1,721,095 research outputs found
Ttrap: biochemische aspecten en generatie van mutante muismodellen
No full textSequentie informatie over de vele genen die ons maken tot wat we zijn, i s beschikbaar geworden sinds de vervollediging van het Humaan Genoom Pro ject. Echter, er is maar van een beperkt aantal genen ook informatie beschikbaar over hun expressie en functie. De zeer gedetaille erde functionele annotatie van het humane genoom, en het linken van deze informatie met menselijke ziektes, is dan ook de grootste uitdagi ng voor de komende decennia. Genetica linkt mutaties met fenotypes en vice versa, maar gezien spontan e mutaties maar zelden voorkomen, zijn muismodellen gegenereerd via muta genese onmisbaar geworden. De muis is een excellent modelorganisme om de functie van humane genen te ontrafelen, omwille van zijn acceptabele an atomische, fysiologische en genetische gelijkenissen met de mens. Daarom is veel energie geïnvesteerd in het ontwikkelen van verschillende strat egieën om mutante muizen te genereren, die de ontwikkeling van de mens en zijn ziektes meer precies kunnen nabootsen. TRAF en TNF receptor geassocieerd proteïne (TTRAP) werd ontdekt in het g astlaboratorium in een gist-2-hybride screening met het cytoplasmatisch gedeelte van CD40 als a as. TTRAP interageert niet alleen met receptoren van de TNF familie, maa r ook met TRAF proteïnen, en oefent mogelijks een functie uit als negati eve regulator van NF-kB-gemedieerde signalisatie. TTRAP werd ook geïdent ificeerd als Ets-geassocieerd proteïne (EAPII), met een mogelijke rol in de modulatie van transcriptie factor activiteit, maar ook kanker metast ase. Bovendien werd de interactie tussen TTRAP en zowel receptoren als i ntracellulaire mediatoren van de TGFb signalisatie cascade gedocumenteer d, wat mogelijks TTRAP plaatst op de kruising van verschillende signalis atie cascades van de plasmamembraan tot aan de kern, waarbij het extrins ieke groeifactor/cytokine signalisatie linkt met een transcriptionele re spons in de gestimuleerde cel. Morfolino-gemedieerde neerregulatie van Ttrap in de z ebravis toonde aan dat Ttrap belangrijk is voor gastrulatie en links-rechts asymmetrie in de vroege z ebravis ontwikkeling. Deze effecten verlopen via Smad3-gemedieerde regul atie van E-cadherine gen expressie, mogelijks via nodal-Alk4-Smad3 gereg uleerde expressie van de transcriptionele repressor Snail. Hoewel zebrav is een zeer nuttig modelorganisme is omwille van zijn snelle generatie tijd en het f eit dat de embryos transparant zijn, wordt het toch niet vaak gebruikt om gen functies te extrapoleren naar de mens. Daarom werd beslist in dit doctoraat Ttrap mutante muismodellen te genereren om zijn in vivo funct ie te ontrafelen en mogelijks onze bevindingen te extrapoleren naar huma ne ontwikkeling en ziektes. Een tweede doel van dit doctoraat is de verd ere karakterisatie van de biochemische functie(s) van het TTRAP proteïne . In een eerste benadering om een Ttrap mutante muis te genereren, hebben we gebruik gemaakt van een beschikbare gene trap ES cellijn. In de Ttrap gene trap ES cellijn RRS512 is een gene trap vector met een bGeo f usie reporter gen geïntegreerd in intron 5 van Ttrap. Hoewel de initiële karakterisatie van de ES cellijn (het bepalen van de exacte insertie pl aats, de aanwezigheid van de splice acceptor plaats, en de vorming van h et correcte fusie transcript) correct leek te zijn, kwamen verschillende problemen aan het licht na een meer gedetailleerde analyse van de gegen ereerde mutante muizen. In dit specifiek geval, hebben we gevonden dat e r tenminste 40 kopieën van de gene trap vector geïntegreerd waren, waars chijnlijk in dezelfde locus. Nog belangrijker, ondanks deze insertie, ex presseerden de homozygote mutante gene trap muizen nog steeds wildtype T trap mRNA. Via quantitatieve PCR analyse konden we aantonen dat er een d uplicatie was opgetreden van wildtype Ttrap exon 1-5 op het gene trap al lel. Deze zeer zeldzame vorm van reconstitutie van de wildtype functie i n een gene trap achtergrond verhinderde de mogelijke analyse van de rol van Ttrap tijdens de embryonale ontwikkeling van de muis. Als tweede methode maakten we gebruik van de recent ontwikkelde shRNAmir technologie om een gen neer te reguleren in vivo in oocyten. Pronucleai re injectie van een plasmide dat een shRNAmir gericht tegen het gen van interesse bevat, laat toe om inzicht te verwerven in de in vivo functie van dat gen op een zeer snelle, hoewel minder precieze, manier. Het plas mide zal integreren in het genoom en zal blijvend de shRNA sequentie pro duceren en dus een constante neerregulatie van het gen bewerkstelligen. De Ttrap shRNAmir benadering leek veelbelovend, gezien injectie van twee verschillende shRNA plasmiden gericht tegen Ttrap leidde tot vroege emb ryonale letaliteit. Wanneer echter de correcte controle experimenten wer den uitgevoerd, werd duidelijk dat de geobserveerde defecten niet te wij ten waren aan neerregulatie van Ttrap, maar eerder een aspecifiek effect waren. Uiteindelijk blijft gen targeting de meest betrouwbare manier om een mut ante muis te genereren gezien men het targeting construct op dergelijke wijze kan genereren dat de uitschakeling van het gen gegarandeerd is. Ho moloog gerecombineerde ES cellijnen werden gegenereerd met het bestaande conditionele targeting construct, die dan op hun beurt gebruikt werden voor morula aggregatie. Verschillende chimere muizen werden gegenereerd en gaven ook kiembaan transmissie. Door deze muizen met de algemene dele ter muis EIIa-Cre te kruisen, werden homozygote Ttrap knock-out muizen g egenereerd. In tegenstelling tot de vroege embryonale letaliteit geobser veerd in de zebravis, zijn de Ttrap homozygote mutanten levensvatbaar en fertiel, hoewel ze duidelijk geen wildtype Ttrap mRNA meer produceren. De homozygote muizen vertonen geen grote uitwendige def ecten, maar moeten wel nog onderworpen worden aan een gedetailleerde ana lyse. Gezien TTRAP geïdentificeerd was als onderdeel van de TNF signalis atie cascade, betrokken in inflammatie en immuun respons, zal het uiters t interessant zijn om na te gaan of de Ttrap mutante muizen na uitlokken van bepaalde immuun responsen enig fenotype zullen vertonen. Om de biochemische functie(s) van TTRAP in in vitro celcultuur te karakt eriseren hebben we zijn mogelijke interacties en subcellulaire lokalisat ie in de cel onderzocht. TTRAP interageert zeer duidelijk met TRAF2 en T RAF6 en vertoont na overexpressie in sommige cellen ook co-lokalisatie m et deze proteïnen in vesikel-achtige structuren. Om de identiteit van de ze vesikel structuren te achterhalen, werd merker analyse uitgevoerd met verschillende merkers voor de endocytische routes. Endocytose is gekend als een bijkomend niveau van signaal transductie regulatie. Er we rd echter geen co-lokalisatie geobserveerd tussen TRAF2 en TRAF6 en de e ndocytische merkers. TTRAP interageert ook met verschillende Smad proteï nen en co-lokaliseert met Smad6 en Smad7 in de kern. TTRAP zelf komt voo ral tot expressie in de kern, en meer intens in PML nucleaire lichamen. Dit was al gerapporteerd in andere publicaties, wat een mogelijks nuclea ire functie voor TTRAP favoriseert. Hoewel TTRAP in verschillende screen ings als interactie-partner werd geïdentificeerd, werd tot nu toe geen e chte functie voor TTRAP ontdekt. We hopen dat de beschikbare Ttrap knock -out muizen nuttig zullen zijn voor de verdere karakterisatie van zijn r ol, niet alleen in vivo als mogelijk model voor ziektes, maar ook voor v erdere biochemische analyses in Ttrap mutante celculturen. Op het einde van deze thesis bespreken we de mogelijke scenarios voor het gebruik van deze muizen in het veld van DNA herstel en proteasoom functie, mogelijks in tumorvorming en neur odegeneratie.status: Publishe
Identification of genes essential for early mouse development by gene trapping in embryonic stem cells
No full textstatus: Publishe
Analyse van mechanismen van stralingsgeïnduceerde microcefalie bij de muis
No full textstatus: Publishe
Sip1 (Zfhx1b) en de ontwikkeling van het centrale zenuwstelsel: één eiwit, verschillende functies
No full textSmad-Interagerend eiwit-1 (Sip1) werd in ons laboratorium geïdentificeer d als een DNA-bindende, zinkvinger-bevattende transcriptiefactor die kan interageren met receptor-geactiveerde Smads. Ondertussen is aangetoond dat Sip1 ook kan binden met verschillende andere eiwitten, waaronder de CtBP co-repressors en het NuRD chromatine remodelling/co-repressor compl ex. Muizen die geen Sip1 eiwit meer kunnen produceren (Sip1 knockout muizen) , vertonen defecten in de specificatie van de neurale plaat; dit is embr yonale structuur waaruit het complete centrale zenuwstelsel (CZS) ontwik kelt. Bovendien leiden mutaties in ZFHX1B -het gen dat codeert voor SIP1 - in de mens tot het Mowat-Wilson syndroom (MWS). MWS patiënten hebben v erschillende symptomen die geklasseerd kunnen worden in 2 verschillende groepen. De eerste groep van symptomen wordt veroorzaakt door problemen in de ontwikkeling van het CZS, de tweede door problemen in de ontwikkel ing van de neurale lijst cellen. Alle MWS patiënten zijn mentaal geretar deerd en ze vertonen zeer karakteristieke gelaatskenmerken. Naast deze s ymptomen -die aanwezig zijn in alle MWS patiënten- is er een wijd spectr um van variabele symptomen die slechts in een gedeelte van de MWS patiën ten voorkomen zoals epilepsie, onderontwikkeling van de hersenbalk en va n de hippocampus, congenitale hartafwijkingen en de ziekte van Hirschspr ung. Deze gegevens -zowel in muis als in mens- wijzen erop dat Sip1 een essentiële rol speelt in de ontwikkeling van het CZS. Het is dan ook van groot belang om deze rol van Sip1 meer in detail te bestuderen, niet al leen om inzicht te krijgen in de etiologie van het MWS, maar ook breder, om de ontwikkeling van het CZS in het algemeen beter te kunnen bevatten . Dit doctoraatsonderzoek omvat de studie van het Sip1-deficiënte CZS en d it op verschillende tijdstippen, gaande van het neurale plaat-stadium in het vroege embryo tot het volwassen organisme, gebruik makende van de m uis als modelorganisme. Sip1 knockout muizen sterven reeds vroeg in de e mbryonale ontwikkeling en kunnen dus enkel gebruikt worden om de rol van Sip1 in de eerste stappen van de neurogenese te bestuderen. Daarom hebb en we gebruik gemaakt van een conditionele Sip1 muismutant om de rol van Sip1 op latere stadia, en meer specifiek in de ontwikkeling van de neoc ortex, te kunnen bestuderen. Bovendien hebben we het leervermogen en geh eugen van volwassen Sip1 heterozygote muizen onderzocht. Mijn doctoraats project omsluit dus 3 verschillende onderdelen. In elk van deze onderdel en wordt een bepaald aspect van de rol van Sip1 in de ontwikkeling van h et CZS bestudeerd. In een eerste luik hebben we gebruik gemaakt van Sip1 knockout embryos om de rol van Sip1 in de vroege neurogenese te bestuderen. We hebben aan getoond dat Sip1 een belangrijke niet-cel-autonome rol speelt in de vroe ge ontwikkeling van de hersenen, en dit doordat het de expressie van Dkk 1, een algemene inhibitor van de Wnt/beta-catenine signaaltransductiecas cade, reguleert in het anterieure deel van de neurale plaat. In een tweede luik hebben we gebruik gemaakt van conditionele Sip1½Brn4 embryos (verkregen door middel van kruising met de Brn4-Cre deleter mui slijn), waarin Sip1 specifiek verwijderd wordt uit het CZS -maar niet ui t de rest van het embryo- vanaf embryonale dag 8.5. In dit deel van het doctoraatsproject hebben we de rol van Sip1 op een specifiek stadium in de ontwikkeling van de neocortex bestudeerd, namelijk in de ontwikkeling van de preplaat, die gevormd wordt door de eerste postmitotische neuron en van de neocortex. We hebben aangetoond dat Sip1 essentieel is voor de correcte ontwikkeling van de preplaat. Dit deel van het doctoraatsproje ct is een onderdeel van een bredere studie waarin de rol van Sip1 in de ontwikkeling van de neocortex bestudeerd wordt. In een derde luik hebben we het gedrag van Sip1 heterozygote muizen best udeerd, specifiek gericht op leervermogen en geheugen van deze muizen, o m te bepalen of Sip1 heterozygote muizen een goed model zijn voor h et MWS, of, meer algemeen, voor mentale retardatie in de mens. We hebben echter geen opvallende leer- of geheugenproblemen kunnen aantonen in de Sip1 heterozygote muizen. Wel is gebleken dat deze muizen hypo-actief z ijn en dat ze significant lichter wegen dan wild-type muizen. Deze combi natie kan verschillende onderliggende oorzaken hebben waaronder een teko rt aan dopamine of hypotonie. Additionele experimenten zijn noodzakelijk om de oorzaak van deze defecten te achterhalen. In zijn geheel draagt dit doctoraatsonderzoek draagt bij tot de toenemen de hoeveelheid data die aantoont dat Sip1 verschillende en diverse funct ies en actiemechanismes heeft in de ontwikkeling van het CZS en dat deze functies kunnen verschillen naargelang het stadium van ontwikkeling en naargelang de specifieke locatie in het CZS zelf. De onderliggende verkl aring voor deze context-afhankelijke en cel-type specifieke functies van Sip1 ligt waarschijnlijk in het feit dat Sip1 een complex proteïne is d at kan interageren met verschillende interactiepartners, wat resulteert in de regulatie van uiteenlopende doelwitgenen.status: Publishe
MAPC cultuurcondities ondersteunen de derivatie van cellen met karakteristieken van de vroege hypoblast vanuit het beenmerg en de blastocyst
No full textstatus: Publishe
De rol van Zeb2 in beslissingen over het lot van cellen gedurende de ontwikkeling
No full textCell fate decisions during embryogenesis and in proliferation and regeneration competent adult tissues and organs are orchestrated by large numbers of regulators including transcription factors, non-coding RNAs, epigenetic modifiers and longer-range genomic interactions, each downstream of extrinsic signals and their intracellular signal transduction effector proteins. Zeb2 is a DNA-binding transcription factor that steers in such context many cellular processes during early and late embryogenesis, and knowledge is emerging about its role in various adult tissues/organs as well, especially in challenge conditions like tissue organ failure. Mutations in one allele of ZEB2 in humans cause Mowat-Wilson syndrome (MOWS) characterized by severe intellectual disability and, varying from patient to patient, epilepsy, Hirschsprung disease and other defects. In the mouse Zeb2 has been show, including by our laboratory, to regulate different aspects of central and peripheral nervous system (CNS, PNS, respectively) development as well as their post-natal functions. The same applies to embryonic and adult hematopoiesis, T-cell lineage development and function, and e.g. myelinogenesis in the CNS and (re)myelination by Schwann cells in the PNS. In addition, deregulation of the levels of Zeb2, e.g.. an abnormal increase, contributes (in this case) to many cancers and correlates with bad prognosis in humans, as supported by Zeb2 overexpression mouse models.
The action mechanisms by which Zeb2, in concert with many of its emerging protein partners, steers neurogenesis and gliogenesis can be studied in cultured embryonic stem cells (ESCs) and the early CNS in vivo. In human ESCs, intact levels of ZEB2 were shown to be essential for effective neuroectoderm differentiation. The goals of this PhD project were to understand where, when and how Zeb2 functions (i) during mouse brain cortex development (using an in vivo approach) and (ii) in pluripotency and subsequent differentiation of mouse ESCs (in vitro approach).
Genetic inactivation of both alleles of Zeb2 in early neural progenitors (using a Nestin-Cre approach), from dorsal telencephalon (Emx1-Cre) as well as in post-mitotic (NEX-Cre) upper layer neurons in the forming cortex in the embryonic forebrain causes a shift forward in the timing of first embryonic neurogenesis followed by embryonic and early post-natal gliogenesis. This leads to the expansion of the upper layers of the cortex at the expense of the (earlier born) cells of the deeper layers. Using gene expression profiling followed by validation, which is an essential part of this work and this PhD project, we identified neurotrophin-3 (Nt3) and fibroblast growth factor-9 (Fgf9) as extrinsic factors whose levels were significantly increased in the upper layer cells of the Zeb2 knockout (KO) embryonic brain cortex as compared to control. In this way, Zeb2 regulates the generation of subsequent waves of neurogenesis (steered by Nt3 that acts on its Trk receptor complex in the progenitor cells and promotes neurogenesis) and of gliogenesis (via Fgf9 that acts on its receptors there) emanating from the Zeb2-negative progenitor cells in the cortex. Importantly, this work identified Zeb2 as the first transcription factor acting in a cell non-autonomous fashion in cortex development.
In the second part of this PhD research the focus was on the role(s) and action mechanism(s) of Zeb2 in pluripotency and during differentiation of ESCs. For this, Zeb2-deficient (KO) ESCs were established. Using these novel, unique tools in combination with omics, this PhD project was able to add important new functional and mechanistic insight to previous findings. We discovered that Zeb2 is critical for exit from the epiblast state in mouse ESCs and links the pluripotency network and DNA-methylation with irreversible commitment to neural and general differentiation. In particular, we show that Zeb2 KO ESCs display impaired differentiation in embryoid bodies by stalling in an epiblast-like state. Using RNA-Seq we further conclude that Zeb2 mainly acts here as a transcriptional repressor for many genes, either directly or indirectly, in differentiating conditions. Epithelial-mesenchymal transition (EMT), pluripotency, lineage commitment and DNA-(de)methylation genes are deregulated in Zeb2 KO embryoid bodies. By using methylome analysis, we demonstrate these mutant cells cannot maintain their initially acquired DNA-methylation marks in neural-stimulating condition and do not effectively downregulate Oct4, Nanog and Tet1 in differentiation conditions. Tet1 knockdown by RNA interference partially rescues the impaired differentiation of these KO cells. Another part of the PhD project investigated, starting again from the RNA-Seq data, the neuronal inhibitory REST gene, one of the genes whose expression was not silenced in Zeb2 KO ESCs, unlike in normal ESCs. Like for the Tet1 studies, stable REST knockdown lines were established in the Zeb2 KO background. The neural differentiation capacity of such cells line was also partially restored, indicating that REST is another important Zeb2-dependent gene in ESCs. In a last set of experiments, which provide the strong basis for future structure-function analysis of Zeb2 (and hence insight into its functional domains) in this ESC system, the neurodevelopmental potential of Zeb2 Smad-binding domain (SBD) mutant cells was documented. We observed that deletion of the SBD from Zeb2 had a positive effect on neural differentiation, indicating that this Zeb2 domain, and hence possibly its interaction with Smads, co-determines Zeb2’s neural-inducing activity.status: Publishe
Identificatie en karakterisatie van Smad5-interagerende proteïnen in de muis
No full textHet lot van een cel en zijn uiteindelijke determinatie worden in belangrijke mate gestuurd door paracriene communicatie tussen cellen. Deze communicatie wordt bereikt door gesecreteerde groeifactoren en cytokines die aan specifieke receptoren binden en intracellulaire signaaltransductiecascades activeren. Liganden van de Transforming Growth Factorß (Tgfß)/Bone Morphogenetic Protein (Bmp) superfamilie oefenen verschillende functies uit tijdens patroonvorming en morfogenese in het ontwikkelende embryo en tijdens homeostase, weefselherstel en immuunregulatie in het adulte leven. Na ligand binding, kunnen de geactiveerde receptorcomplexen de Smad-afhankelijke signaaltransductiecascade activeren door fosforylatie van specifieke receptor-gereguleerde (R)-Smad proteïnen. Biochemische studies hebben aangetoond dat Smad1, Smad5 en Smad8 intracellulaire effectorproteïnen zijn van Bmp signaaltransductiecascades. Geactiveerde R-Smads kunnen een complex vormen met de gemeenschappelijke Smad, Smad4. Dit Smad complex verplaatst zich naar de kern waar het kan deelnemen aan de regulatie van specifieke transcriptionele responsen. De enorme diversiteit en complexiteit van de processen waarin Bmp signalering een rol speelt, wordt sterk gecontrasteerd door de eenvoudige intracellulaire Smad- gemedieerde signaaltransductiecascade en het kleine aantal intracellulaire Smads. Dit suggereert een strikte regulatie van de cascade op verschillende niveaus. Eén manier van regulatie is om de Smad gemedieerde transcriptionele regulatie van doelwitgenen te verfijnen door interactie van R-Smads met verschillende combinaties van transcriptie factoren, co-activatoren en co-repressoren. Deze proteïnen worden de Smad-interagerende proteïnen of SIPs genoemd. Om het moleculaire werkingsmechanisme van de Bmp-Smad, Smad5, beter te onderbouwen, opteerden we er in dit doctoraatsproject voor om endogene Smad5-IPs te identificeren, die in verschillende cellulaire contexten in muisembryos en weefsels met Smad5 interageren. We hebben een tandem tag-Smad5 knockin allel ontworpen en ingebouwd in embryonale stam cellen en in de muis, om Smad5 complexen uit weefsels van deze muis te zuiveren via een tandem tag-affiniteitszuivering, gevolgd door identificatie van de kandidaat Smad5-IPs via massa spectrometrische analyse. Voor de aanvang van de generatie van dit tag-Smad5 knockin allel, werden verschillende epitoop-getagde Smad5 proteïnen getest op hun in vitro en in vivo functionaliteit en werd een tweestaps-affiniteitszuiveringsprotocol geoptimaliseerd. Gebaseerd op deze resultaten selecteerden we de 3FS-tag. De drie Bmp-Smads, Smad1, -5 en -8, zijn verwisselbaar in celcultuur maar het verschil in fenotype, verkregen door verlies van functie studies in muis en zebravis, wijst op interessante endogene verschillen in hun expressiepatroon of expressieniveaus. Tot op heden werden er echter geen specifieke antilichamen ontwikkeld die de drie proteïnen op een specifieke manier kunnen onderscheiden in secties van muisembryos, tijdens de vroege embryonale ontwikkeling (E6.5 E12.5). De Smad53FS knockin muis, die in dit project werd gegenereerd, is conceptueel ook een Smad5 verklikkermuis/reportermuis, die gebruikt kan worden om de endogene localisatie van Smad5 te documenteren aan de hand van immuunhistochemie. De 3FS-tag is een epitoop dat goed gedetecteerd kan worden met western blot analyse en door immuunprecipitatie maar kan niet gedetecteerd worden door middel van immuunhistochemie met commercieel beschikbare anti-Flag en anti-Strep antilichamen, noch met een zelf ontworpen anti-FS-fusie antilichaam. De Smad53FS knockin muis kan wel gebruikt worden voor het documenteren van het 3FS-Smad5 mRNA expressie patroon, door middel van een 3FS-Smad5 specifieke antisense probe in in situ hybridisatie. Deze probe kruishybridizeert niet met Smad1 en -8. Zodoende hebben we de algehele Smad5 expressie in het E8.5 muisembryo en een lagere expressie in het hart en de voorhersenen kunnen bevestigen. Vooraleer 3FS-Smad5 proteïne-complexen geïsoleerd werden uit geselecteerde weefsels van deze Smad53FS knockin muis, hebben we de haalbaarheid van onze zuiveringsstrategie aangetoond in een initiële studie in Hek293T cellen waarin 3FS-Smad5 tot overexpressie werd gebracht. Twee gekende Smad5-IPs werden geïdentificeerd.We konden geen gekende Smad5-IPs of transcriptiefactoren identificeren, uit Smad53FS knockin embryos, adulte levers of adulte harten. Troponin T2, Tropomyosin 1α, Pyruvate dehydrogenase α en Pyruvate dehydrogenase ß zijn vier proteïnen die geïdentificeerd werden als kandidaat Smad5-IPs in een isolatie uit hartweefsel. In enkele initiële experimenten om de specificiteit van de interactie van deze vier proteïnen en de co-localisatie met Smad5 in cellen te bepalen, werd echter aangetoond dat deze Smad5-IPs aspecifiek werden meegezuiverd tijdens de affiniteitszuivering. Vergelijkende literatuurstudie van alle proteïnen die werden geïdentificeerd in de verschillende analyses, doet vermoeden dat het overgrote deel aspecifiek werd meegezuiverd. Daarom is het nodig om nieuwe strategiën te ontwikkelen om onze zuiveringsmethode te verbeteren. We bediscussiëren verschillende mogelijke verklaringen waarom we er niet in geslaagd zijn om echte endogene Smad5-IPs te identificeren. We stellen alternatieve strategieën voor hoe de beperkingen van het identificeren van intacte proteïnecomplexen vertrekkende van weefsels van de Smad53FS knockin muis of van cellen afgeleid van deze muis, kunnen omzeild worden. Er dient echter rekening gehouden te worden met het feit dat Smad5 gemedieerde signalering en Smad5 complexen waarschijnlijk zeer dynamisch en heterogeen zijn in weefsels.status: Publishe
Verschillende Smad1/Smad5 gemedieerde functies in tip- versus steelcellen reguleren spruiting angiogenese
No full textBlood vessel formation is critical for growth during development and postnatal life. Failure to establish a hierarchical branched blood vessel pattern leads to early embryonic lethality, and deregulation of the vessel patterning after birth contributes to the development of inflammatory, chronic and malignant diseases.Vascular patterning involves guided vessel sprouting, branching and fusion to form a primary network, and subsequent vessel network remodeling. These angiogenic sprouting processes are governed by orchestrated communication between cells in the tissue and the endothelial cells that line the blood vessels. The formation of new blood vessels is largely controlled by diffusible Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) that is produced by cells in hypoxic environments. The resulting gradient of VEGF will trigger in neighboring endothelium via binding to its receptor VEGFR2 - the selection of single endothelial cells (ECs) that will become the leading tip cells, or leader cells, of emerging sprouts. Tip cells are highly invasive and motile cells. Furthermore, they extend numerous filopodia to sense guidance cues in the surrounding microenvironment and to guide the sprout towards the source of VEGF in the hypoxic tissue. The high levels of VEGFR2 signaling experienced by tip cells result in enrichment of the Notch ligand Delta-like 4 (Dll4) in these leading cells. As a consequence of the increased levels of Dll4, they induce higher levels of Notch activity in adjacent ECs, and thus instruct the adjacent cells to acquire a stalk cell identity via Dll4/Notch-mediated lateral inhibition. The increased Notch activity in the stalk cells, or following cells, results in a transient decrease in responsiveness to the tip cell inducing stimuli because the targets of Notch signaling, Hes and Hey/Herp, encode transcriptional repressors that can directly down regulate the expression levels of VEGFR2, VEGFR3 and Dll4. Stalk cells are characterized by the production of higher levels of the target genes for Notch, VEGFR1 and Jagged1, while the production levels of VEGFR2/3 and Dll4 are higher in the tip cells. Genetic studies have demonstrated that Notch mediated lateral inhibition is crucial to balance the number of tip and stalk cells during sprouting angiogenesis.Many members of the BMP and TGFß signaling pathways play pivotal but often poorly defined roles in angiogenesis. Yet, their importance is highlighted by an increasing list of human vascular disorders related to perturbations in these signaling cascades. Furthermore, studies using different mouse models deficient in components of the BMP/TGFb signaling cascade have demonstrated that such animals develop severe cardiovascular defects. However, a complete understanding on the specific BMP/TGFb roles in angiogenesis is obscured by confounding observations in the field. In this project, we investigated the developmental defects in mouse embryos that lack two intracellular signal transducers of the BMP signaling cascade exclusively in endothelium, and studied some of the regulation mechanisms in further detail using a plethora of cell culture assays. We report that Smad1/Smad5 mediated BMP/TGFß signaling has different crucial functions in endothelium. I) It regulates directed cell migration of tip cells, and ii) synergism between Smad1/5 mediated BMP signaling via Id-proteins and Notch signaling is required for the efficient selection of tip and stalk cells. The endothelium-specific inactivation of Smad1/Smad5 in mouse embryos results in impaired Dll4/Notch signaling and increased numbers of tip cell-like cells at the expense of stalk cells. siRNA mediated Smad1/5 down regulation in human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) impaired the expression levels of several target genes of Notch and of other stalk cell-enriched transcripts (Hes1, Hey1, Jagged1, VEGFR1 and Id1-3). Furthermore, Id proteins act as competence factors for stalk cell specification and form complexes with Hes1, which augment Hes1 levels in the endothelium. In contrast, pharmacological inhibition of Notch signaling induced ectopic expression of BMP responsive Id-genes. Our findings provide the first in vivo evidence for a regulatory loop between BMP/TGFß-Smad1/5 and Notch signaling that orchestrates tip versus stalk cell specification and vessel plasticity. In addition, we show that embryos with only one functional allele of either Smad1 or Smad5 in endothelium still die a little later during gestation (E14.5) due to severe cardiovascular and lymphatic defects. In these embryos, we describe that arterial ECs have a mixed identity and produce proteins associated with the arterial and lymphatic endothelium. These results put the BMP/TGFß signaling pathway forward as a novel regulator of EC plasticity and identity, regulation of directed cell migration, and stabilization of the number of tip/stalk cells during mouse early-onset sprouting angiogenesis.status: Publishe
De functie van Smad5 in cardiovasculaire ontwikkeling
No full textHet eerste functionele en cruciaal orgaansysteem in een ontwikkelend embryo is het cardiovasculair systeem. Verschillende groeifactoren, waaronder leden van de TGFß/BMP familie, reguleren de processen die de vorming, ontwikkeling en assemblage van dit cardiovasculair systeem sturen. In mijn doctoraatsproject werd de in vivo functie van Smad5, een intracellulaire mediator van TGFß/BMP signalisatie, in bloedvat- en hartontwikkeling bestudeerd door middel van conditionele geninactivatie (Cre-loxP systeem). Homozygoot gefloxte Smad5 muizen werden gekruist met endotheelcel specifieke (Tie1/2-Cre), gladde spiercel specifieke (Sm22-Cre) en cardiomyocyt specifieke (Sm22-Cre en αMHC-Cre) Cre stammen. Aanvullend hieraan werd ook een vergelijkende transcriptoom analyse op extraembryonaal mesodermweefsel van de dooierzak van het wild-type en het Smad5-deficiënte muisembryo uitgevoerd. Dit was vooral een haalbaarheidsstudie om endogene doelwitgenen voor Smad5 die belangrijk zijn voor bloedvatontwikkeling te identificeren. Slechts enkele dergelijke kandidaat endotheel specifieke Smad5 doelwitgenen werden geïdentificeerd, maar deze konden in ons onderzoek niet ondubbelzinnig bevestigd worden.Inactivatie van het Smad5 gen in endotheelcellen, of gladde spiercellen of in beiden heeft geen effect op de ontwikkeling en organisatie van de embryonale en extra-embryonale vasculatuur of het hart. Bovendien werden er in de adulte mutante muizen ook geen abnormale vasculaire of angiogene responsen waargenomen. Dit was onverwacht omdat eerder was gebleken dat de conventionele Smad5 knockout muis embryonaal sterft aan ernstige cardiovasculaire defecten. Preliminaire data tonen aan dat er in onze Smad5 mutante muismodellen functionele compensatie optreedt door het sterk homologe Smad1. Muismodellen die deficiënt zijn voor zowel Smad5 als Smad1 in endotheelcellen sterven zoals intussen blijkt immers wel embryonaal aan cardiovasculaire defecten. Naast de bloedvatwand specifieke mutanten hebben we ook cardiomyocyt specifieke Smad5-deficiënte muizen bestudeerd (Sm22-Cre+/0;Smad5fl/- en αMHC-Cre+/0;Smad5fl/-; deze laatste in samenwerking met Dr. V. Gaussin, Newark). Ondanks de belangrijke rol van BMP-signalisatie tijdens vroege hartontwikkeling en -morfogenese, ontwikkelen beide weefselspecifieke knockout embryos normaal. Het eerste model (Sm22-Cre) geeft aanleiding tot een mild hartdefect bij adulte vrouwtjes, gekarakteriseerd door milde dilatatie van het linker ventrikel en verminderde fractionele verkorting van de hartspiercellen in vivo (en in geïsoleerde cardiomyocyten) wat resulteert in verminderde fysieke performantie. Het tweede model (αMHC-Cre) ontwikkelt sterker uitgesproken defecten, nl. gedilateerde cardiomyopathie en progressief hartfalen, onafhankelijk van het geslacht. De discrepantie in fenotype tussen beide modellen is opmerkelijk en mogelijk te wijten aan een versterking van het cardiomyocyt defect door accumulatie van Cre recombinase in de niet-delende hartspiercellen van het tweede model (αMHC-Cre). Deze data tonen aan dat de αMHC-Cre muis heel nuttig is voor onderzoek in embryos en jong adulte muizen, maar dat accumulatie van Cre eiwit een verwarrende factor is in de analyse van oudere muizen. Het is daarom belangrijk dat de juiste controle muizen in dergelijke studies opgenomen worden. Tot op heden werd BMP-signalisatie nauwelijks in verband gebracht met adulte hartfysiologie. Onze Sm22-Cre data, en ook de αMHC-Cre data, tonen aan dat Smad5 nodig is voor normale contractiliteit van cardiomyocyten. Bovendien hebben we aangetoond dat Smad5 en ook receptor-geactiveerd Smad5 lokaliseert op de Z-disc, wat de mogelijkheid opent dat Smad5 een component van de stretch-sensor ter hoogte van de Z-disc kan zijn. Om deze hypothese verder te toetsen, werd een in vitro model geïntroduceerd in het laboratorium waarbij culturen van neonatale muis hartspiercellen onderworpen kunnen worden aan mechanische stretch. Dit model wordt nu gebruikt om de functie van Smad5 in mechanische en stimulus geïnduceerde stretch verder te onderzoeken.status: Publishe
- …
