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Reference Data for "Four-color single-molecule imaging with engineered tags resolves the molecular architecture of signaling complexes in the plasma membrane"
No full textReference data set for the single molecule co-tracking analysis presented in "Four-color single-molecule imaging with engineered tags resolves the molecular architecture of signaling complexes in the plasma membrane". Corresponding author for further inquiries:
Prof. Dr. Jacob Piehler
University of Osnabrück, Department of Biology/Chemistry, Division of Biophysics, Barbarastr. 11, 49076 Osnabrück, Germany
https://www.biophysik.uni-osnabrueck.de
Biophysical investigation of the ligand-induced assembling of the human type I interferon receptor
No full textType I interferons (IFNs) elicit antiviral, antiproliferative and immunmodulatory responses through binding to a shared receptor consisting of the transmembrane proteins ifnar1 and ifnar2. Differential signaling by different interferons – in particular IFNalpha´s and IFNbeta – suggest different modes of receptor engagement. In this work either single ligand-receptor interactions or the formation of the extracellular part of a signaling complex were investigated referring to thermodynamics, kinetics, stoichiometry and structural organization. Initially an expression and purification strategy for the extracellular domain of ifnar1 (ifnar1-EC) using Sf9 insect cells yielding in mg amounts of glycosylated protein was established. Using reflectometric interference spectroscopy (RIfS) the interactions between IFNalpha2/beta and ifnar1-EC and ifnar2-EC was studied in order to understand the individual energetic contributions within the ternary complex. For IFNalpha2 a Kd of 5 µM for the interaction with ifnar1-EC was determined. Substantially tighter binding of IFNbeta with both ifnar2-EC and ifnar1-EC compared to IFNalpha2 was observed. For neither IFNalpha2 nor IFNbeta stabilization of the complex with ifnar1-EC in presence of soluble ifnar2-EC was detectable. In addition, no direct interaction between ifnar2 and ifnar1 was could be shown. Thus, stem-stem interactions between the extracellular domains of ifnar1 and ifnar2 do not seem to play a role for ternary complex formation. Furthermore, ligand-induced cross-talk between ifnar1-EC and ifnar2-EC being tethered onto solid-supported, fluid lipid bilayers was investigated by RIfS and total internal reflection fluorescence spectroscopy. A very stable binding of IFNalpha2 at high receptor surface concentrations was observed with an apparent kd approximately 200-times lower than for ifnar2-EC alone. This apparent kd was strongly dependent on the surface concentration of the receptor components, suggesting kinetic rather than static stabilization, which was corroborated by competition experiments. These results indicate that signaling is activated by transient cross-talk between ifnar1 and ifnar2, which is by several orders of magnitude more efficiently engaged by IFNbeta than by IFNalpha2. With respect to differential recognition of different IFNs ifnar1-EC was dissected into sub-fragments containing different of the four Ig-like domains. The appropriate folding and glycosylation of these proteins, also purified in mg amounts were confirmed by SDS-PAGE, size exclusion chromatography and CD-spectroscopy. Surprisingly, only one construct containing all three N-terminal Ig-like domains was active in terms of ligand binding, indicating that these domains were required. Competitive binding of IFNalpha2 and IFNbeta to both this fragment and ifnar1-EC was demonstrated. Cellular binding assays with different fragments, however, highlight the key role of the membrane-proximal Ig-like domain for the formation of an in situ IFN-receptor complex and the ensuing signal activation. Even substitution with Ig-like domains from homologous cytokine receptors did not restore high-affinity ligand binding. Receptor assembling analysis on supported lipid bilayer revealed that appropriate orientation of the receptor is required, which is controlled by the membrane-proximal Ig-domain. All results indicate that differential signalling is encoded by the efficiency of signalling complex formation, which is controlled by the binding affinity of IFNs to the extracellular domains of ifnar1 and 2.Die biochemischen und zellbiologischen Mechanismen der interzellulären Kommunikation über Zellbotenstoffe, die Zytokine, spielen eine bedeutende Rolle sowohl in der grundlagenorientierten als auch in der biomedizinischen Forschung. Eine Gruppe der Zytokine, die Typ I Interferone (IFN), stellt aufgrund ihrer antiviralen, antiproliferativen, immunmodulatorischen und antiinflammatorischen Aktivitäten eine wichtige Komponente des angeborenen Immunsystems dar. Von besonderer Bedeutung ist ihre Rolle bei der frühzeitigen Abwehr von Viren, in der sie die erste Antwort in einer Reihe von antiviralen Mechanismen bilden. Bisher sind 16 humane Typ I Interferone bekannt (13 IFNalpha, beta, eta und omega). Abhängig vom Zell- und Gewebetyp kann ein Interferon zu unterschiedlichen zellulären Aktivitäten führen, was als pleiotroper Effekt bezeichnet wird. Zentrales Element der Interferon-vermittelten Signaltransduktion ist der IFN Rezeptor ifnar, welcher sich aus den beiden Transmembranproteinen ifnar1 und ifnar2 zusammensetzt und zur Familie der Klasse II Zytokin Rezeptoren gehört. Dieser Rezeptor fungiert als Verbindungselement zwischen extrazellulärem Milieu und dem Zytoplasma. Alle bekannten IFN rekrutieren ifnar, jedoch führen sie in Abhängigkeit vom jeweiligen Interferon und vom zellulären Kontext zu unterschiedlicher Akzentuierung der aktivierten Signalwege, was als differentielle Signalaktivierung bezeichnet wird. Dies lässt vermuten, dass die differentielle Signalaktivierung in der Erkennung der IFN durch den Rezeptor codiert ist. Ziel dieser Arbeit war es, die Ligand-induzierte Rezeptorassemblierung biophysikalisch zu untersuchen und damit die molekularen Prinzipien der differentiellen Signalaktivierung in vitro zu erforschen. Als Modellsystem dienten die extrazellulären Domänen ifnar1-EC und ifnar2-EC, welche für die Ligandenbindung verantwortlich sind. Die hochaffine Interaktion zwischen ifnar2-EC und IFNalpha2 ist detailliert in vitro untersucht worden, jedoch war nur wenig über ifnar1 bekannt. Da vermutet wird, dass die niedrigaffine Komponente ifnar1 für die differentielle Signalaktivierung verantwortlich ist, steht die extrazelluläre Domäne ifnar1-EC im Fokus dieser Arbeit. Die folgenden Aspekte lagen dabei im Zentrum des Interesses: - Thermodynamik, Kinetik und Stöchiometrie der Einzelinteraktionen zwischen allen involvierten Proteinen: ifnar1-EC, ifnar2-EC und Interferon, - Charakterisierung der Bindungsstelle für verschiedene Liganden auf ifnar1-EC, - Stabilität, Dynamik und Stöchiometrie des Signalkomplexes hinsichtlich verschiedener Liganden, - Strukturelle Organisation von ifnar1-EC im Signalkomplex Ifnar1-EC musste zunächst in quantitativen Mengen hergestellt werden, um die Etablierung eines Bindungsassays zu ermöglichen. Die heterologe, periplasmatische Expression in E. coli führte nur zu geringen Ausbeuten (50 µg/l), und auch andere Expressionsstrategien lieferten keine nachweisbaren Mengen an monomerem Protein. Aus diesem Grund wurde die Expression in Sf9 Insektenzellen eingesetzt. Mittels homologer Rekombination wurde das Gen ifnar1-EC mit einem C-terminalen Deca-Histidin-tag in das Genom des Baculovirus integriert. Von diesen Viren infizierte Sf9 Zellen exprimierten ifnar1-EC und sezernierten es in das Medium, was zugleich den ersten Reinigungsschritt darstellte. Durch Metall-Affinitätschromatographie wurde ifnar1-EC aus dem Medium extrahiert und von anderen Proteinen abgetrennt. Im abschließenden Reinigungsschritt, der Gelfiltration, wurden dann Aggregate und niedermolekulare Kontaminationen entfernt und gleichzeitig sichergestellt, dass ifnar1-EC als Monomer vorliegt. Die Ausbeute für lag bei ca. 10 mg pro Liter Zellkultur. Es zeigte sich, dass ifnar1-EC glykosyliert war, was durch Deglykosylierungsexperimente mittels PNGaseF bestätigt werden konnte. Die Glykosylierung erwies sich als protein-stabilisierender Faktor, der die Handhabung und Lagerung wesentlich erleichterte. Ebenso konnte die Ausbildung von Disulfidbrücken, welche bei Stabilität und Funktion eine wichtige Rolle spielen, nachgewiesen werden. Um Stöchiometrie und Kinetik der Rezeptor-Ligand-Interaktionen mittels Reflektometrischer Interferenzspektroskopie (RIfS) zu untersuchen, wurden ifnar1-EC und ifnar2-EC mit Hilfe des Deca-Histidin-tags gerichtet und funktional auf Oberflächen immobilisiert. Die Immobilisierung wurde wie bei der Reinigung über eine Metall-Chelator Interaktion gewährleistet. Dazu wurden multivalente Chelatoren auf einer modifizierten Glasoberfläche kovalent gebunden und Ni2+ über 4 Koordinationsstellen komplexiert. Der Deca-Histidin-tag konnte darauf über die freien Koordinationsstellen des Ni2+ binden und so das Protein stabil auf der Oberfläche verankert werden. Zur Untersuchung der Einzelinteraktionen wurde stets eine Untereinheit immobilisiert und anschließend der Assoziations- und Dissoziationsprozess für IFNalpha2 und IFNbeta untersucht. Alle Interaktionen zwischen ifnar1-EC bzw. ifnar2-EC und IFNalpha2/beta wiesen eine 1:1 Stöchiometrie auf. Es zeigten sich jedoch sowohl zwischen den Interferonen als auch zwischen den Rezeptoren große Unterschiede in der Affinität. Für ifnar2-EC wurde eine Dissoziationskonstante von 3 nM für IFNalpha2 bestimmt, wohingegen IFNbeta erheblich stärker bindet (KD < 0.1 nM). Ifnar1-EC bindet sowohl IFNalpha2 (KD = 5 ± 2 µM) als auch IFNbeta (KD = 50 ± 30 nM) etwa drei Größenordnungen schwächer als ifnar2-EC. Im Falle von IFNalpha2 wurde eine transiente Interaktion mit einer Lebensdauer ~ 1 s gemessen. Eine kooperative Bindung in Anwesenheit von ifnar2-EC ohne His-tag konnte weder für IFNalpha2 noch für IFNbeta gezeigt werden. Dieses Ergebnis wurde durch die Beobachtung gestützt, dass keinerlei Interaktion zwischen den beiden Rezeptoren nachgewiesen werden konnte. Eine Interaktion zwischen ifnar1-EC und ifnar2-EC konnte somit ausgeschlossen werden. Um die Bindungsstelle(n) für IFNalpha2 und IFNbeta genauer zu charakterisieren, wurden verschiedene Konstrukte von ifnar1-EC hergestellt, die eine unterschiedliche Anzahl an Immunglobulin-ähnlichen Sub-domänen (SD) beinhalteten. Da ifnar1-EC vier solcher Domänen mit einer Größe von je ~100 Aminosäuren enthält (SD1234), wurden die folgenden Sub-Fragmente anhand der Domänenanordnung und Stellung des His-tags benannt: H10-SD12, SD34-H10, SD123-H10, H10-SD123 und SD234-H10. Alle Sub-Fragmente ließen sich in vergleichbaren Ausbeuten wie der Wildtyp exprimieren und reinigen. Zudem wurde ein ifnar1-EC-Konstrukt mit N- und C-terminalem His-tag (SD1234-DT) hergestellt, welches eine doppelte Verankerung mit der Membran simulieren sollte. Um sicherzustellen, dass alle Konstrukte korrekt gefaltet waren, wurde die Sekundärstruktur mittels CD-Spektroskopie untersucht. Wie erwartet wiesen alle Proteine einen hohen Anteil an beta-Faltblättern auf (~ 80 %), was ein typisches Strukturmerkmal aller extrazellulären Domänen von Klasse I Zytokinrezeptoren darstellt. Bei der biochemischen Charakterisierung mittels analytischer Gelfiltration und SDS-PAGE fiel auf, dass H10-SD123 und SD234-H10 trotz etwa gleichem Molekulargewichts ein unterschiedliches Laufverhalten aufwiesen, wobei H10-SD123 zu einem höheren Molekulargewicht verschoben wurde. Diese auch nach Deglykosylierung reproduzierbare Verschiebung indiziert eine eher gestreckte Anordnung der drei N-terminalen gegenüber den drei C-terminalen Domänen und damit einen nicht symmetrischen Aufbau von ifnar1-EC. In Bindungsexperimenten zeigte sich, dass nur SD123-H10 und H10-SD123 Bindungsaktivität für IFNalpha2 und IFNbeta aufwiesen, alle anderen Sub-Fragmente zeigten keinerlei Bindung im detektierbaren Konzentrationsbereich. Auch eine Rekonstruktion der Bindungsstelle durch Co-Immobilisierung von H10-SD12 und SD34-H10 konnte nicht erreicht werden. Hieraus lässt sich folgern, dass für die Liganden-Bindung alle drei N-terminalen Domänen in einem Polypeptidstrang vorliegen müssen. Hinsichtlich der Bindungsaffinität waren keine signifikanten Unterschiede zwischen ifnar1-EC, SD1234-DT und H10-SD123 nachweisbar. Um mögliche Unterschiede in der Bindungsregion auf ifnar1-EC bzw. SD123 für IFNalpha2 und IFNbeta nachzuweisen, wurden Kompetitionsexperimente mit Fluoreszenz-markiertem IFNalpha2 durchgeführt. Hierbei zeigte sich, dass IFNalpha2 und IFNbeta, wie bei ifnar2-EC, um die gleiche Bindungsregion auf ifnar1-EC konkurrieren und damit auch in dieser Hinsicht kein Unterschied zwischen diesen beiden Interferonen in der Rekrutierung von ifnar1-EC besteht. Zur genaueren Charakterisierung der Liganden-Bindungsstelle wurden mehrere Mutationen auf allen 4 Sub-Domänen auf ifnar1-EC eingeführt. Diese Mutanten, von denen sich der größte Teil wie der Wildtyp exprimieren und reinigen ließ, wurden hinsichtlich ihrer Bindung an IFNalpha2 und IFNbeta untersucht. Anstelle von IFNalpha2wt wurde eine höher affine Mutante (IFNalpha2-HEQ) verwendet, die ähnliche Bindungseigenschaften wie IFNbeta aufwies, jedoch leichter zu handhaben war. Es wurden mehrere Reste identifiziert, die die Bindungsaffinität sowohl für IFNalpha2-HEQ als auch für IFNbeta um eine Größenordnung oder mehr reduzierten. Auf SD1 wurde eine Aminosäure (Y70), auf SD2 vier (E111, K113, W129 und F136) und auf SD3 auch eine Aminosäure (K251) identifiziert. Auf SD4 konnte keine Mutation erzeugt werden, welche die Bindungsaffinität reduziert. Diese Ergebnisse untermauerten die Beobachtungen mit den Sub-Fragmenten und stärkten die Vermutung, dass die 3 N-terminalen Domänen für die Ligandenbindung und SD4 für die Komplexbildung verantwortlich sind. Um die Bildung des Signalkomplexes durch IFN Zugabe zu untersuchen, wurden ifnar1-EC und ifnar2-EC auf einer Chelator-Lipid-Oberfläche co-immobilisiert. Die Verwendung einer Lipid-Doppelschicht ermöglichte laterale Mobilität. Dies wurde durch entsprechende FRAP-Messungen mit Fluoreszenz-markiertem ifnar2 bestätigt. Nach Zugabe von IFNalpha2 bildete sich ein stabiler Komplex mit einer 1:1:1 Stöchiometrie. Diese Stöchiometrie konnte in Lösung mittels Gelfiltration bestätigt werden. Durch Verwendung von IFNalpha2- und ifnar2-EC-Mutanten mit niedrigerer Affinität wurde gezeigt, dass die Stabilität der IFNalpha2-ifnar2-EC Interaktion durch ifnar1-EC um den Faktor 200 gesteigert wurde. Kontrollexperimente auf Glasoberflächen zeigten, dass die Mobilität der Rezeptorkomponenten, wie sie in Lipid-Doppelschichten vorliegt, für die Bildung eines solchen stabilen Komplexes essentiell ist. Es stellte sich nun die Frage, ob der ternäre Komplex statisch oder dynamisch stabilisiert wurde. Um diese Frage zu beantworten, wurde die Oberflächenkonzentration von ifnar1-EC und ifnar2-EC reduziert und die Bindung von Fluoreszenz-markiertem IFNalpha2 S136C mittels TIRFS (Totalinterne Reflektions-Fluoreszenz-Spektroskopie) aufgrund erheblich höherer Sensitivität gegenüber RIfS detektiert. Hierbei zeigte sich mit abnehmender Rezeptor-Oberflächenkonzentration eine zunehmende Dissoziationsratenkonstante, was einen ersten Hinweis auf eine dynamische Stabilisierung darstellte. Diese Vermutung wurde durch Austauschexperimente mit unmarkiertem IFNalpha2 bestätigt. Zudem wurde durch Injektion von löslichem ifnar2-EC gezeigt, dass die Stabilität des ternären Komplexes kein Diffusions-basiertes Rückbindungsphänomen aufgrund von Diffusionen an Grenzflächen ist. Diese Ergebnisse lassen sich durch ein zweistufiges Bindungsmodell erklären. Zunächst wird der Ligand an die hochaffine Rezeptorkomponente ifnar2 gebunden und bildet damit einen binären Komplex (beschrieben durch K1). Im zweiten Schritt, welcher in der Membranebene stattfindet (beschrieben durch K2), führt die Bindung von ifnar1 über die direkte Interaktion mit IFN zur Bildung des ternären Komplexes. Die Komplexbildung und die Dissoziation lassen sich durch die 2-dimensionale Assoziationsratenkonstante (k2) bzw. die Dissoziationsratenkonstante (k-2) der IFN/ifnar1-EC-Interaktion auf der Membran beschreiben. Da unterschiedliche Affinitäten für IFNalpha2 und IFNbeta bestimmt wurden, wird klar, dass die Stabilität des Komplexes und damit die Effizienz der Signalaktivierung von der Dissoziationsratenkonstante der IFN/ifnar1-EC-Interaktion abhängen. Die differentielle Signalaktivierung durch verschiedene Interferone ließe sich somit durch die unterschiedlichen Dissoziationsratenkonstanten erklären. Ebenso wird klar, dass die Komplexbildung und damit k2 zum einen von der Rezeptoroberflächenkonzentration, zum anderen von der Affinität von ifnar1 mit dem binären Komplex abhängen. Unterschiedliche Rezeptoroberflächenkonzentrationen auf verschiedenen Zelltypen könnten erklären, warum verschiedene Zelltypen unterschiedlich auf das gleiche IFN reagieren (pleitroper Effekt). Um diesen Prozess der Komplexbildung genauer zu untersuchen, wurde die Rezeptorassemblierung mit verschiedenen ifnar1-Varianten auf Lipid-Doppelschichten untersucht. SD123-H10, H10-SD123 und SD1234-DT waren bei hohen Oberflächenkonzentrationen in der Lage, einen stabilen ternären Komplex zu bilden. Bei niedrigeren Rezeptor-Oberflächenkonzentrationen jedoch waren deutliche Unterschiede in der Komplexstabilität zu beobachten. C-terminal und doppelt verankerter ifnar1-EC zeigten keinen Unterschied, jedoch wies SD123 unabhängig von der Position des His-tags eine deutlich gesteigerte Dissoziation auf. Offensichtlich erhöht SD4 die Wahrscheinlichkeit einer erfolgreichen Komplexbildung, was die reduzierte Komplexstabilität bei Entfernung dieser Domäne erklären könnte. Diese Vermutung wurde durch Bindungsexperimente auf Zellen bestätigt, in denen ausschließlich ifnar1-EC zu messbarer Bindung führte. Um den Einfluss der Orientierung von SD4 auf die Komplexbildung genauer zu untersuchen, wurden weitere Konstrukte hergestellt. Zum einen wurde ifnar1-EC mit einem N-terminalen His-tag ausgestattet (H10-SD1234), zum anderen wurde SD4 von ifnar1 durch SD2 des IFNλ-Rezeptors (SD123-LRD2-H10) bzw. des IL-10 Rezeptors (SD123-IL-10R2D2) ersetzt. Sowohl die N-terminale Verankerung als auch der Austausch von SD4 zeigte gegenüber der C-terminalen Immobilisierung eine reduzierte Komplexstabilität ähnlich wie SD123. Hieraus lässt sich der Schluss ziehen, dass SD4 offensichtlich für die optimale Orientierung der Ligandenbindungsstelle von ifnar1 verantwortlich ist und damit eine essentielle Rolle bei der Assemblierung des ternären Komlexes spielt
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Prof. Dr. Jacob Piehler
University of Osnabrück, Department of Biology/Chemistry, Division of Biophysics, Barbarastr. 11, 49076 Osnabrück, Germany
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A Versatile Toolbox for Multiplexed Protein Micropatterning by Laser Lithography
No full textPhotocleavable oligohistidine peptides (POHP) allow in situ spatial organization
of multiple His-tagged proteins onto surfaces functionalized with tris(nitrilotriacetic
acid) (tris-NTA). Here, a second generation of POHPs is presented with improved
photoresponse and site-specifi c covalent coupling is introduced for generating
stable protein assemblies. POHPs with different numbers of histidine residues and a
photocleavable linker based on the 4,5-dimethoxy-o-nitrophenyl ethyl chromophore
are prepared. These peptides show better photosensitivity than the previously
used o-nitrophenyl ethyl derivative. Effi cient and stable caging of tris-NTAfunctionalized
surfaces by POHPs comprising 12 histidine residues is demonstrated
by multiparameter solid-phase detection techniques. Laser lithographic uncaging
by photofragmentation of the POHPs is possible with substantially reduced
photodamage as compared to previous approaches. Thus, in situ micropatterning
of His-tagged proteins under physiological conditions is demonstrated for the fi rst
time. In combination with a short peptide tag for a site-specifi c enzymatic coupling
reaction, covalent immobilization of multiple proteins into target micropatterns is
possible under physiological conditions.Gropeanu, M.; Bhagawati, M.; Gropeanu, RA.; Rodríguez Muñiz, GM.; Sundaram, S.; Piehler, J.; Campo, AD. (2013). A Versatile Toolbox for Multiplexed Protein Micropatterning by Laser Lithography. Small. 9(6):838-845. doi:10.1002/smll.201201901S83884596Van den Heuvel, M. G. L., & Dekker, C. (2007). Motor Proteins at Work for Nanotechnology. Science, 317(5836), 333-336. doi:10.1126/science.1139570You, C., Bhagawati, M., Brecht, A., & Piehler, J. (2009). Affinity capturing for targeting proteins into micro and nanostructures. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 393(6-7), 1563-1570. doi:10.1007/s00216-008-2595-6Hyun, J., Zhu, Y., Liebmann-Vinson, A., Beebe,, T. P., & Chilkoti, A. (2001). Microstamping on an Activated Polymer Surface: Patterning Biotin and Streptavidin onto Common Polymeric Biomaterials. Langmuir, 17(20), 6358-6367. doi:10.1021/la010695xPark, J. P., Lee, S. J., Park, T. J., Lee, K.-B., Choi, I. S., Lee, S. Y., … Chung, B. H. 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Probing protein conformations by in situ non-covalent flourescence labeling
No full textThe conformational dynamics of proteins plays a key role in their complex physiological functions. Fluorescence resonance energy transfer (FRET) is a particular powerful tool for studying protein conformational dynamics, but requires efficient site-specific labeling with fluorescent reporter probes. We have employed different Iris-NTA/fluorophore conjugates, which bind histidine-tagged proteins with high affinity, for sitespecific incorporation of FRET acceptors into proteins, which were covalently labeled with a donor fluorophore. We demonstrate versatile application of this approach for exploring the conformation of the type I interferon receptor ectodomains ifnar1-EC and ifnar2-EC. Substantial ligand-induced conformational changes of ifnar1-EC, but not ifnar2-EC, were observed by monitoring the fluorescence intensity and the fluorescence lifetime of the FRET donor. Time-resolved fluorescence correlation spectroscopy revealed a substantial conformational flexibility of ifnar1-EC and a ligand-induced tightening. Our results demonstrate that protein labeling with tris-NTA/fluorophores enables for efficient quantitative intramolecular FRET analysis.The conformational dynamics of proteins plays a key role in their complex physiological functions. Fluorescence resonance energy transfer (FRET) is a particular powerful tool for studying protein conformational dynamics, but requires efficient site-specific labeling with fluorescent reporter probes. We have employed different Iris-NTA/fluorophore conjugates, which bind histidine-tagged proteins with high affinity, for sitespecific incorporation of FRET acceptors into proteins, which were covalently labeled with a donor fluorophore. We demonstrate versatile application of this approach for exploring the conformation of the type I interferon receptor ectodomains ifnar1-EC and ifnar2-EC. Substantial ligand-induced conformational changes of ifnar1-EC, but not ifnar2-EC, were observed by monitoring the fluorescence intensity and the fluorescence lifetime of the FRET donor. Time-resolved fluorescence correlation spectroscopy revealed a substantial conformational flexibility of ifnar1-EC and a ligand-induced tightening. Our results demonstrate that protein labeling with tris-NTA/fluorophores enables for efficient quantitative intramolecular FRET analysis
Functional Coupling of Janus Kinases with Cytokine Receptors at the Plasma Membrane
No full textCytokines and their corresponding receptors play crucial roles in regulating processes such as hematopoiesis, immunity, and inflammation. While being promising targets for therapeutic intervention, the high plasticity and pleiotropy of cellular responses to cytokines are currently obstructing medical applications. Class I and class II cytokine receptor (CR) signaling is propagated through Janus family tyrosine kinases (JAK), which bind non-covalently to specific motifs on the receptors' intracellular domains proximal to the plasma membrane (PM). These "Box" motifs, although exhibiting low conservation among different receptors, are essential for ensuring proper JAK activity. However, the precise understanding of mechanistic principles determining functional coupling of JAKs with CRs remain elusive.
This thesis aimed to provide a molecular view on how JAKs bind class I and class II CRs in the context of the PM and to explore how the specificity and promiscuity of JAK recruitment contribute to the pleiotropy of CR signaling. We further sought to uncover the principles of membrane interaction and its impact on JAK association with CRs, downstream signal activation, and the significance of receptor juxtamembrane domain (JMD) in fine-tuning orientation and activity.
Using live cell micropatterning, we obtained quantitative insights into the specificity and promiscuity of JAK family members in binding CRs. Our findings revealed that competitive JAK association with CRs enhances regulation of signaling activity. Moreover, we observed that the localization and stability of receptors on the cell surface depended strongly on the specific JAK involved, despite similar binding affinities. These results elucidated how different functional coupling in receptor-JAK complexes lead to distinct signaling patterns, contributing to their wide range of functions. Furthermore, we identified a membrane binding site of the JAK FERM-SH2 domains comprising conserved hydrophobic and positively charged residues, which controls receptor binding and formation of active signaling complexes at the PM. Interestingly, we find cooperation of the JAK membrane binding site with an amphipathic membrane-proximal helix of CRs. Correlation of binding and activity suggests that this cooperative membrane binding is required for productive orientations of JAKs to form active signaling complexes. Collectively, our results challenge the traditional understanding of JAK-receptor interactions and highlight the significance of PM interactions for effective signaling
Next-Generation JAK2 Inhibitors for the Treatment of Myeloproliferative Neoplasms: Lessons from Structure-Based Drug Discovery Approaches
No full textData source: Supplementary data, https://doi.org/10.1158/2643-3230.BCD-22-0189Selective inhibitors of Janus kinase (JAK) 2 have been in demand since the discovery of the JAK2 V617F mutation present in patients with myeloproliferative neoplasms (MPN); however, the structural basis of V617F oncogenicity has only recently been elucidated. New structural studies reveal a role for other JAK2 domains, beyond the kinase domain, that contribute to pathogenic signaling. Here we evaluate the structure-based approaches that led to recently-approved type I JAK2 inhibitors (fedratinib and pacritinib), as well as type II (BBT594 and CHZ868) and pseudokinase inhibitors under development (JNJ7706621). With full-length JAK homodimeric structures now available, superior selective and mutation-specific JAK2 inhibitors are foreseeable. Significance: The JAK inhibitors currently used for the treatment of MPNs are effective for symptom management but not for disease eradication, primarily because they are not strongly selective for the mutant clone. The rise of computational and structure-based drug discovery approaches together with the knowledge of full-length JAK dimer complexes provides a unique opportunity to develop better targeted therapies for a range of conditions driven by pathologic JAK2 signaling.Pramod C. Nair, Jacob Piehler, Denis Tvorogov, David M. Ross, Angel F. Lopez, Jason Gotlib, and Daniel Thoma
Three-Dimensional Interfacing of Cells with Hierarchical Silicon Nano/Microstructures for Midinfrared Interrogation of In Situ Captured Proteins
No full textLabel-free optical detection of biomolecules is currently limited by a lack of specificity rather than sensitivity. To exploit the much more characteristic refractive index dispersion in the mid-infrared (IR) regime, we have engineered three-dimensional IR-resonant silicon micropillar arrays (Si-MPAs) for protein sensing. By exploiting the unique hierarchical nano- and microstructured design of these Si-MPAs attained by CMOS-compatible silicon-based microfabrication processes, we achieved an optimized interrogation of surface protein binding. Based on spatially resolved surface functionalization, we demonstrate controlled three-dimensional interfacing of mammalian cells with Si-MPAs. Spatially controlled surface functionalization for site-specific protein immobilization enabled efficient targeting of soluble and membrane proteins into sensing hotspots directly from cells cultured on Si-MPAs. Protein binding to Si-MPA hotspots at submonolayer level was unambiguously detected by conventional Fourier transform IR spectroscopy. The compatibility with cost-effective CMOS-based microfabrication techniques readily allows integration of this novel IR transducer into fully fledged bioanalytical microdevices for selective and sensitive protein sensing
Ligand Binding Induces a Conformational Change in ifnar1 that Is Propagated to Its Membrane-Proximal Domain
No full textThe type I interferon (IFN) receptor plays a key role in innate immunity against viral and bacterial infections. Here, we show by intramolecular Förster resonance energy transfer spectroscopy that ligand binding induces substantial conformational changes in the ectodomain of ifnar1 (ifnar1-EC). Binding of IFNα2 and IFNβ induce very similar conformations of ifnar1, which were confirmed by single-particle electron microscopy analysis of the ternary complexes formed by IFNα2 or IFNβ with the two receptor subunits ifnar1-EC and ifnar2-EC. Photo-induced electron-transfer-based fluorescence quenching and single-molecule fluorescence lifetime measurements revealed that the ligand-induced conformational change in the membrane-distal domains of ifnar1-EC is propagated to its membrane-proximal domain, which is not involved in ligand recognition but is essential for signal activation. Temperature-dependent ligand binding studies as well as stopped-flow fluorescence experiments corroborated a multistep conformational change in ifnar1 upon ligand binding. Our results thus suggest that the relatively intricate architecture of the type I IFN receptor complex is designed to propagate the ligand binding event to and possibly even across the membrane by conformational changes
Multi-functional DNA nanostructures that puncture and remodel lipid membranes into hybrid materials
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Multi-functional DNA nanostructures that puncture and remodel lipid membranes into hybrid materials
Oliver Birkholz, Jonathan R. Burns, Christian P. Richter, Olympia E. Psathaki, Stefan Howorka & Jacob Piehler
Nature Communicationsvolume 9, Article number: 1521 (2018)
doi:10.1038/s41467-018-02905-w
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DNA nanostructuresMembrane biophysicsNanoscale biophysicsSynthetic biology
Received:
24 April 2017
Accepted:
08 January 2018
Published:
18 April 2018
Abstract
Synthetically replicating key biological processes requires the ability to puncture lipid bilayer membranes and to remodel their shape. Recently developed artificial DNA nanopores are one possible synthetic route due to their ease of fabrication. However, an unresolved fundamental question is how DNA nanopores bind to and dynamically interact with lipid bilayers. Here we use single-molecule fluorescence microscopy to establish that DNA nanopores carrying cholesterol anchors insert via a two-step mechanism into membranes. Nanopores are furthermore shown to locally cluster and remodel membranes into nanoscale protrusions. Most strikingly, the DNA pores can function as cytoskeletal components by stabilizing autonomously formed lipid nanotubes. The combination of membrane puncturing and remodeling activity can be attributed to the DNA pores’ tunable transition between two orientations to either span or co-align with the lipid bilayer. This insight is expected to catalyze the development of future functional nanodevices relevant in synthetic biology and nanobiotechnology
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