chaperone properties of core are thought to intervene in processes like the encapsidation, the synthesis of the complementary strand of the genomic RNA and the recombination mechanisms participating to the genetic variability of the virus
Etude de l'expression par cytométrie en flux des marqueurs antigeniques CD148, CD200 et CDXXX dans les hémopathies lymphoides B chroniques intérêts diagnostiques et pronostiques
No full textSTRASBOURG ILLKIRCH-Pharmacie (672182101) / SudocSudocFranceF
La paucialbuminurie (physiopathologie et implications thérapeutiques)
No full textSTRASBOURG ILLKIRCH-Pharmacie (672182101) / SudocSTRASBOURG-Sc. et Techniques (674822102) / SudocSudocFranceF
PRISE EN CHARGE DE L'ANEMIE ASSOCIEE A L'INSUFFISANCE RENALE CHRONIQUE
No full textSTRASBOURG ILLKIRCH-Pharmacie (672182101) / SudocSudocFranceF
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