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La protection contre l'apoptose par la mimosine rôle de la protéine p21 [indice supérieur Waf1/Cip1]
No full textNotre hypothèse de travail suppose que la protéine p21[indice supérieur Waf1/Cip1] est ici responsable de la protection contre l'apoptose et que cet effet ne dépend pas de la phase G1 du cycle cellulaire. L'apoptose est détectée par la fragmentation internucléosomale de l'ADN et l'activation de caspases. L'enlèvement de la mimosine après 24h d'incubation permet aux cellules de retourner dans le cycle cellulaire tout en conservant, durant 24h, l'effet protecteur et un niveau élevé de p21[indice supérieur Waf1/Cip1]. Ainsi, l'effet protecteur se trouve dissocié de la phase G1 et semble relié à l'induction de p21[indice supérieur Waf1/Cip1]. Plusieurs stratégies ont été utilisées pour déterminer l'importance de p21[indice supérieur Waf1/Cip1] dans l'inhibition de l'apoptose. D'abord, l'utilisation d'inducteurs de p21[indice supérieur Waf1/Cip1], tels que le butyrate et l'apigénine n'a pas montré de protection contre l'apoptose."--Résumé abrégé par UMI
Dommages et réparation de l'ADN de saccharomyces cerevisiae
No full textLes rayonnements ionisants causent une fragmentation de chromosomes. La majorité des lésions sont caractérisées par des cassures simples brins et doubles brins au sein de la molécule d'acide désoxyribonucléique (ADN). La non réparation de ces dommages peut entraîner la mort de la cellule. Afin de déterminer la réponse cellulaire face aux fragments d'ADN générés par irradiation y, nous avons utilisé Saccharomyces cerevisiae comme système biologique. L'électrophorèse en champ puisé (CHEF) a permis l'analyse de l'intégrité des molécules d'ADN et leur réponse face aux dommages. Grâce à cette technique, nous avons séparé l'ADN chromosomique de Saccharomyces cerevisiae et les bris doubles des chromosomes ont été par la même occasion détectés. Un avantage important qu'offre Saccharomyces cerevisiae est la facilité de générer les mutants en manipulant son génome. Par exemple, pour améliorer la sensibilité et la spécificité de nos tests, nous avons utilisé une souche de levure dont un chromosome III circulaire a été construit par génie génétique. Une seule cassure double linéarise ce chromosome et la migration de cette dernière conformation est très différente de la forme initiale dans le système CHEF. Nous détectons jusqu'à la limite d'une cassure double par chromosome circulaire. Les techniques de Southem et d'hybridation avec une sonde radioactive spécifique ont complété l'identification de ces deux conformations. Nous avons vérifié laquelle de ces trois possibilités de réparation de l'ADN après irradiation y : (1) la recircularisation du chromosome III, (2) un ajout de télomères ou (3) une recombinaison avec les autres chromosomes du génome, est fréquemment utilisé chez les levures. Les résultats obtenus suggèrent une réparation préférentielle par ajout de télomères chez Saccharomyces cerevisiae
Réparation de l'ADN dans les séquences codantes et non-codantes de cellules humaines normales et de type Xeroderma pigmentosum du groupe C
No full textL'ADN est constamment exposé à des dommages endogènes comme la dépurination spontanée ou exogènes causés par différents agents incluant les agents chimiothérapeutiques, les radiations et les agents carcinogènes. Ces dommages non-réparés ou réparés non adéquatement peuvent mener à une transformation maligne, en partie via des mutations dans certains oncogènes et dans certains gènes suppresseurs de tumeur. La plupart de ces dommages sont enlevés via les processus de réparation de l'ADN. Ce mémoire présente une élaboration et une optimisation de techniques permettant l'étude quantitative de la réparation dans les séquences codantes actives et dans les séquences inactives chez les cellules humaines normales et de type Xeroderma pigmentosum du groupe C. Pour l'étude de la réparation dans des séquences inactives, nous avons utilisé les séquences non-codantes alphoïdes hautement répétées, soit des millions d'unités répétées en tandem qu'on appelle LINES pour "long interspersed repeated sequences". La séquence étudiée de la famille a-satellite appartient à la famille XbaI et se compose d'une unité de 341 paires de bases composée de deux monomères divergents (171 et 170 pb), qui est répétée en tandem sur des centaines de kilopaires de bases et que l'on retrouve dans la région centromérique des chromosomes autosomales (14, 20, 22, 15, 2, 4 et 18). Également, nous avons utilisé les séquences appartenant à la famille ?-actine. Cette famille prend avantage par le fait qu'elle comporte un gène actif situé sur le chromosome 7 qui est transcrit et qui peut être stimulé par du sérum ou des facteurs de croissance comme les facteurs de croissance épidermiques ou le cycloheximide. En plus, cette famille de la ?-actine comporte 19 séquences pseudogènes, qui sont distribués sur plusieurs chromosomes et qui sont détectables par buvardage de Southern à l'aide d'une sonde appropriée. La quantification de la réparation s'inspire d'une méthode initialement décrite par Bohr et al. 1985, (Cell 40:359-369) dans le cas de dimères cyclobutyliques induits par les rayons ultraviolets pour l'étude de la réparation dans le gène de la dihydrofolate réductase (DHRF) amplifié environ 100 fois. Cette technique fait appel à la fraction de fragments non-touchés par l'agent dommageable (classe "0") en utilisant la distribution Poisson. Nous avons quantifié la réparation de lésions induites par le N-méthyl-N-nitrosourée. De plus, en présence d'inhibiteurs de la synthèse réparatrice (aphidicoline, inhibiteur de la polymérase ?, ? et ?; hydroxyurée, inhibiteur de la ribonucléotide réductase), nous avons observé une accumulation de sites incisés dans les séquences inertes a-satellites des cellules humaines normales et de type XP-C exposées aux rayons uv, suggérant un potentiel de réparation de lésions induites par les rayons uv dans la chromatine inactive chez les deux types cellulaires
Radiosensibilisation de l'ADN par le 5-bromodéoxyuridine : l'importance de la structure et de la séquence de l'ADN
No full textLes dimères interbrins sont des lésions de type complexe, où les deux brins d'ADN sont pontés de façon covalente. Par conséquent, ce type de lésion est très toxique pour la cellule, car il nuit à la séparation des brins d'ADN nécessaire à des processus cruciaux pour la cellule, comme la réplication et la transcription. De plus, des expériences récentes montrent que la réparation des dimères interbrins passe par la formation d'un bris double brin, une autre lésion avec un potentiel toxique élevé. Ce n'est que tout récemment qu'on a montré que la radiation ionisante menait à la formation de dimères interbrins dans l'ADN cellulaire. On en sait donc encore très peu sur les conditions dans lesquelles se produisent les dimères et comment ils sont réparés. Récemment, à la suite d'une exposition aux radiations ionisantes, notre groupe a mis en évidence la formation de dimères interbrins dans un ADN où une thymidine avait été remplacée par le 5-bromo-2'-désoxyuridine (BrdU). Ces dimères n'étaient formés que lorsque le BrdU se trouvait au centre d'une zone mésappariée. Puisque c'était la première fois que ce type de dommage était observé lors d'une exposition de l'ADN bromé à la radiation ionisante, ma thèse a porté sur l'exploration de la formation du dimère interbrin, particulièrement sur les conditions qui favorisaient sa formation.Les trois articles présentés dans cette thèse montrent que la forme de l'ADN (forme A vs forme B), la séquence, ainsi que le type de radiation employé ont une influence importante sur le type et la fréquence du dommage produit. Ces résultats montrent qu'on en sait encore très peu sur le mécanisme réel de radiosensibilisation de l'ADN bromé dans les cellules. Cependant, ils mettent aussi en évidence la réactivité distincte des régions rnésappariées de l'ADN, ainsi que leur fort potentiel pour la formation de dimères. Or, ces régions mésappariées ne représentent qu'une fraction des structures secondaires et tertiaires de l'ADN présentes dans la cellule
Mécanisme de déclenchement de l'apoptose par des lésions à l'ADN protection par l'induction de l'expression de p21(Waf1/Cip1)
No full textDes travaux de recherche ont démontré que l'activité de transactivation transcriptionnelle du p53 est requise pour l'arrêt en G<sub>1</sub> après un stress génotoxique, mais n'est pas nécessaire pour l'induction de l'apoptose. Également, il a été démontré que le niveau d'expression de la protéine p53 est déterminant pour l'induction de l'apoptose. Par contre, peu d'informations sort disponibles quart à la nature des dommages induisant l'apoptose. Utilisant les cellules A431 et MCF-7, nous avons observé une très borne corrélation entre l'induction de l'apoptose et l'incapacité de la protéine p53 à transactiver un gène en aval lors de la réponse au stress génotoxique, soit p21/WAF1/ CIP1 . Nous avons émis l'hypothèse qu'une inhibition de la transcription par l'ARN polymérase II serait l'élément déclencheur de la voie menant à l'apoptose. Une étude plus élaborée quant à la nature des dommages pouvant induire l'apoptose nous a menée [i.e. menés] à émettre l'hypothèse suivante: les dommages à l'ADN qui sont de bons inhibiteurs de la transcription par l'ARN polymérase II et qui sont réparés par le mécanisme d'excision de nucléotides/resynthèse sont des précurseurs de l'apoptose. En utilisant la mimosine comme inducteur de p21<sup>Waf1/Cip1</sup> par une voie indépendante du p53, nous avons démontré que l'arrêt en phase G<sub>1</sub>, concomitant à l'expression de la protéine p21<sup>Waf1/Cip1</sup>, protège la cellule de l'apoptose. En utilisant un système élaboré à partir d'extraits cellulaires, nous n'avons pu observer d'effet de la protéine p53 sauvage, ni de la protéine mutée, sur le mécanisme de réparation par l'excision de nucléotides/resynthèse in vitro . La corrélation entre l'état sauvage de la protéine p53 et sa capacité à transactiver le gène p21<sup>Waf1/Cip1</sup> après un stress génotoxique nous ont permis de développer un test biochimique pouvant déterminer l'état fonctionnel de la protéine p53 dans différents types cellulaires. En effet, l'induction de l'expression de la protéine p21<sup>Waf1/Cip1</sup> suivant une irradiation (ionisante ou UV) est garante de l'activité fonctionnelle de transactivation transcriptionnelle du p53, donc d'une protéine p53 sauvage."--Résumé abrégé par UM
Protection des ions organiques contre les dommages induits à l'ADN par les électrons de basse énergie
No full textIl a été démontré que les électrons de basse énergie (EBE) peuvent induire des cassures simple brin (CSB) à l'ADN, via la formation d'anions transitoires qui décroissent par attachement dissociatif, ou dans d'autres états électroniques dissociatifs menant à la fragmentation. Afin d'effectuer une étude complète des effets des électrons de basse énergie sur la matière biologique, il est nécessaire de comprendre leur mécanisme d'interaction non seulement avec l'ADN, mais avec les constituants de son environnement. Les histones sont une composante importante de l'environnement moléculaire de l'ADN. Leur charge positive leur permet de s'associer aux groupements phosphate anionique de l'ADN. Le rôle principal de ces protéines basiques consiste à organiser l'ADN et l'empaqueter afin de former la chromatine. Les cations sont une autre composante importante de la cellule; ils jouent un rôle dans la stabilisation de la conformation B de l'ADN in vitro par leurs interactions avec les petits et grands sillons de l'ADN, ainsi qu'avec le groupement phosphate chargé négativement. Avec les histones, ils participent également à la compaction de l'ADN pour former la chromatine. Cette étude a pour but de comprendre comment la présence d'ions organiques (sous forme de Tris et d'EDTA) à proximité de l'ADN modifie le rendement de cassures simple brin induit par les électrons de basse énergie. Le Tris et l'EDTA ont été choisis comme objet d'étude, puisqu'en solution, ils forment le tampon standard pour solubiliser l'ADN dans les expériences in vitro (10mM Tris, 1mM EDTA). De plus, la molécule Tris possède un groupement amine alors que l'EDTA possède 4 groupements carboxyliques. Ensemble, ils peuvent se comporter comme un modèle simple pour les acides aminés. Le ratio molaire de 10 :1 de Tris par rapport à l'EDTA a pour but d'imiter le comportement des histones qui sont riches en arginine et lysine, acides aminés possédant un groupement amine chargé positivement additionnel. Des films d'ADN de différentes épaisseurs, possédant entre 0 et 32 ions organiques/ nucléotide, ont été irradiés avec des électrons de 10eV. Les dommages induits par les électrons, sous forme de cassures, ont été détectés par électrophorèse. Nous avons démontré que le rendement de cassure simple brin diminuait de façon dramatique en fonction du nombre d'ions organiques/ nucléotide. Aussi peu que 2 ions organiques/ nucléotide sont suffisant pour décroître le rendement de SSB de 70%. Cet effet radioprotecteur est en partie expliqué par l'augmentation de l'épaisseur des films, mais surtout par la modification du champ électrique à proximité de l'ADN, due à l'ajout de molécules chargées positivement. La modification du champ électrique près de l'ADN altère les paramètres de résonance comme le temps de vie de l'anion transitoire et la limite de dissociation, qui influent directement sur la section efficace d'attachement dissociatif. L'effet protecteur peut également être expliqué par la restauration des bases anioniques déshydrogénées induites par l'attachement dissociatif de l'électron sur une base (G(-H)[indice supérieur -]). Ce sont les molécules Tris qui, en transférant un atome d'hydrogène ou un proton, restaurent les bases déshydrogénées et inhibent par le fait même la formation de cassures simple brin. Ces résultats indiquent que les histones peuvent également participer à la réparation de dommages précoces induits à l'ADN avant qu'elles ne mènent à des dommages encore plus nocifs et difficiles à réparer, comme les cassures simples brins
Utilisation de l'essai comète et du biomarqueur [gamma]-H2AX pour détecter les dommages induits à l'ADN cellulaire par le 5-bromodéoxyuridine post-irradiation
Full text linkCe mémoire est présenté à la Faculté de médecine et des sciences de la santé de l'Université de Sherbrooke en vue de l'obtention du grade de maître ès sciences (M.Sc.) en radiobiologie (2009). Un jury a révisé les informations contenues dans ce mémoire. Il était composé de professeurs de la Faculté de médecine et des sciences de la santé soit : Darel Hunting PhD, directeur de recherche (département de médecine nucléaire et radiobiologie), Léon Sanche PhD, directeur de recherche (département de médecine nucléaire et radiobiologie), Richard Wagner PhD, membre du programme (département de médecine nucléaire et radiobiologie) et Guylain Boissonneault PhD, membre extérieur au programme (département de biochimie). Le 5-bromodéoxyuridine (BrdU), un analogue halogéné de la thymidine reconnu depuis les années 60 comme étant un excellent radiosensibilisateur. L'hypothèse la plus répandue au sujet de l'effet radio sensibilisant du BrdU est qu'il augmente le nombre de cassures simple et double brin lorsqu'il est incorporé dans l'ADN de la cellule et exposé aux radiations ionisantes. Toutefois, de nouvelles recherches semblent remettre en question les observations précédentes. Ces dernières études ont confirmé que le BrdU est un bon radiosensibilisateur, car il augmente les dommages radio-induits dans l'ADN. Mais, c'est en étant incorporé dans une région simple brin que le BrdU radiosensibilise l'ADN. Ces recherches ont également révélé pour la première fois un nouveau type de dommages produits lors de l'irradiation de l'ADN contenant du BrdU : les dimères interbrins. Le but de ces travaux de recherche est de déterminer si la présence de bromodéoxyuridine dans l'ADN augmente l'induction de bris simple et / ou double brin chez les cellules irradiées en utilisant de nouvelles techniques plus sensibles et spécifiques que celles utilisées auparavant. Pour ce faire, les essais comètes et la détection des foci H2AX phosphorylée pourraient permettre d'établir les effets engendrés par le BrdU au niveau cellulaire. Notre hypothèse (basée sur des résultats préliminaires effectués dans notre laboratoire) est que l'irradiation de l'ADN cellulaire en présence de BrdU augmentera le nombre de bris simple brin sans toutefois augmenter le nombre de bris double brin. Les résultats présentés dans ce mémoire semblent corroborer cette hypothèse. Les nouvelles méthodes d'analyse, soient l'essai comète et la détection des foci [gamma]-H2AX remettent en question ce qui a été dit sur le BrdU au sujet de l'induction des cassures double brin depuis plusieurs années. L'ensemble de ces nouveaux résultats effectué à l'aide de cellules ayant incorporées du BrdU sont en corrélation avec de précédents résultats obtenus dans notre laboratoire sur des oligonucléotides bromés. Ils réaffirment que l'irradiation combinée au BrdU augmente l'induction de bris simple brin mais pas de bris double brin. L'investigation approfondie des mécanismes d'action non élucidés du BrdU au niveau cellulaire et son utilisation à des moments stratégiques pendant le traitement de radiothérapie pourraient accroître son efficacité à des fins d'utilisation clinique
Réparation de l'ADN dans les séquences codantes et non-codantes de cellules humaines normales et de type Xeroderma pigmentosum du groupe C
No full textL'ADN est constamment exposé à des dommages endogènes comme la dépurination spontanée ou exogènes causés par différents agents incluant les agents chimiothérapeutiques, les radiations et les agents carcinogènes. Ces dommages non-réparés ou réparés non adéquatement peuvent mener à une transformation maligne, en partie via des mutations dans certains oncogènes et dans certains gènes suppresseurs de tumeur. La plupart de ces dommages sont enlevés via les processus de réparation de l'ADN. Ce mémoire présente une élaboration et une optimisation de techniques permettant l'étude quantitative de la réparation dans les séquences codantes actives et dans les séquences inactives chez les cellules humaines normales et de type Xeroderma pigmentosum du groupe C. Pour l'étude de la réparation dans des séquences inactives, nous avons utilisé les séquences non-codantes alphoïdes hautement répétées, soit des millions d'unités répétées en tandem qu'on appelle LINES pour "long interspersed repeated sequences". La séquence étudiée de la famille a-satellite appartient à la famille XbaI et se compose d'une unité de 341 paires de bases composée de deux monomères divergents (171 et 170 pb), qui est répétée en tandem sur des centaines de kilopaires de bases et que l'on retrouve dans la région centromérique des chromosomes autosomales (14, 20, 22, 15, 2, 4 et 18). Également, nous avons utilisé les séquences appartenant à la famille ?-actine. Cette famille prend avantage par le fait qu'elle comporte un gène actif situé sur le chromosome 7 qui est transcrit et qui peut être stimulé par du sérum ou des facteurs de croissance comme les facteurs de croissance épidermiques ou le cycloheximide. En plus, cette famille de la ?-actine comporte 19 séquences pseudogènes, qui sont distribués sur plusieurs chromosomes et qui sont détectables par buvardage de Southern à l'aide d'une sonde appropriée. La quantification de la réparation s'inspire d'une méthode initialement décrite par Bohr et al. 1985, (Cell 40:359-369) dans le cas de dimères cyclobutyliques induits par les rayons ultraviolets pour l'étude de la réparation dans le gène de la dihydrofolate réductase (DHRF) amplifié environ 100 fois. Cette technique fait appel à la fraction de fragments non-touchés par l'agent dommageable (classe "0") en utilisant la distribution Poisson. Nous avons quantifié la réparation de lésions induites par le N-méthyl-N-nitrosourée. De plus, en présence d'inhibiteurs de la synthèse réparatrice (aphidicoline, inhibiteur de la polymérase ?, ? et ?; hydroxyurée, inhibiteur de la ribonucléotide réductase), nous avons observé une accumulation de sites incisés dans les séquences inertes a-satellites des cellules humaines normales et de type XP-C exposées aux rayons uv, suggérant un potentiel de réparation de lésions induites par les rayons uv dans la chromatine inactive chez les deux types cellulaires
Le Xeroderma pigmentosum : une maladie à l'étude de la réparation par excision-resynthèse de l'ADN
No full textLe Xeroderma pigmentosum (XP) est une maladie génétique transmise sous le mode autosomal et récessif. Elle est caractérisée par une grande sensibilité aux rayonnements ultra-violets (UV) et une incidence accrue de cancers de peau aux régions exposées. Le développement de cellules néoplasiques serait en partie associé, dans cette maladie, à un défaut de réparation des lésions produites par les rayons UV. Ces lésions sont réparées, dans les cellules humaines, par un mécanisme d'excision-resynthèse. Les cellules en cultures provenant de patients souffrant de Xeroderma pigmentosum sont déficientes dans l'une des étapes initiales de la réparation qui est la reconnaissance du dommage et l'incision du brin d'ADN à côté de celui-ci. Les patients XP sont classés en différents groupes selon la capacité de réparation de leurs cellules en culture, mesurée par l'incorporation de nucléotides marqués dans les zones réparées. Il existe jusqu'à maintenant 7 groupes de complémentation, identifiés de A à G, qui expriment à des degrés différents leur déficience dans la réparation d'excision-resynthèse. Par exemple, les XP du groupe C ne réparent que 15 à 20% des lésions produites par les rayons UV et les zones réparées dans ces cellules ne sont pas distribuées de façon aléatoire mais se retrouvent regroupées ensemble sur un même fragment d'ADN. De plus, la réparation par excision-resynthèse semble préférentielle pour les gènes transcrits. Pour vérifier si la réparation dans les cellules XP-C se limite à certains domaines ou séquences spécifiques du génome, nous avons mesuré la distribution des zones de réparation selon la complexité des séquences par la méthode de Cot. Nos résultats démontrent que les zones réparées chez XP-C, sont distribuées dans tout le génome mais de façon légèrement plus importante dans les séquences répétitives. Tandis que chez les cellules normales, la réparation est légèrement plus élevée dans les séquences uniques. Par une nouvelle méthode élaborée dans notre laboratoire, il est possible d'isoler les zones réparées des cellules humaines. Nous avons ainsi vérifié et caractérisé certaines séquences spécifiques contenues dans les fragments d'ADN réparé 24 heures après irradiation UV des cellules normales et XP-C. Pour vérifier l'influence de l'activité transcriptionnelle sur la réparation par excision-resynthèse, nous avons mesuré la synthèse réparatrice par l'incorporation de nucléotides radioactifs dans les zones réparées et l'accumulation des sites incisés par élution alcaline et ce, en présence d'un inhibiteur de la RNA polymérase II, l'a-amanitine. Nous avons ainsi observé une inhibition de 80 à 100% de la synthèse réparatrice et de l'incision chez les cellules XP-C en présence d'a-amanitine, 3 heures après irradiation aux ultraviolets (20 J/m2). Par contre, chez les cellules normales l'effet est presque nul. La cycloheximide, utilisée à une concentration qui inhibe la synthèse protéique par 75 à 80 %, n'a aucun effet sur le mécanisme de réparation dans les cellules XP-C ni dans les cellules normales. Ces résultats suggèrent la présence de deux voies de réparation des lésions produites par les rayonnements UV chez les cellules humaines. L'une serait dépendante de la transcription et fonctionnelle chez XP-C. Cette voie permettrait la réparation des lésions photoinduites à partir du site d'entrée des enzymes de réparation, qui serait situé probablement à l'endroit même de la transcription, et réparerait ainsi les domaines de la chromatine contenant un ou plusieurs gènes transcrits. Et par un processus continu, réparerait à la fois les domaines adjacents contenant les séquences répétitives non-transcrites. L'autre voie serait indépendante de la transcription et active sur tous les domaines de la chromatine; les deux voies seraient fonctionnelles dans les cellules normales
Purification de fragments d'ADN humain contenant des zones de réparation par excision
No full textIl est maintenant clair que, selon le type cellulaire et l'agent dommageable considéré, la réparation par excision de l'ADN ne se produit pas avec une vitesse et une étendue égale dans toutes les régions du génome de mammifères. Il ne serait pas surprenant, à la lumière des travaux actuels dans le domaine, que les enzymes de réparation montrent une préférence pour des domaines plus ouverts de la chromatine; cependant, plusieurs données supplémentaires sont requises pour élucider les règles gouvernant cette réparation préférentielle de certaines régions du génome. Pour cela, de nouvelles approches expérimentales sont nécessaires et c'est pourquoi nous avons mis au point une technique pour purifier des fragments d'ADN humain ayant subi le processus de réparation par excision. Ces fragments nous permettront d'étudier la réparation de gènes spécifiques de même que la structure de la chromatine au cours de cette réparation. Notre technique implique la réparation par excision des zones d'ADN endommagées en présence de biodUMP et exploite avec profit la nature particulière de l'interaction biotine-streptavidine (Kd 10-15 pour l'obtention de fragments réparés de haute pureté. Plus spécifiquement, le principe de la méthode développée consiste à incorporer, lors de la synthèse réparatrice de l'ADN, un nucléotide sur lequel on a lié de façon covalente la biotine. Il est connu que la biotine forme un complexe d'une stabilité très élevée avec la streptavidine, une protéine très similaire à l'avidine (Kd du complexe 10-15). Le nucléotide modifié (bio-dUMP), lorsque couplé à la streptavidine, confère de nouvelles propriétés physiques aux fragments d'ADN l'ayant incorporé lors de la synthèse réparatrice. Ces nouvelles propriétés physiques permettent d'isoler cet ADN biotiné de l'ADN non réparé, donc sans biotine. Plus précisément, nous avons utilisé des fibroblastes humains normaux endommagés avec les rayons UV, perméabilisés puis incubés en présence d'ATP, de dATP, dGTP, (3H)dCTP et finalement de bio-dUTP pour permettre la synthèse réparatrice. L'ADN total est ensuite purifié dans un gradient de CsTFA, fragmenté par sonication en petits fragments (~150 pb) puis incubé avec la streptavidine. Le complexe bio-SA a une densité de 1.33 g/ml dans le GsTFA comparé à 1.60 g/ml pour l'ADN non-marqué. Cette différence de densité permet, par centrifugation isopycnique, de séparer les fragments d'ADN réparés et marqués à la biotine de ceux non-réparés (donc sans biotine). Le complexe ADN-bio-SA peut aussi être séparé de l'ADN libre par gel de retardement (agarose 2%) ou précipitation par affinité. L'ADN réparé ainsi purifié sera utilisé pour des expériences d'hybridation avec des sondes radioactives de gènes spécifiques qui nous éclaireront sur la cinétique et l'étendue de la réparation dans des séquences spécifiques du génome. Pour étudier la structure de la chromatine au cours de cette réparation, l'ADN réparé en présence de bio-dUMP tel que décrit précédemment sera cette-fois-ci couplé à la streptavidine-ferritine plutôt qu'à la streptavidine et ponté par un psoralène spécifique à l'ADN intercalaire (internucléosomale). Ceci nous permet de délimiter la position des sites réparés au niveau de la chromatine (i.e. ADN intercalaire - nucléosome), à différents stades de la réparation, en visualisant les complexes ADN-biotiné\streptavidine-ferritine au microscope électronique
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