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Micropatterning of quantum dots monolayer for quantitative FRET-based imaging
No full textInternational audienceDuring adhesion and migration, cells interact with their environment through various physicochemical interactions and forces generated by actin cytoskeleton, such as those appearing at focal adhesions (FA). FA involves highly specific attachments between the cell and the extra-cellular matrix (ECM), mainly mediated by integrins in cooperation with many other proteins. Various super resolution tools have been used to study cell adhesion and migration (STED, STORM, structured illumination) with the target of imaging architecture and dynamics of FAP with a nanometric resolution. Secondly, geometrical and mechanical constraints provided by in situ micro-environment must be mimicked in single-cell adhesion studies if one does not want risk to produce artifactual results [1].We thus propose a FRET-based nano-imaging technique integrating in its core this micro structuration necessity: Non- radiative Excitation Fluorescence (NEF) nanoscopy [2]. Using a monolayer of quantum dots as donors, NEF imaging allow selective observations of membrane components and quantitative measurement of cell-substrate distances, reaching a nanometric axial resolution without high laser irradiance (0.05-1 W/cm2) nor long time acquisitions (1 s or less). We recently have conducted quantum dots micropatterning to organize the monolayer spatially. We also demonstrated its use as a scaffold for surface structuration of the adhesion protein or peptides (fibronectin and RGD), which specifically bind to integrins. The resulting surface have two main interests: (a) to minimize background noise of illumination while providing FRET, and (b) to control cytoskeleton contractibility and therefore cell shape and motility.The acquired images can be treated through SRRF workflow [3] in a complementary way, in order to achieve lateral super resolution. We believe that our approach will help to investigate rigorously the effect of cells exposition to integrins’ antagonists developed in anticancer therapy.1. THÉRY, M., 2010. Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions. Journal of Cell Science. 15 December 2010. Vol. 123, no. Pt 24, p. 4201–4213. DOI 10.1242/jcs.075150.2. RIACHY, Lina, EL ARAWI, Dalia, JAFFIOL, Rodolphe and VÉZY, Cyrille, 2018. Nanometer-Scale Resolution Achieved with Nonradiative Excitation. ACS Photonics. 20 June 2018. Vol. 5, no. 6, p. 2217–2224.DOI 10.1021/acsphotonics.8b00063.3. CULLEY, Siân, TOSHEVA, Kalina L., MATOS PEREIRA, Pedro and HENRIQUES, Ricardo, 2018. SRRF: Universal live-cell super-resolution microscopy. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. vol. 101, p. 74–79.DOI 10.1016/j.biocel.2018.05.014
Single cell adhesion explored by quantitative fluorescence nanoscopy
No full textLes nouvelles techniques d’imagerie super-résolue ont considérablement facilité l’étude des interactions cellule/substrat. L'obtention d'une résolution axiale nanométrique est un paramètre clé pour analyser l'adhérence. Ainsi, j'ai développé un nouveau dispositif va-TIRFM (microscopie de fluorescence par réflexion totale interne à angle variable) à deux longueurs d’onde. Cette technique consiste à enregistrer une série d’images TIRF en augmentant l'angle d'incidence. Pour déterminer avec précision cet angle, j’ai développé une procédure de calibration simple et robuste. Un rapide traitement d'image permet de reconstruire la topographie de la membrane cellulaire avec une résolution axiale nanométrique et d’extraire la distribution spatiale de l’indice effectif du cortex cellulaire. Pour caractériser l’adhérence j’ai fait un double seuillage sur la hauteur et l’indice afin d’identifier les zones d’interactions spécifiques et non-spécifiques. Le va-TIRF peut également être utilisé pour extraire le potentiel d’interaction membrane/substrat. J'ai ainsi étudié l’adhérence des cellules gliales sur la fibronectine. J’ai montré un changement d'organisation de leurs points focaux d’adhérence et une modification de leur énergie de liaison, sous l’action d’antagonistes connus des intégrines α5β1 et αvβ3 et d’inhibiteurs du cytosquelette. Ces résultats montrent que l’énergie est un paramètre clé pour quantifier l’adhérence des cellules et l’action de différentes molécules.Understanding how cells interact with surfaces has been considerably facilitated by innovative super-resolution imaging. Achieving a nanometric axial resolution is the keystone to decipher adhesion process. For this purpose, I developed a new setup of variable-angle Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (va-TIRFM) including two excitation wavelengths. va-TIRFM involves the recording of several TIRF images at different incident angles. A simple yet robust calibration method is used to accurately evaluate the incident angle. A straight forward data processing can restore cell topography with a nanometric axial resolution. Moreover, I can extract the effective refractive index distribution of the cellular cortex. By combining cell membrane topography and refractive index distribution, I was able to identify areas of specific and non-specific interactions. va-TIRFM can also be used to extract the potential energy profile related to membrane/substrate interactions, which reflects an adhesion energy. I used this technique to study glioblastoma cells in adhesion on fibronectin. By blocking the adhesion signaling pathways using well-known α5β1 and αvβ3 integrin antagonists and cytoskeleton inhibitors, I showed a change in focal adhesion organization, followed by a change in adhesion energy. These results prove that this energy is the key parameter to quantify cellular adhesion and the influence of different molecules
Adhesion studies of giant unilamellar vesicles and living cells by fluorescence nanoscopy
No full textL’objectif de mon travail de thèse a été de caractériser l’adhésion de vésicules géantes lipidiques et de cellules vivantes. Dans le but d’obtenir des informations quantitatives sur l’adhésion, j’ai développé deux techniques de nanoscopie de fluorescence basées sur la microscopie TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence). Cette technique repose sur création d’une onde évanescente à proximité d’une interface. J’ai développé pour cela un montage optique, qui permet de contrôler finement les caractéristiques de l’onde évanescente (longueur d’atténuation, état de polarisation, etc.). L’adhésion des vésicules a été étudiée par nTIRF (TIRF normalisé) : les images TIRF sont normalisées par des images en épi-fluorescence. J’ai pu ainsi caractériser l’adhésion non spécifique (interaction électrostatique) et spécifique (interaction biotine-streptavidine) de vésicules sur différentes surfaces fonctionnalisées. Pour quantifier l’adhésion des cellules, j’ai utilisé l’approche VA-TIRF (TIRF à angle variable). Cette dernière consiste à enregistrer une série d’images en régime évanescent à différents angles d’incidence. Ceci nous a permis d’établir une cartographie des distances entre la membrane ventrale d’une cellule et la surface pour différents comportements d’adhésion initiés sur divers substrats : chimiques ou protéiques. Ces deux techniques permettent de mesurer la distance membrane-surface avec une précision nanométrique, ≈20nm, ce qui est particulièrement adapté à l’étude du processus d’adhésionThe aim of my thesis was to characterize the adhesion of Giant Unilamellar Vesicles and living cells. In order to obtain a quantitative information about the state of the adhesion, I developed two fluorescence nanoscopy techniques based on microscopy TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence). This technique consist of creating an evanescent wave in the vicinity of an interface. I developed the experimental setup, which allows an accurate control of characteristics of the evanescent wave (penetration depth, polarization state, etc.). The vesicles adhesion was studied by nTIRF (normalized TIRF). TIRF images are normalized by epi-fluorescence images. I was able to characterize the nonspecific adhesion (electrostatic interaction) and specific adhesion (biotin-streptavidin interaction) of vesicles on different functionalized surfaces. To quantify the adhesion of cells, I used the VA-TIRF approach (variable angle TIRF). The latter is to record a series of images at different angles of incidence in the evanescent regime. This allowed us to map the distances between the ventral membrane of a cell and the surface for different adhesion behaviors initiated on various substrates: chemical or protein. These two techniques permit to measure the membrane surface-distance with the nanometer precision ≈20nm, which is particularly suitable for the study of the adhesion proces
Quantum dots 2D Micropatterning : Biofunctionnalization & NEF imaging
No full textLa nanoscopie de fluorescence par excitation non radiative (NEF) est une technique d'imagerie basée sur le FRET. L'imagerie NEF s’inscrit dans la famille des méthodes optiques utilisées pour étudier l'adhésion cellulaire en imageant la dynamique spatio-temporelle des points focaux d’adhésion. À partir de la maîtrise de la synthèse de boites quantiques (QDs) et des échanges de leurs ligands, j’ai mis en oeuvre une microstructuration 2D des QDs conjuguant fonctionnalisation covalente bottom-up et microstructuration top-down par photolithographie UV. Ce procédé permet d’obtenir des monocouches denses de QDs organisées en motifs de forme variable, avec une résolution spatiale micrométrique. Ces motifs jouent le rôle de donneurs FRET pour l’imagerie NEF, donnant accès à une résolution axiale nanométrique pour des temps d'acquisition faibles et des puissances laser minimes. J'ai montré la possibilité de biofonctionnaliser les QDs de façon spécifique avec un ligand chélatant le zinc à leur surface. Ce ligand terminé RGD permet l’adhésion des cellules et peut être utilisé pour réaliser du micropatterning cellulaire. Outre la démonstration du FRET entre des cellules et nos substrats, j’ai exploré la combinaison de l’imagerie NEF avec des méthodes de super-résolution basées sur l’analyse des fluctuations de fluorescence.Non-radiative Excitation Fluorescence (NEF) nanoscopy is a promising FRET-based imaging technique, recently introduced in the advanced optical tools family devoted to study cell adhesion by imaging the spatio-temporal dynamics of focal adhesion plaques. From the quantum dots (QDs) synthesis to their ligand exchange skills, I developed a 2D micro-structuration method of QDs combining bottom-up covalent functionalization and top-down micropatterning with UV- photolithography. This method allows to obtain dense monolayers of QDs organized in patterns of various shape, with a micrometric resolution. These active patterns act as FRET donors for NEF imaging, thus giving access to nanometric axial resolution for high acquisition rate and minimal laser power. I show the possibility to biofunctionnalize the QDs, especially with a ligand chelating zinc atoms onto the QD surface. This RGD-terminated ligand enables specific cell adhesion and therefore QDs can be used to perform cell micropatterning. In addition to usual FRET observations between cells and our substrates, I explored the imaging breakthrough offer by fluorescence fluctuations-based Super-Resolution technique in association with NEF
Spectroscopie et imagerie de fluorescence à haute résolution spatiale : nouveaux outils pour le biologie cellulaire
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New tools based on fluorescence nanoscopy to quantify cellular adhesion
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New tools based on fluorescence nanoscopy to quantify cellular adhesion
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