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Phenotyping Polarization Dynamics Of Immune Cells Using A Lipid Droplet - Cell Pairing Microfluidic Platform
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Phenotyping Polarization Dynamics Of Immune Cells Using A Lipid Droplet - Cell Pairing Microfluidic Platform
Léa Pinon, Nicolas Ruyssen, Judith Pineau, Olivier Mesdjian, Damien Cuvelier, Rachele Allena, Sophie Asnacios, Atef Asnacios, PaoloPierobon, Jacques Fattacciol
Gouttes d’émulsions et pièges microfluidiques pour l’étude de la polarisation et des mécanismes des lymphocytes B
No full textJuste après l'invasion d'un agent pathogène, un organisme déploie deux lignes de défense : l'immunité innée et l'immunité adaptative. La première est une réponse à court terme qui prévoit la destruction de l'agent pathogène puis la présentation de l'antigène par des cellules présentatrices d'antigènes (CPA). La dernière assure une importante réponse à long terme principalement grâce aux lymphocytes B qui sécrètent des anticorps à haute affinité et se différencient en lymphocytes B mémoires. Pour ce faire, les cellules B capturent soient des petits antigènes solubles ( 70 kDa) sur différentes CPA telles que les macrophages, les cellules dendritiques et les cellules dendritiques folliculaires. Dans le dernier cas, les CPA et les lymphocytes B assurent le transfert d'antigènes via un contact hautement organisé : la synapse immunologique. Pour comprendre précisément les mécanismes physico-chimiques impliqués dans cette synapse, nous avons d'abord modélisé le contact APC-lymphocyte par nouveau substrat imitant les propriétés membranaires des CPA, et respectant des caractéristiques cruciales telles que la concentration d'antigènes, la mobilité et la déformabilité de la surface. Les gouttes de l'émulsion huile dans eau imitent correctement la mobilité des antigènes à l'interface huile/eau telle qu'elle est observée sur la membrane cellulaire ; et en raison d'une tension superficielle faible et contrôlable, les gouttes sont aussi déformables qu'un véritable APC. Nous avons également utilisé des dispositifs de piégeage microfluidiques pour faciliter l'observation de plusieurs synapses isolées simultanément et suivre leur formation dans le temps. Par conséquent, nous contrôlons temporellement et spatialement la synapse de entre la goutte de type APC et le lymphocyte B. En combinant ces outils, gouttes et pièges microfluidiques, nous avons quantifié la cinétique des lysosomes au cours du temps. En se déplaçant vers la zone de la synapse, ils participent à la polarisation des lymphocytes. Nous avons donc choisi de suivre ces lysosomes afin de quantifier la polarisation cellulaire. Nous avons analysé à la fois le déclenchement de la polarisation et sa cinétique lorsque les cellules B interagissent avec différentes conditions de gouttes. Nous démontrons que (i) les événements de polarisation sont déclenchés lorsque plus de 75 antigènes/µm2 sont impliqués au niveau de la synapse, (ii) la mobilité des antigènes ne contribue à déclencher de tels événements que lorsque les antigènes viennent à manquer (< 75 antigens/µm2), et (iii) les rigidités élevées des gouttes déclenchent la polarisation et modulent leur cinétique. Nous observons également des événements d’anti-polarisation, c'est-à-dire que les lysosomes se déplacent vers l'arrière des cellules, dont la cinétique ne dépend que de la rigidité ; cependant, leur déclenchement dépend à la fois de la concentration et de la mobilité des antigènes. En conclusion, ces résultats apportent clairement une quantification des propriétés de la membrane APC affectant le comportement des lymphocytes B lors de la formation de la synapse immune. En outre, dans quelques résultats préliminaires nous avons quantifié la force appliquée par les cellules B sur les gouttes les plus déformables. Nous découvrons que celles-ci sont en effet déformées par les lymphocytes B lors de la formation de la synapse. De tels résultats prouvent que les gouttelettes que nous avons formulées sont des outils prometteurs pour mesurer dynamiquement la force cellulaire appliquée par les cellules immunitaires non cytotoxiques ou non phagocytaires comme le sont les lymphocytes B. Nous avons déterminé le module viscoélastique des gouttes et des lymphocytes B grâce à des expériences sur microplaques de verre. Premièrement, nous avons confirmé que les cellules B sont 3 fois à 9 fois plus souples que respectivement les cellules dendritiques et les macrophages, et sont donc confrontées [...]Right after a pathogen invasion, an organism deploys two lines of defense: the innate and adaptive immunities. The first one is a short-term response providing pathogen destruction then antigen presentation promoted by Antigen Presenting Cells (APC). The latest ensures an important long-term response mostly thanks to B lymphocytes which promote high-affinity antibodies secretion and memory B cells differentiation. B cells either catch soluble antigens or extract them onto different APC surfaces such as macrophages, dendritic, and follicular dendritic cells. In the latest case, APC and B lymphocytes ensure the antigen transfer via a crucial highly organized contact: the immunological synapse. To precisely understand the physicochemical mechanics involved upon the synapse, we first model the cell-cell contact by creating a new APC-like substrate respecting crucial features such as antigens concentration, mobility and surface deformability. Emulsion droplets properly mimic antigen mobility at the oil/water interface as observed on the cellular membrane; and due to low and controllable surface tension, droplets are as deformable as real APC. We also use microfluidic-trap devices to ease the observation of several isolated synapses simultaneously and follow their formation over time. Consequently, we temporally and spatially control the APC-like droplet/B cell synapse. By combining emulsion and microfluidic tools, we quantify the kinetic of lysosomes moving to the synapse area as a cell polarization readout. We analyze both polarization triggering and kinetics when B cells interact with different conditions. We demonstrate that (i) the polarization events are triggered when more than 75 antigens/µm2 are involved at the synapse, (ii) the antigens mobility only helps trigger such events when antigens are lacking, and (iii) high stiffnesses both trigger polarization and modulate their kinetics. We also observe anti-polarization events, i.e. lysosomes move to the back of cells, which whose kinetics only depends on stiffness however their triggering depends on both antigens concentration and mobility. Altogether, these results clearly bring a quantification of APC membrane properties affecting the B cells behavior. Besides, in a few preliminary results, we quantify the force applied by B cells on soft droplets. We find out softest droplets we formulate are deformed by lymphocytes during the synapse formation. Such results prove droplets are promising tools to dynamically measure the cellular force applied by non-cytotoxic or non-phagocytic immune cells as B lymphocytes are. We determine the viscoelastic modulus of droplets and B cells thanks to glass microplates experiments. We confirm that B cells are respectively 3-fold and 9-fold softer than dendritic cells and macrophages, therefore, they face to a large range of APC stiffnesses in vivo. Unexpectedly, microplates experiments also reveal the high stiffness of droplets having a low surface tension: such droplets exhibit stiffer membrane properties than most rigid APCs (macrophages) although these droplets trigger a B cell behavior comparable to soft live APC (dendritic cells) during in vitro experiments. Therefore, we inquire what/which property does induce such difference. We hypothesize that an adhesion force is the key difference between microplates experiments where droplets non-specifically adhere to glass surface, and droplets-cell contact which specifically adhere thanks to the strong antigen/antibody interaction and the presence of adhesion molecules (integrins). Altogether, these results and suggestions point out the crucial role of adhesion into cell-cell contact which seems to be the next property to explore and quantify during the B cell synapse. As a conclusion, this interdisciplinary Ph.D. project brings a novel tool to quantify the B cell synapse and mechanics. We think such droplets can be now used both to explore directly in lymph nodes (the place where [...
Adhesion and phagocytosis of functionalized emulsion droplets
No full textLa phagocytose par les macrophages est un processus biologique essentiel au système immunitaire et joue un rôle clé dans le maintien de l’homéostasie cellulaire. Les cibles à éliminer varient en terme de tailles, des bactéries (µm) aux cellules cancéreuses ou senescentes (10 – 20 µm). La plupart des études quantitatives sur la phagocytose reposent sur l'utilisation de microparticules de polymère rigides en tant que cibles modèles pour la compréhension des paramètres qui régissent ce processus. Cependant, ces particules ne rendent pas compte de la mobilité latérale des ligands à leur surface malgré la pertinence de ce paramètre dans le contexte immunologique. Cette étude a pour but de synthétiser un matériau biomimétique qui constitue un nouveau système modèle pour l’étude de la phagocytose. Il s’agit de gouttes d’émulsions monodisperses fonctionnalisées avec des IgGs libres de diffuser sur toute la surface. Dans le cadre de cette thèse, nous avons obtenu différentes densités contrôlées de fonctionnalisation, caractérisées de façon quantitative. Ainsi, il nous a été possible de déterminer une densité minimale d’IgGs nécessaire à induire une internalisation efficace des gouttes. Pour des densités supérieures d’IgGs, ces gouttes sont efficacement et spécifiquement internalisées par phagocytose induite par les récepteurs FcR in vitro. Nous avons plus précisément cherché à approfondir la compréhension de certains aspects mécaniques. Nous montrons que, contrairement à des billes de polymères solides, l’internalisation des gouttes est efficace même pour de faibles densités d’IgGs. La phagocytose s’accompagne, pendant la phase d’adhésion à la surface du macrophage, d’une mobilité latérale des ligands en zone de contact. Il apparaît donc que la mobilité latérale des protéines à l'interface d'une cible améliore considérablement sa phagocytose par les macrophages. Ainsi, ces gouttes permettrons d’aborder de nouvelles questions biologiques pour approfondir certaines mécanismes moléculaires et/ou mécaniques.Phagocytosis by macrophages represents a fundamental process essential for both immunity and tissue homeostasis. The size of targets to be eliminated ranges from small particles as bacteria to large objects as cancerous or senescent cells. Most of our current quantitative knowledge on phagocytosis is based on the use of solid polymer microparticles as model targets that are well adapted to the study of phagocytosis mechanisms that do not involve any lateral mobility of the ligands, despite the relevance of this parameter in the immunological context. The aim of this study is to synthesize a biomimetic material that constitutes a new model system for the study of phagocytosis. We designed monodisperse, lateraly mobile IgG-coated emulsion droplets, with different controlled densities of IgGs, that are efficiently and specifically internalized by macrophages through in-vitro FcγR-mediated phagocytosis. The excellent control of the opsonization density allowed us to measure the minimal IgGs density required to induce an efficient internalization. We also attempted to deepen the understanding of certain mechanical aspects. We show that, contrary to solid polymeric beads, droplet uptake is high even for low IgG densities and is accompagnied by the clustering of the opsonins in the zone of contact with the macrophage during the adhesion step. Beyond the sole interest in the design of the material, our results suggest that lateral mobility of proteins at the interface of a target greatly enhances the phagocytic uptake. Thus, emulsion droplets constitute a new interesting target to investigate different biological issues and understand molecular and/or mechanical mechansims
Mouillage Spécifique de Gouttes d'Emulsion sur des Substrats Biomimétiques
No full textWe explored the ability of emulsion droplets to bind specifically solid model substrates and we study the relationship between drop composition and the contact angle. We developed a in-sisu method to graft covalently biotin and streptavidin on the O/W emulsion interface. We characterized the size distribution and the surface density of the streptavidine by flow cytometry. We showed that the contact angle and the adhesion energy grow linearly with the biotin density on the glass coverslip, and we observed a different patterning (disk, ring) of the streptavidin within the adhesion patch, depending on the PEG density on the surface. This result suggest a 2D phase transition of the proteins.Nous avons exploré la capacité des émulsions à adhérer de manière spécifique à des surfaces modèles solides et notamment la relation entre la composition des gouttes à leur interface et la formation d'un angle de contact macroscopique. Nous avons développé une méthode de fonctionnalisation covalente in-situ de l'interface liquide de gouttes d'émulsion H/E par de la biotine puis par de la streptavidine. La distribution de taille et la densité de streptavidine à la surface des gouttes sont caractérisées à l'aide d'une technique originale utilisant un cytomètre à flux. Nous avons montré que l'angle de contact et l'énergie d'adhésion croissent linéairement en fonction de la densité de biotine sur la lamelle et nous avons observé une répartition spatiale différente (disque, couronne) de la streptavidine dans la zone de contact suivant la densité totale en PEG, suggérant une transition de phase à 2D
Mouillage Specifique d'Emulsions sur Substrats Biomimetiques
No full textWe explored the ability of emulsion droplets to bind specifically solid model substrates and we study the relationship between drop composition and the contact angle. We developed a in-sisu method to graft covalently biotin and streptavidin on the O/W emulsion interface. We characterized the size distribution and the surface density of the streptavidine by flow cytometry. We showed that the contact angle and the adhesion energy grow linearly with the biotin density on the glass coverslip, and we observed a different patterning (disk, ring) of the streptavidin within the adhesion patch, depending on the PEG density on the surface. This result suggest a 2D phase transition of the proteins.Nous avons exploré la capacité des émulsions à adhérer de manière spécifique à des surfaces modèles solides et notamment la relation entre la composition des gouttes à leur interface et la formation d'un angle de contact macroscopique. Nous avons développé une méthode de fonctionnalisation covalente in-situ de l'interface liquide de gouttes d'émulsion H/E par de la biotine puis par de la streptavidine. La distribution de taille et la densité de streptavidine à la surface des gouttes sont caractérisées à l'aide d'une technique originale utilisant un cytomètre à flux. Nous avons montré que l'angle de contact et l'énergie d'adhésion croissent linéairement en fonction de la densité de biotine sur la lamelle et nous avons observé une répartition spatiale différente (disque, couronne) de la streptavidine dans la zone de contact suivant la densité totale en PEG, suggérant une transition de phase à 2D
Mouillage Specifique d'Emulsions sur Substrats Biomimetiques
No full textWe explored the ability of emulsion droplets to bind specifically solid model substrates and we study the relationship between drop composition and the contact angle. We developed a in-sisu method to graft covalently biotin and streptavidin on the O/W emulsion interface. We characterized the size distribution and the surface density of the streptavidine by flow cytometry. We showed that the contact angle and the adhesion energy grow linearly with the biotin density on the glass coverslip, and we observed a different patterning (disk, ring) of the streptavidin within the adhesion patch, depending on the PEG density on the surface. This result suggest a 2D phase transition of the proteins.Nous avons exploré la capacité des émulsions à adhérer de manière spécifique à des surfaces modèles solides et notamment la relation entre la composition des gouttes à leur interface et la formation d'un angle de contact macroscopique. Nous avons développé une méthode de fonctionnalisation covalente in-situ de l'interface liquide de gouttes d'émulsion H/E par de la biotine puis par de la streptavidine. La distribution de taille et la densité de streptavidine à la surface des gouttes sont caractérisées à l'aide d'une technique originale utilisant un cytomètre à flux. Nous avons montré que l'angle de contact et l'énergie d'adhésion croissent linéairement en fonction de la densité de biotine sur la lamelle et nous avons observé une répartition spatiale différente (disque, couronne) de la streptavidine dans la zone de contact suivant la densité totale en PEG, suggérant une transition de phase à 2D
Mouillage spécifique d'émulsions sur substrats biomimétiques
No full textPARIS-BIUSJ-Thèses (751052125) / SudocPARIS-BIUSJ-Physique recherche (751052113) / SudocSudocFranceF
Fluorescent glycolipids and glycosylated droplets
No full textCertains agents pathogènes ou cellules tumorales échappent au système immunitaire parce que les cellules immunitaires ne reconnaissent pas les peptides ou protéines présents à leur surface. Les approches thérapeutiques favorisant la reconnaissance de ces peptides ou protéines faiblement immunogènes sont donc très attractives. Pour ainsi forcer l'activation des cellules présentatrices d'antigènes, plusieurs systèmes ont été décrits, à base de liposomes ou de nanoparticules inorganiques. Nous proposons ici d'utiliser un système à base de gouttelettes d'huile. Les micro ou nanogouttelettes d'huile végétale présentent de nombreux avantages par rapport aux microparticules solides inorganiques. Faites de triglycérides naturels, elles sont biocompatibles et biodégradables tout en étant plus robustes que les liposomes. Ce sont des plates-formes idéales pour construire des assemblages multifonctionnels pour la vectorisation. La première partie du projet traite de la synthèse de glycolipides nécessaires pour avoir une reconnaissance des gouttelettes par les lectines présentes dans le système immunitaire (DC-sign). La seconde partie du projet traite de la fabrication des gouttelettes d’huile fonctionnalisées avec les glycolipides précédemment synthétisés et la mise en évidence de leurs interactions avec des lectines.Some pathogens or tumour cells escape the immune system because the immune cells misrecognize their surface peptides or proteins. Therapeutic approaches, promoting the recognition of these poorly immunogenic peptides or proteins are thus very attractive. The strategy is then to process directly peptides or proteins through cell presentating cells. To this end, some systems have been described, based on liposome or nanoparticles. We propose to use an oil droplet based system. Among the microparticles, vegetal oil microdroplets have numerous advantages over solid microparticles. Made of natural triglycerides, they are biocompatible and biodegradable. They are ideal platforms to build multifunctional assemblies for vectorization. In this project, we aim to design and address lipid (soya oil) droplet to dendritic cells via the lectin DC -sign. The first part deals of the synthesis of glycolipids necessary for the recognition by lectins. The second part presents the fabrication of functionalized oil droplets with previously synthesized glycolipids and their interaction with lectins
Single cell proteomics for accelerating drug discovery pipeline
No full textLa cellule est une unité fondamentale de structure et de fonction en biologie. Les systèmes cellulaires tels que les cultures cellulaires, les tissus et les cancers se composent d'une variété de cellules aux propriétés moléculaires et fonctionnelles distinctes. La caractérisation de ces différences cellulaires est essentielle pour comprendre la physiologie ou les pathologies. Pour relever de nombreux défis médicaux et biologiques, l'analyse protéomique du protéome d'une cellule unique est devenue essentielle car elle fournit des informations sur les changements dynamiques du protéome ou l'hétérogénéité cellulaire. Cependant, le protocole classique utilisé en protéomique n'est pas adapté à une cellule unique ou même à des quantités minimes de matériel biologique. Il est donc essentiel de le miniaturiser pour l'adapter à une quantité minimale de matériel. De l'isolement des cellules à l'analyse LC-MS/MS, chaque étape du processus de préparation des échantillons nécessite un développement minutieux pour augmenter la sensibilité de l'analyse et réduire les pertes d'échantillons avant l'arrivée de l'échantillon devant le détecteur du spectromètre de masse. L'étude des surfaces des supports en contact avec les échantillons est souvent négligée et pourtant très importante. Un des phénomènes observés avec les protéines représentant un réel défi en protéomique unicellulaire est l'adsorption non spécifique des molécules d'intérêt sur les surfaces. Ainsi, l'adsorption des protéines et des peptides limite le rendement de récupération et est délétère pour identifier un maximum de peptides. Cet effet est d'autant plus visible que la quantité d'échantillons est faible. Dans le présent travail, nous avons étudié la nature de la surface afin d'optimiser le rendement de préparation des échantillons. Nous avons également étudié plusieurs étapes du protocole afin de les améliorer. Nos résultats ont confirmé qu’un protocole minimaliste ainsi que la réduction et le traitement des surfaces de contact sont des paramètres cruciaux pour améliorer la robustesse de la récupération et de l'identification des protéines et la sensibilité de la détection des peptides lors des analyses en LC-MS/MS de faibles quantités d'extraits de protéines ou un faible nombre de cellules humaines.The cell is a fundamental unit of structure and function in biology. Cellular systems such as cell cultures, tissues and cancers are composed of a variety of cells with distinct molecular and functional properties. Characterization of these cellular differences is essential for understanding normal physiology or pathology. To address many medical and biological challenges, proteomic analysis of the single cell proteome has become essential as it provides information on dynamic changes in the proteome or cellular heterogeneity. However, the classical workflow used in proteomics is not adapted to a single cell or even to minimal quantities of biological material. It is therefore essential to miniaturize it to adapt it to a minimal amount of material. From cell isolation to LC-MS/MS analysis, each step of the sample preparation process requires careful development to increase the sensitivity of the analysis and reduce sample loss before the sample arrives at the mass spectrometer detector. The study of the surfaces of the containers in contact with the samples is often neglected and yet very important. One of the phenomena observed with proteins and representing a real challenge in single-cell proteomics is the non-specific adsorption of molecules of interest on surfaces. Thus, the adsorption of proteins and peptides limits the recovery yield and is deleterious to identify a maximum of peptides. This effect is even more visible when the amount of samples is small. In the present work, we studied the nature of the surface to optimize the sample preparation yield. We also studied several steps of the protocol in order to improve them. Our results confirmed that a minimalist protocol and the reduction and treatment of contact surfaces are crucial parameters to improve the robustness of protein recovery and identification and the sensitivity of peptide detection when working in LC-MS/MS with low amounts of protein extracts or low numbers of human cells
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