1,721,081 research outputs found
Hydroxyapatite based mouthrinses against oral biofilm formation in situ
Full text linkIntroduction: Nowadays, various artificial dental materials are applied for oral rehabilitation with high rates of success. However, there is still the risk of bacterial colonization, which can affect their clinical performance and lead to failures. Recent reports have shown that hydroxyapatite particles (HAP) may have preventive properties against bacterial adhesion.
Objectives: This in situ study aims to investigate the effect of different sizes and shapes of HAP on the acquired pellicle and on the biofilm formed on enamel, titanium (Ti), ceramic, and polymethyl methacrylate (PMMA).
Material and Methods: This study was performed according to three different protocols. In all of them, the volunteers carried an upper jaw splint with attached samples. Three minutes after the splint placement, the volunteers rinsed with 10 ml of the selected solution for 30 seconds. The tested solutions included three 5% HAP watery solutions, as well as chlorhexidine (CHX) and water, as controls. The HAP solutions were prepared from three powders containing nanoparticles with different shapes and medium sizes: HAP I (needle, 40 nm), HAP II (needle, 100 nm), HAP III (spherical, 200 nm).
In Protocol 1, two volunteers used the selected rinsing solution after 3 min of pellicle formation. Scanning Electron Microscopy (SEM) was used to evaluate the samples immediately after rinsing, 30 min and 2 h after rinsing to assess the capacity of HAP particles to adhere to the pellicle formed on enamel, Ti, ceramic, and PMMA. Protocol 1 also evaluated the influence of the size and shape of the different HAP particles on their adhesion to the pellicle’ surface.
In Protocol 2, the splints remained in the oral cavity for 24 h after pellicle formation and the five volunteers made the rinsing at two different time points. The first rinsing was performed after 3 min of pellicle formation and a second rinsing after a 12 h interval. Protocol 2 evaluated the effects of three different HAP solutions on the biofilm formed on the applied materials.
Protocol 3 evaluated the effects of HAP II on the biofilm adhesion on polished and non-polished titanium discs. The objective was to access the influence of Ti surface topography. The five volunteers rinsed at 4-time points on a 48-h interval. The first rinsing was performed after 3 min of pellicle formation, and three followings rinsing were made each 12 h.
The biofilm coverage and viability in protocols 2 and 3 were assessed by SEM, Fluorescence Microscope (FM) and Transmission Electron Microscope (TEM).
Results: In Protocol 1, descriptive results showed that HAP might interact with the salivary proteins from acquired pellicle despite the particles’ size or shape or the material applied. Protocols 2 and 3 presented similar results: the three HAP solutions did not alter the bacterial viability, but successfully reduced the biofilm adhered to all surfaces tested on protocol 2 and on polished titanium surfaces from protocol 3. The HAP size and shape had no significant influence on its anti-adhesive effects on enamel, titanium, ceramics, or PMMA. Additionally, protocol 3 indicated that the Ti surface topography influences biofilm adhesion and accumulation. SEM figures also suggest that HAP may interact with the oral bacteria from the biofilm.
Conclusions: The anti-adhesive effect of the bioinspired HAP solutions yielded a significant impact on the in situ oral biofilm formation on polished enamel, titanium, ceramics, and PMMA surfaces, representing a promising adjunct solution for biofilm management.Effect von Hydroxylapatit basierten Mundspülungen auf die orale Biofilmbildung in situ
Einleitung: Heutzutage werden verschiedene künstliche Zahnmaterialien mit hohen Erfolgsraten für orale Rehabilitationsbehandlungen eingesetzt. Es besteht jedoch weiterhin das Risiko einer Besiedlung mit Bakterien, die deren klinische Erfolg beeinträchtigen und zum Versagen führen können. Jüngste Berichte haben gezeigt, dass Hydroxylapatit-Partikel (HAP) präventive Eigenschaften gegen die Anhaftung von Bakterien haben können.
Zielsetzung: Ziel dieser in situ-Studie ist es, die Auswirkung unterschiedlicher Größen und Formen von HAP auf die erworbene Pellikel und den auf Zahnschmelz, Titan (Ti), Keramik und Polymethylmethacrylat (PMMA) gebildeten Biofilm zu untersuchen.
Material und Methoden: In dieser Studie wurden drei verschiedene Protokolle durchgeführt. Bei allen versuchen trugen die Probanden eine mit Proben bestückte Oberkieferschiene. Drei Minuten nach der Platzierung der Schiene spülten die Probanden 30 Sekunden lang mit 10 ml der ausgewählten Lösung. Die getesteten Lösungen waren drei wässrige, 5%ige HAP-Lösungen sowie Chlorhexidin (CHX) und Wasser als Kontrollen. Die drei HAP-Lösungen wurden aus unterschiedlichen Pulvern hergestellt, welche Nanopartikel mit unterschiedlichen Formen und mittleren Größen enthielten: HAP I (nadelförmig, 40 nm), HAP II (nadelförmig, 100 nm), HAP III (sphärisch, 200 nm).
Gemäß Protokoll 1 verwendeten zwei Probanden die ausgewählte Spüllösung nach 3 Minuten Pellikelbildung. Die Analyse der Proben erfolgte mittels Rasterelektronenmikroskopie (REM) unmittelbar nach dem Spülen sowie 30 Minuten und 2 Stunden nach dem Spülen, um die Fähigkeit von HAP-Partikeln an die auf Zahnschmelz, Ti, Keramik und PMMA gebildete Pellikel anzuhaften. Protokoll 1 bewertete auch den Einfluss der Größe und Form der HAP-partikel auf das Adhärenzverhalten au des Pellikeloberfläche.
Gemäß Protokoll 2 blieben die Oberkieferschienen nach der Pellikelbildung für 24 Stunden in der Mundhöhle, und die 5 Probanden führten die Spülungen zu zwei verschiedenen Zeitpunkten durch. Die erste Spülung erfolgte nach 3 Minuten Pellikelbildung und eine zweite Spülung nach 12 Stunden. Protokoll 2 bewertete die Auswirkungen dreier verschiedener HAP-Lösungen auf dem Biofilm, der auf den untersuchten Materialien innerhalb von 24 h gebildet wurde.
Protokoll 3 bewertete die Auswirkungen von HAP II auf die Biofilmhaftung an polierten und nicht polierten Titanscheiben. Ziel war es, den Einfluss der Ti-Oberflächentopographie zu erfassen. Die 5 Probanden spülten zu vier Zeitpunkten im Zeitraum von 48 Stunden. Die erste Spülung wurde erfolgter 3 Minuten nach der Pellikelbildung durchgeführt und die drei nachfolgenden Spülungen wurden alle 12 Stunden.
In den Protokollen 2 und 3 wurde die Biofilmbedeckung und Vitalität mittels REM, Fluoreszenzmikroskopie (FM) und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) analysiert.
Ergebnisse: Die Ergebnisse aus Protokoll 1 zeigen, dass HAP unabhängig von der Größe oder Form der Partikel mit den Speichelproteinen der Pellikel interagieren kann. Protokoll 2 und 3 zeigen ähnliche Ergebnisse: Die drei HAP-Lösungen änderten die Vitalität der Bakterien nicht, reduzierten jedoch erfolgreich den Biofilm, der auf allen nach Protokoll 2 getesteten Oberflächen und auch auf den polierten Titanoberflächen nach Protokoll 3 haftete. Die Größe und Form des HAP Partikel hatte keinen signifikanten Einfluss auf die Antihaftwirkung auf Zahnschmelz, Titan, Keramik oder PMMA. Zusätzlich zeigt Protokoll 3, dass die Ti-Oberflächentopographie die Biofilmadhäsion und -akkumulation beeinflusst. Die REM-Analysen zeigen außerdem, dass HAP mit den Bakterien des Biofilms interagieren kann.
Schlussfolgerungen: Die antiadhäsive Wirkung der bioinspirierten HAP-Lösungen hat einen signifikanten Einfluss auf die in situ Biofilmbildung auf polierten Zahnschmelz-, Titan-, Keramik- und PMMA- Oberflächen. Dies stellt einen vielversprechenden neuen Ausatz für das bioinspirierte Biofilm-Management.Collaborative Research Center CRC/SFB 1027, Saarland Universit
Impacts of bystander cells and external Ca2+ on NK/CTL-mediated cytotoxicity
Full text linkImmune killer cells, mainly cytotoxic T lymphocytes (CTLs) and natural killer (NK) cells,
serve a crucial role in eliminating pathogen-infected cells and cancer cells. The specificity of
immune cytotoxicity relies on the formation of the immunological synapse (IS) between the
killer cell and the target. While killer cells search and eliminate targets, environmental
components like the non-target bystander cells and extracellular calcium ([Ca2+]ex) are
important factors relevant for the killer cell’ functions. To date, the impact of bystander cells
and [Ca2+]ex on killer cell cytotoxicity remains poorly understood. To address this question, I
investigated the role of the bystander cells and [Ca2+]ex for killer cell functions. In the first part
of this work, I focused on bystander cells. I found that the presence of bystander cells enhanced
the killing efficiency of both CTLs and NK cells without affecting the degranulation of
cytotoxic lytic granules (LG). Live cell imaging showed that the killer cells migrate with a
faster velocity and a higher persistence in the presence of bystander cells. The persistence, but
not the velocity of killer cells was reduced by the blockade of integrin β chains 1, 2 and 7 on
the killer cells with neutralizing antibodies. Furthermore, bystander cell-generated H2O2
elevates the killer cell migration velocity, but not the persistence and degranulation. In the
second part, based on coworkers' observation, I investigated how [Ca2+]ex affects CTLmediated
cytotoxicity. I reproduced that CTLs show the best killing when [Ca2+]ex was reduced
to 130-800 μM, higher or lower [Ca2+]ex impaired the killing efficiency. The same tendency
was confirmed for LG release in CTLs with the same [Ca2+]ex using total internal reflection
fluorescence microscopy (TIRFM). I could show that the Ca2+ signal at the site where vesicles
fused is lower than in the LG-free cytosol and the site a vesicle stayed non-fused. In summary,
this work suggests that bystander cells enhance NK/CTL-mediated cytotoxicity by promoting
killer cell migration through bystander-derived H2O2 and by killer cell β integrins. CTLs execute the cytotoxicity in a [Ca2+]ex dependent manner, and the release of LG correlates with a
Ca2+ microdomain which contains relatively low Ca2+ at the IS. These results suggest a positive
role of the bystander cells in facilitating killer cell to pinpoint the target, and uncover the
potential utility of tuning [Ca2+]ex to modify killer cell cytotoxicity, therefore allowing new
insights into the possible impact of the microenvironment on immune surveillance.Die wesentlichen Killerzellen des Immunsystems, Zytotoxische T Lymphozyten (CTL)
und Natürliche Killerzellen (NK), spielen eine entscheidende Rolle bei der Eliminierung
von Pathogen-infizierten Zellen und Krebszellen. Die Spezifizität der Zytotoxizität des
Immunsystems hängt dabei von der erfolgreichen Bildung der Immunologischen Synapse
(IS) zwischen Killer- und Zielzelle ab. Die Suche nach und Abtötung von Zielzellen wird
wahrscheinlich von verschiedenen Faktoren des Mikromilieus beeinflusst: U.a. könnten
sogenannte Bystanderzellen, die selbst nicht von den Killerzellen erkannt werden, wie
auch die extrazelluläre Calciumkonzentration ([Ca2+]ex) eine wichtige Rolle für die
Funktion der Killerzellen spielen. Beide Faktoren sind allerdings bis jetzt nicht eingehend
untersucht worden. Daher hat meine Arbeit zum Ziel die Rolle von Bystanderzellen und
von [Ca2+]ex auf die Funktion von Killerzellen zu analysieren. Im ersten Teil der Arbeit
habe ich mich auf die Bystander-Zellen fokussiert. Ich habe herausgefunden, dass die
Effizienz von CTL und NK Zellen bei der Abtötung von Zielzellen durch die
Anwesenheit von Bystander-Zellen positiv beeinflusst wird, ohne dass diese dabei die
Degranulation der lytischen Granula (LG) beeinflusst. Mittels bildgebender Verfahren
konnte nachgewiesen werden, dass CTL und NK Zellen in der Anwesenheit von
Bystander-Zellen schneller migrieren und dabei auch eine höhere Migrations-Persistenz
aufweisen. Dabei wird die Persistenz nicht aber die Geschwindigkeit der Migration durch
eine Blockade der Integrin β-Untereinheiten durch neutralisierende Antikörper reduziert.
Im Gegensatz dazu erhöht H2O2, welches von den Bystander-Zellen produziert wird, die
Geschwindigkeit aber nicht die Persistenz der Migration, ohne dabei die Degranulation
der LG zu beeinflussen. Im zweiten Teil der Arbeit habe ich die Abhängigkeit der CTL
Zytotoxizität von [Ca2+]ex untersucht, basierend auf vorhandenen Ergebnissen von
anderen Labormitgliedern Ich habe reproduziert, dass CTL bei einer [Ca2+]ex von etwa
130-800 μM ein Optimum bezüglich Zytotoxizität gegenüber Zielzellen haben, höheres
oder niedrigeres [Ca2+]ex reduziert die Abtötungseffizienz. Dieselbe Abhängigkeit von
[Ca2+]ex habe ich für die Freisetzung von LG an der IS mittels Totaler-Interner-
Reflektions-Mikroskopie (TIRFM) gemessen. Zusätzlich konnte ich zeigen, dass
intrazelluläre Ca2+ Signale in Bereichen niedriger sind, in denen LG Fusion stattfindet,
und höher in Bereichen, in denen keine Fusion stattfindet. Zusammenfassend zeigt die
Arbeit, dass Bystander-Zellen die Zytotoxizität von CTL und NK Zellen erhöht, und zwar
durch eine H2O2-abhängige Erhöhung der Migrationsgeschwindigkeit und eine Integrinabhängige Erhöhung der Migrationspersistenz. Die zytotoxische Funktion ist Ca2+-
abhängig mit einem relativ niedrigen Ca2+-Optimum und relativ niedrigen Ca2+
Konzentrationen an der IS. Diese Ergebnisse weisen auf eine positive Rolle von
Bystander-Zellen bei Abtötung von Zielzellen hin, und sie zeigen eine Möglichkeit auf,
[Ca2+]ex zu nutzen, um die Zytotoxizität der Killerzellen zu modulieren. Beide Ergebnisse
unterstreichen darüber hinaus die fundamentale Rolle des Mikromilieus bei der
Immunabwehr
Migration of Primary Human Lymphocytes in 3D matrices
Full text linkCytotoxic T cells protect us from viruses and tumors and move large distances within the body to find infected or transformed target cells. Their migration is an interplay of their intrinsic ability to migrate and to sense their environment and adapt to it. The composition of extracellular signals and physical contact to connective tissue fibers modulates the migration of T cells. To be able to analyze lymphocyte behavior in 3D I first developed new imaging methods in 3D environments for epifluorescence and Single Plane Illumination Microscopy (SPIM) using collagen as matrix. As a natural non-toxic substrate that is biologically active and can form sponge-like porous matrices that are homogenous and stable under physiological conditions collagen is a perfect starting point to remodel basic tissue architecture and determine basic migration parameters of lymphocytes. Using this collagen based system with a flattened matrix to avoid out of focus migration of cells (2D matrix) I could determine the basic migration parameters of primary human cytotoxic T lymphocytes (CTL) and natural killer cells (NK) in a 3D environment using epifluorescence microscopy. In 0.25 % collagen, representing normal tissue interstitial matrix, lymphocytes migrate in a random walk at average speeds ~ 5 μm min-1 (range ~ 0.6 - 18 μm min-1) and low average persistence. Bead stimulation of CTL that enriches effector and effector memory subtypes, increases average persistence while average velocity is nearly unchanged. By adding extracellular matrix (ECM) compounds the matrix can easily be modified and cell behavior can be modulated. E.g. fibronectin can modulate cell velocity and persistence while fragmented hyaluronic acid, mimicking inflammation or injury, can modulate persistence of CTL. Transferring the collagen system to selected plane illumination microscopy (SPIM) for long term imaging of large 3D volumes SPIM is highly advantageous as it reduces potential toxicity from illumination of the sample and is unraveled in acquisition speed. Additionally the high resolution and frame rate of SPIM systems allows imaging large volumes of containing hundreds of cells or large organoids / spheroids while at the same time catching subcellular dynamic structures like filopodia or actin waves. A system to analyze CTL biology in SPIM experiments was developed and established successfully. Having set up 3D imaging methods we aimed to elucidate the function of a protein central to CTL dynamics governed by actin polymerization: profilin. Many cytosolic proteins are involved in cytoskeletal remodeling yet not much is known about the dynamic control in human CTL. Profilin1 (PFN1) an actin binding protein that lies at the border of cytoskeletal dynamics and signaling pathways, was found, by our Chinese collaborators in Shanghai, to be downregulated in CTL from pancreatic cancer patients. Using overexpression systems of PFN1 (and mutations) with fluorescent fusion proteins and siRNA downregulation we could show that PFN1 is a negative regulator of CTL cytotoxicity and that interactions with phospholipids and regulatory proteins are important for proper regulation of migration. Interestingly actin polymerization rates appear almost unaffected by changes of the relative PFN1:G-actin concentration as is the case for overexpression of PFN1, the Y59A (abolished actin binding) mutant and CTL with siRNA downregulation of PFN1. Apart from this we could show that PFN1 in primary human CTL modulates the protrusion pattern during migration and the release of LGs at the IS via actin structure modulation at the IS. This shows that especially the interplay with phospholipid pathways is an important function for PFN1 apart from supplying actin monomers to polymerizing actin filaments. The results of the profilin study were published in 2017 (Schoppmeyer et al. 2017).Zytotoxische T Zellen beschützen uns vor Viren und Tumorzellen und müssen dafür große Distanzen im Körper und Gewebe zurücklegen um infizierte oder transformierte Zellen zu finden und eliminieren. T-Zell Migration ist ein Zusammenspiel von extrazellulären Signalen, physischem Kontakt zu Fasern der extrazellulären Matrix, zytoskeletaler Dynamik und dem intrazellulärer Signalwege. Um das Migrationsverhalten von Lymphozyten zu analysieren habe ich zuerst neue Imaging-Methoden entwickelt in 3D Umgebungen für die Epifluoreszenz- und Lichtblattmikroskopie (Selected Plane Illumination Mikroskopie oder SPIM) mit Kollagen als grundlegender Matrix. Diese Methoden werden in dieser Arbeit als 2D Matrix (Epifluoreszenz) und 3D SPIM (Lichtblattmikroskopie) benannt. Die natürliche und nicht toxische Kollagenmatrix ist biologisch aktiv und polymerisiert unter physiologischen Bedingungen zu schwamm-artigen, porösen, homogene und stabilen Matrizen. Dies macht Kollagen zu dem perfekten Startpunkt zur Remodellierung einer grundlegenden Gewebearchitektur und Bestimmung der Grundlegenden Migrationsparameter von Lymphozyten. Mit Hilfe des Kollagen basierten Systems und einer verflachten Matrix (10 - 15 μm) um eine „out of focus“ Migration der Zellen zu verhindern konnte ich Grundlegende Parameter von primären humanen Lymphozyten von gesunden Spendern mit Hilfe des 2D Matrixsystems bestimmen. Lymphozyten migrieren mit einer Zufallsbewegung mit einer Durchschnittsgeschwindigkeit von etwa 5 μm min-1 und niedriger Persistenz in 0.25 % Kollagen. Bead Stimulation von CTL, welche Effektor und Effektor-Gedächtniszellen in der Population anreichert, erhöht die durchschnittliche Persistenz der Population während die Durchschnittsgeschwindigkeit sich kaum verändert. Durch das Hinzufügen von Komponenten der Extrazellulären Matrix (Fibronektin und Hyaluronsäure) ist es relativ einfach möglich die Matrix und damit das Verhalten der darin migrierenden Zellen zu modulieren. Fibronektin z.B. beeinflusst sowohl die Durchschnittsgeschwindigkeit als auch die Persistenz während Hyaluronsäure nur die Persistenz beeinflusst. Zur Langzeitbeobachtung von Zellen unter physiologischen Bedingungen reicht das 2D Matrix System nicht aus auf Grund seiner Limitationen. Der Transfer des kollagen-basierten Systems zu SPIM erlaubt Langzeitaufnahmen von Zellpopulationen in 3D Volumen unter probenschonenden Bedingungen bei gleichzeitiger subzellulärer Auflösung. Das Aktin-Zytoskelett steht zentral zu dynamischen Prozessen in T Zellen und die Polymerisation von Aktinfilamenten ist die treibende Kraft für die Zellbewegung. Eine Vielzahl an Proteinen sind in der Remodellierun
Funktionale Analyse von Tötungsmechanismen humaner Melanom-spezifischer CD8+ T-Zellen und natürlicher Killerzellen
Full text linkSowohl natürliche Killerzellen (NK-Zellen) als auch CD8+ T-Zellen (CTL) übernehmen als zytotoxische Effektorzellen komplementäre Aufgaben in der Immunantwort gegen Pathogene und entartete Zellen. NK-Zellen zählen zur angeborenen Immunität und erkennen ihre Zielzellen über die Bindung keimbahnkodierter Rezeptoren. CD8+ T-Zellen sind hingegen Teil der adaptiven Immunität und interagieren antigenspezifisch über ihren T-Zell-Rezeptor mit dem MHCI-Peptid-Komplex der Zielzelle.
Um eine antigenspezifische Interaktion zwischen einer CD8+ T-Zelle und ihrer Zielzelle auch in vitro zu ermöglichen, wurde im Rahmen dieser Arbeit die Generierung antigenspezifischer CD8+ T-Zellklone erstmals in unserem Labor etabliert. Die Generierung Melanom-spezifischer CD8+ T-Zellklone (CTLMART1 und CTLgp100) hat die direkte Interaktion mit Melanomzellen ermöglicht, wodurch ein Melanom-Kokultur-Modell etabliert werden konnte. Dieses Kokultur Modell wurde im Rahmen dieser Arbeit eingesetzt, um die NK- und CD8+ T Zell Interdependenz (gegenseitige Abhängigkeit) besser verstehen zu können. Dabei wurde die SK-Mel5 Zelllinie zunächst dem Selektionsdruck durch NK bzw. CTLMART1 ausgesetzt. Die überlebenden Melanomzellen aus dieser Kokultur wurden anschließend in einem Zytotoxizitäts-Assay (Real-time Killing Assay) als Zielzellen von NK und CTLMART1 verwendet. Eine Erhöhung des NK:SK-Mel5 Verhältnisses in der Kokultur korrelierte dabei invers mit der Lyseeffizienz der kokultivierten Melanomzellen durch NK. Somit hatte eine NK-Kokultur eine Resistenz der überlebenden Melanomzellen gegen die NK-vermittelte Zytotoxizität zur Folge. Parallel wurde auch in den kokultivierten SK-Mel5 Zellen eine Hochregulation von MHCI, einem Liganden für NK-inhibitorische Rezeptoren, festgestellt. Im Gegenzug war die CTLMART1 vermittelte Zytotoxizität auf die NK-inkubierten SK Mel5 Zellen unverändert. Eine CTLMART1-Kokultur hatte überraschenderweise sowohl eine Resistenz der überlebenden SK-Mel5 Zellen gegen die NK- als auch CTLMART1-vermittelte Zytotoxizität zur Folge. Außerdem wurde auch hier die Expression der MHCI-Rezeptoren hoch-, jedoch ebenso die Expression des MART1 Proteins herunterreguliert. Durch extrazelluläre Beladung der CTLMART1-inkubierten SK Mel5 Zellen mit dem korrespondierenden MART1-Antigen konnte die Resistenz gegenüber der CTLMART1-vermittelten Zytotoxizität kompensiert werden. Die Herunterregulation der MART1-Proteinexpression bewirkt somit eine verminderte Präsentation des korrespondierenden MART1-Antigens über MHCI-Moleküle an der Plasmamembran (PM) und bedingt dadurch eine Reduktion der CTLMART1-vermittelten Zytotoxizität gegen CTLMART1-kokultivierte SK-Mel5 Zellen.
Die CTL- und NK-Zell-vermittelte Zytotoxizität basiert in beiden Fällen auf den gleichen Mechanismen: Das Perforin-vermittelte Killing über Sezernierung von lytischen Vesikeln sowie die Bindung spezifischer Todes-Rezeptoren. Dabei kann der Zielzelltod durch Induktion der Apoptose, bei der die Integrität der PM erhalten bleibt, und durch Induktion der Nekrose ,die ein Aufplatzen der Zelle und damit den Verlust der PM-Integrität zur Folge hat, herbeigeführt werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Eignung der beiden Apoptose-Sensoren pCasper3 GR sowie Annexin V in bildgebenden Verfahren zur Charakterisierung des Effektor-induzierten Zelltodes untersucht und miteinander verglichen. Der FRET-basierte Sensor pCasper3-GR indiziert mittels Farbumschlag der Zelle von orange nach grün die Aktivierung der Effektor-Caspase 3, während das Fluorophor-gekoppelte Annexin V die extrazellulär translozierten Phosphatidylserine (PS) an der PM bindet. Das apoptotische Sterben von Zielzellen wurde dabei stets signifikant früher durch Analyse des pCasper Signals als durch Verwendung von Annexin V detektiert. Interessanterweise wurden Nekrosen durch beide Sensoren nahezu gleichzeitig nachgewiesen. Das deutet darauf hin, dass Annexin V bei Nekrosen und Sekundärnekrosen (Verlust der Membranintegrität einer bereits apoptotischen Zelle) in die Zelle diffundiert und intrazellulär PS bindet, was es für die genaue Charakterisierung des Effektor-induzierten Zelltodes ungeeignet macht.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde mit der Generierung antigenspezifischer CD8+ T-Zellklone ein wertvolles Werkzeug in der AG Hoth etabliert, das die Analyse der CD8+ T-Zell-vermittelten Zytotoxizität in vitro in einem physiologischen Kontext, wie z. B. der Melanom-Kokultur, ermöglicht. Mit Hilfe des etablierten Kokultur-Modells kann die Charakterisierung der Resistenzmechanismen von Tumorzellen, die vor allen Dingen bei Immuntherapien von Krebspatienten eine Rolle spielen, untersucht werden. Außerdem kann ein besseres Verständnis der CD8+-NK-Zell-Interdependenz langfristig eine Optimierung von zellbasierten Immuntherapien zur Folge haben. Zudem ermöglicht der Vergleich verschiedener Zelltod-Sensoren eine verbesserte Analyse zytotoxischer Mechanismen und trägt so zu einem besseren Verständnis der Funktion von zytotoxischen Immunzellen bei.Natural killer (NK) cells as well as CD8+ T cells (CTL) act as cytotoxic effector cells and perform complementary roles in immune responses against pathogens and malignant cells. NK cells belong to the innate immunity and express germ-line encoded activating and inhibitory receptors. CTL on the other hand are part of the adaptive immune system and recognize their targets by antigen-specific interactions of their T cell receptors (TCR) with MHCI-peptide-complexes presented by target cells.
In this thesis, antigen-specific CD8+ T cell clones were generated for the first time in our laboratory to allow antigen-specific interactions between CD8+ T cells with their cognate target antigen in vitro. Generation of melanoma specific CD8+ T cell clones (CTLMART1 and CTLgp100) gave us the opportunity to analyze combined CTL- and NK-mediated cytotoxicity against human melanoma cells (SK-Mel5). To this end, a melanoma-coculture-model has been established. Firstly, SK-Mel5 cells were coincubated together with NK cells or CTLMART1, respectively. Surviving melanoma cells served as target cells and were challenged again by adding NK cells or CTLMART1 as effector cells in a cytotoxicity assay (real-time killing assay). An increase of the NK:SK Mel5-ratio in coculture correlated with a reduced NK-mediated cytotoxicity and thus an NK cell resistance of surviving melanoma cells. Simultaneously, MHC class I (MHCI), a ligand for inhibitory NK receptors, was upregulated by NK-cocultured SK-Mel5 cells. In contrast, CTLMART1-mediated cytotoxicity against melanoma cells was unaffected by NK-coincubation. Surprisingly, addition of CTLMART1 in SK-Mel5 coculture induced a resistance of surviving SK-Mel5 cells against NK- as well as CTLMART1-mediated cytotoxicity. A CTLMART1-coculture caused an upregulation of MHCI molecules in parallel to a decrease of MART1 expression. Exogenous administration of corresponding MART1-peptide in a rescue-experiment restored CTLMART1-mediated cytotoxicity against SK-Mel5 cells coincubated with CTLMART1 beforehand. Thus, downregulation of MART1-protein expression induces a reduced presentation of corresponding MART1-antigens via MHCI molecules at the plasma membrane (PM), thereby causing a reduction of CTLMART1-mediated cytotoxicity against CTLMART1-cocultured SK-Mel5 cells.
CTL and NK cells are activated by different receptors but kill their target cells using the same basic mechanisms: perforin-mediated killing via secretion of lytic granules as well as binding of specific death receptors. Thereby different modes of cell death can be induced: apoptosis, which preserves PM integrity, and necrosis, which is indicated by disruption of the PM. In this thesis two different apoptosis sensors, pCasper3-GR and Annexin V, were tested in imaging based techniques to characterize effector cell-mediated cell death. The FRET-based pCasper3-GR sensor indicates activation of effector caspase 3 via color change from orange to green fluorescence emission. Fluorophore-labeled Annexin V on the other hand senses extracellular translocated phosphatidyl serines (PS) at the PM. In all experiments, pCasper signal analysis revealed apoptotic cell death before Annexin V signal analysis. Interestingly, analysis of both sensors revealed necrotic cell death almost simultaneously, indicating a diffusion of Annexin V into the cell, which causes an intracellular PS-binding. Thus, Annexin V seems to be an inappropriate marker for characterization of effector-induced cell death.
By generating antigen-specific CD8+ T cell clones, a valuable tool has been established in our laboratory to study CTL-mediated cytotoxicity in vitro in a more physiological context. Using this tool, a melanoma-coculture-model could be established, which allows the characterization of resistance mechanisms used by tumor cells, having an impact on immune cell based tumor therapies of cancer patients. Furthermore, a better understanding of CTL-NK-cell interdependence could give rise to optimization strategies of immune therapies. Moreover, a comparison of different cell death markers facilitates an optimized analysis of cytotoxtic mechanisms and thereby contributes to a better understanding of cytotoxic immune cell function
Einfluss der R-CHOP Therapie auf die Verteilung und die Funktion von Immunzellen bei Patienten mit aggressivem Non-Hodgkin-Lymphom
Full text linkDas häufig auftretende diffus großzellige B-Zell-Lymphom (DLBCL) wird als Standardtherapie mit einer Kombination aus Chemotherapie und dem zusätzlichen Einsatz des therapeutischen anti-CD20 Antikörpers Rituximab behandelt. Trotzdem kommt es bei ca. 30-50 % der Patienten zur Bildung eines Rezidivs oder die Patienten werden refraktär. Daher stellt eine bessere prognostische Beurteilung der Patienten einen wichtigen Schritt in der Entwicklung einer individualisierten Therapie bei Non Hodgkin Lymphomen dar.
Innerhalb dieser Arbeit wurden jeweils 27 ml EDTA-Blut (3 x 9 ml) von insgesamt 33 DLBCL Patienten zu unterschiedlichen Zeitpunkten (Diagnosestellung, Verlauf der Therapie und Nachsorge) analysiert, um einen Überblick über quantitative und qualitative Veränderungen der im Blut zirkulierenden Immunzellen zu erhalten. Als Referenzpunkt diente das Blut, das zum Zeitpunkt der „Diagnosestellung“ abgenommen wurde, das zudem mit Blut immunologisch gesunder Spender verglichen wurde. Im weiteren Therapieverlauf, wenn klinisch möglich, wurde das Blut jedes Patienten jeweils vor Rituximab-Gabe zu allen 6 8 Zyklen R CHOP untersucht. Nach Therapie folgte eine Blutabnahme alle drei Monate zum Nachsorgetermin, sodass der erste in diese Studie eingegangene Patient bereits über einen Zeitraum von drei Jahren untersucht wurde. Aus allen Blutproben wurden PBMC (periphere mononukleäre Zellen) aufgereinigt und durchflusszytometrisch untersucht. Folgende Subpopulationen wurden durch die Verwendung unterschiedlicher Antikörper und einer entsprechenden Gatingstrategie identifiziert: Leukozyten (Singlets, CD45+), Granulozyten (FSC A/SSC-A), Lymphozyten (CD45+/CD14-) und Monozyten (CD45+/CD14+). Die Lymphozytenpopulation wurde dann weiter unterteilt in T-Zellen (CD3+, mögliche Auftrennung in CD4+/CD8+), B-Zellen (CD19+) und NK Zellen (CD56+, CD3-, CD19-). Da die Bindung des CD20 Antikörpers Rituximab über den Fcγ-Rezeptor CD16 vermittelt wird, wurden die NK Zellen, T Zellen und Monozyten zusätzlich hinsichtlich ihrer CD16 Expression analysiert. Zudem wird die CD56 Expression in T-Zellen und Monozyten mit Tumorerkrankungen assoziiert, sodass diese Zellpopulationen auch auf ihre CD56-Expression hin untersucht wurden. Zum Zeitpunkt der Diagnosestellung ergaben sich für den prozentualen Anteil der NK und B Zellen (gemessen an den CD45+ Leukozyten) keine Unterschiede im Vergleich zu gesunden Spendern. Der Anteil an Granulozyten und T-Zellen war überraschenderweise verringert und der Anteil an Monozyten erhöht. Hier war insbesondere auch der Anteil der CD16+ Monozyten im Vergleich zu gesunden Spendern erhöht und korrelierte negativ mit der Prognose der Patienten. Zudem zeigte sich ein zusätzlicher Anstieg der CD16+ Monozyten über den Therapieverlauf. Funktional wurde in dieser Studie das Tötungsverhalten von NK und T-Zellen im Populationskillingassay untersucht. Als Zielzelllinien wurden MHC I-defiziente K562-Zellen (natürliche Zytotoxizität) und die CD20+ DLBCL-Zelllinie U-2932 verwendet. Das Killing der U 2932 wurde über Rituximab vermittelt, wobei der Fc-Teil an CD16+ NK bzw. T Zellen bindet, um eine Antikörper-abhängige zellvermittelte Zytotoxizität (ADCC) zu induzieren. Hierbei zeigte sich keine veränderte Zytotoxizität der NK Zellen sowohl im Therapieverlauf als auch im Vergleich zu gesunden Kontrollspendern. Das T-Zellkilling war hingegen sowohl Rituximab spezifisch gegen U 2932 als auch gegen K562 Zellen zum Zeitpunkt der Diagnosestellung im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant erhöht. Die für diese Zytotoxizität verantwortlichen Zellen sind wahrscheinlich unkonventionelle T-Zellen, wie NKT-Zellen oder T-Zellen. Diese Zellen lysieren ihre Zielzelllinien Antigen-unspezifisch und werden mit wichtigen Funktionen bei der Tumorimmunität in Zusammenhang gebracht. Die genaue Bestimmung der verantwortlichen Zellen ging über den Rahmen dieser Studie hinaus, wird aber innerhalb unserer Arbeitsgruppe weiter untersucht, da das Vorhandensein der Zellen im Blut bei DLBCL Patienten ein wichtiger immunologischer Parameter sein könnte.
Mit dieser Studie wurde die Aufreinigung, die durchflusszytometrische und funktionelle Analyse von Blutproben von DLBCL Patienten in unserem Labor grundlegend etabliert. Daraus haben sich Folgearbeiten, wie die genetische Untersuchung unterschiedlicher Polymorphismen, Zytokin- und Vitamin D-Spiegel Analysen im Plasma und die Bestimmung weiterer Oberflächenrezeptoren, z.B. mittels CyTOF, ergeben. Damit erhoffen wir uns weitere immunologisch relevante Unterschiede zu finden bzw. die in dieser Studie bereits gefundenen Unterschiede genauer zu charakterisieren, um eine diagnostische oder prognostische Relevanz bestimmen zu können.The standard therapy for the common diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) is a combination of chemotherapy (CHOP) with the additional use of the therapeutic anti CD20 antibody Rituximab. Nevertheless, approximately 30-50 % of patients develop a relapse or become refractory. Therefore, a better prognostic assessment of patients represents an important step in the development of individualized therapy for non-Hodgkin lymphoma.
Within this work, 27 ml EDTA blood (3 x 9 ml) each from a total of 33 DLBCL patients were analysed at different time points (diagnosis, course of therapy and follow-up) to obtain an overview of quantitative and qualitative changes of the immune cells circulating in the blood. The blood samples taken at the time of "diagnosis" served as the reference point and was compared with blood samples from healthy controls. In the further course, when clinically possible, the blood of each patient was analysed every 6-8 cycles of R-CHOP before rituximab administration. After therapy, blood sampling followed every three months at the follow-up appointment, so that the first patient included in this study had already been examined over a period of three years. PBMC (peripheral blood mononuclear cells) were purified from all blood samples and analysed by flow cytometry. The following subpopulations were identified by using different antibodies and an appropriate gating strategy: leukocytes (singlets, CD45+), granulocytes (FSC A/SSC-A), lymphocytes (CD45+/CD14-) and monocytes (CD45+/CD14+). The lymphocyte population was then further subdivided into T cells (CD3+, possible separation into CD4+/CD8+), B cells (CD19+) and NK cells (CD56+, CD3-, CD19-). Since the binding of the CD20 antibody rituximab is mediated by the Fcγ receptor CD16, the NK cells, T cells and monocytes were additionally analysed for their CD16 expression. In addition, CD56 expression in T cells and monocytes is associated with tumour disease, consequently these cell populations were also analysed for CD56 expression. At the time of diagnosis, there were no differences in the percentage of NK and B cells (measured by CD45+ leukocytes) compared with healthy donors. Surprisingly, the percentage of granulocytes and T cells was decreased and the percentage of monocytes was increased. In particular, the proportion of CD16+ monocytes was also increased compared to healthy controls and correlated negatively with the prognosis of the patients. Furthermore, an additional increase of CD16+ monocytes was shown over the course of therapy. Functionally, this study investigated the killing behaviour of NK and T cells in the population killing assay. MHC I-deficient K562 cells (natural cytotoxicity) and the CD20+ DLBCL cell line U-2932 were used as target cell lines. Killing of U 2932 was mediated via rituximab, with the Fc portion binding to CD16+ NK or T cells to induce antibody-dependent cell mediated cytotoxicity (ADCC). Here, there was no altered cytotoxicity of NK cells both during the course of therapy and compared to healthy controls. In contrast, T cell killing was significantly increased, both rituximab-specific against U-2932 and against K562 cells at the time of diagnosis compared to the control group. These cells lyse their target cell lines in an antigen-unspecific manner and are associated with important functions in tumour immunity. The exact determination of the responsible cells was outside the frame of this study, but will be further investigated within our group, as the presence of these cells in the blood might be an important immunological parameter in DLBCL patients.
This study fundamentally established the purification, flow cytometric and functional analysis of blood samples from DLBCL patients in our laboratory. This has resulted in follow-up work, such as the genetic investigation of different polymorphisms, cytokine and vitamin D level analyses in plasma, and the determination of additional surface receptors, e.g., by CyTOF. Thus, we hope to find further immunologically relevant differences or rather to characterize the differences already found in this study more precisely in order to be able to determine a diagnostic or prognostic relevance.DFG; SFB89
Synthesis, endogenous detection, and mitochondrial function of the hydroxy-substituted Coenzyme Q10 derivative HO-Q10
Full text linkQuinones are redox-active molecules playing important roles in all organisms. In humans, the para-benzoquinone derivative Coenzyme Q10 (CoQ10) carrying a chain of 10 isoprene units and two neighbouring methoxy groups at the benzoquinone ring is found ubiquitously. It is an essential electron and proton transporter in the mitochondrial respiratory chain and fulfils various important functions like regulating redox homeostasis and membrane viscosity. In 2011, Bogeski et al. chemically modified the functional head group of CoQ10 exchanging one methoxy group by a hydroxy group. The hydroxy analogue can also be produced by CYP450 present in mitochondria and endoplasmic reticulum and is a postulated intermediate in CoQ biosynthesis that had not been detected in eukaryotes.
The aim of this thesis was to gain first insights into the biological role of the mono-demethylated Coenzyme Q10. Therefore, within this study and my precedent master thesis, the CoQ10 derivative, HO-CoQ10, was synthesized and purified in sufficient amounts for the first time. Its structure could be verified using mass spectrometry and 1H/13C 2-dimensional nuclear magnetic resonance spectroscopy. The synthesis was confirmed to always produce a constitutional isomer mixture of HO-CoQ10 modified at the 2- or 3-position of the quinone ring. Due to the high lipophilicity mediated by the long isoprene chain, reliable transition to the aqueous phase was crucial for experiments. An ethanolic solution of 1 mM CoQ10 and 5 mM HO-CoQ10 was stable at room temperature and could be diluted in aqueous media. Hence, most experiments were conducted with 1% ethanol resulting in a maximal concentration of 10 μM CoQ10.
To understand the physiological importance of HO-CoQ10, its endogenous occurrence was clarified using ultra-high-pressure liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry. In isopropanol extracts from crude bovine heart mitochondria, HO-CoQ10 was detected for the first time and estimated to have a concentration of 100 μM in mitochondrial membranes. Evaluating toxicity of exogenously applied HO-CoQ10, no effect on cancer cell lines cultivated under standard cell culture conditions was found: No interference with metabolic activity and proliferation was observed in HeLa, MelJuso and Jurkat T cells using the CellTiter-Blue® reduction assay and apoptosis was not induced in Jurkat T cells analysing caspase activity using Caper-GR sensor.
Detecting HO-CoQ10 in mitochondria and considering the essential role of CoQ10 in the electron transport chain, its influence on respiration was evaluated measuring oxygen consumption of isolated cardiac mitochondria from BL6N mice using a Clark-type electrode. HO-CoQ10 inhibited Complex I-, II-, and III-linked respiration. Surprisingly, also the native substance CoQ10 intervened with Complex I- and II-linked respiration, but to a lower extent than HO-CoQ10. Extramitochondrial calcium enhanced inhibition via CoQ10 and HO-CoQ10 by the same factor. Since respiration buffers contained inorganic phosphate affecting free metal concentrations, free calcium was defined using the fluorescent calcium indicator fura-2. Photometric activity assays of respiratory chain enzymes from bovine heart mitochondria showed that HO-CoQ10 but not CoQ10 inhibited both oxidoreductase activity of Complex I and II. Decyl-ubiquinol:cytochrome c oxidoreductase (Complex III) was unaffected. In-gel activity staining of Complex I and II did not show interference on oxidase activities indicating that HO-CoQ10 acts on Q-binding sites of the complexes. Since CoQ10 is an important antioxidant in vivo but also shows prooxidant activity under distinct circumstances depending on its redox state, H2O2 production in the supernatant of coupled mouse heart mitochondria was examined using an HRP-based assay with Amplex® UltraRed. HO-CoQ10 increased Complex I- and II-linked ROS (reactive oxygen species) formation rate. CI-linked rates were similar for HO-CoQ10 and the ubiquinone- binding site inhibitor rotenone. In contrast, production rates induced by the Qi-site inhibitor of Complex III, antimycin A, were considerably higher suggesting a distinct mechanism of ROS formation. Glycerol dehydrogenase-linked H2O2 production was increased by antimycin A and slightly reduced by HO-CoQ10. To assess the correlation of respiration and ROS production, oxygen consumption and superoxide production were detected simultaneously by electron spin resonance spectroscopy with the oxygen sensor trityl and the spin probe for superoxide CMH. Similar to rotenone, CM• formation rate was not influenced by HO-CoQ10. Electron distribution in Complex I-associated iron-sulphur clusters of NADH-energized bovine heart mitochondria, visualised with low-temperature electron spin resonance spectroscopy, was not altered by HO- CoQ10.
This work provides the first insight into the biological significance of the neglected hydroxy analogue of CoQ10. Focussing on mitochondrial respiration, the most studied and biologically important role of Coenzyme Q, it was found that both CoQ10 and HO-CoQ10 inhibit respiration. Enrichment of the substances was shown to decrease membrane fluidity in other studies, which might be the underlying mechanism diminishing electron transfer efficiency. Calcium potentiating the inhibition by both substances supports the observation that HO-CoQ10 as well as CoQ10 are able to bind calcium. Due to its lower redox potential, HO-CoQ10 has been predicted to be a more potent antioxidant with a potential to substitute CoQ10 in the medication of ROS related diseases. However, it was found to inhibit activity of respiratory chain complexes and stimulated ROS production most likely via blocking Q-binding sites. Downregulation of respiration and stimulation of ROS production by HO-CoQ10, found in small portions in metabolic active heart tissue, suggests a role in regulation of energy metabolism and might act as an internal brake for growth when synthesis is upregulated.Synthese, endogene Detektion und mitochondriale Funktion des hydroxy-substituierten
Coenzym Q10-Derivats HO-CoQ10: Chinone sind redoxaktive Moleküle, die in allen Organismen wichtige Aufgaben erfüllen. Im Menschen ist das para-Benzochinon-Derivat Coenzym Q10 (CoQ10) ubiquitär vorhanden. Am Chinonring trägt es zwei benachbarte Methoxygruppen und eine Seitekette aus zehn Isopren-Einheiten. CoQ10 ist ein essentieller Elektronen- und Protonentransporter der mitochondrialen Atmungskette und an anderen wichtigen Funktionen wie der Regulation der Redoxhomoöstase und Membranviskosität beteiligt. 2011 haben Bogeski et al. seine funktionelle Kopfgruppe chemisch modifiziert, indem sie eine der Methoxygruppen durch eine Hydroxygruppe substituiert haben. Das Hydroxy-Analogon kann auch durch CYP450-Enzyme, welche in Mitochondrien und endoplasmatischem Retikulum exprimiert sind, produziert werden und ist eine postulierte biosysnthetische Vorstufe von Coenzyme Q, die jedoch in Eukaryoten bisher nicht nachgewiesen werden konnte.
In der vorliegenden Arbeit wurde erstmals die biologische Funktion von mono-demethyliertem Coenzym Q10 untersucht. Hierzu wurde das Coenzym Q10-Derivat, HO-CoQ10, im Rahmen dieser Doktorarbeit und der vorangehenden Masterarbeit synthetisiert und in ausreichender Menge aufgereinigt. Die Struktur wurde mittels 1H/13C 2-dimensionaler Kernspinresonanzspektroskopie verifiziert. Das Produkt besteht aus einer Mischung an Konstitutionsisomeren, welche die Hydroxygruppe an Position 2 oder 3 des Chinonrings tragen. Aufgrund der langen Isoprenkette handelt es sich um stark liphophile Substanzen, deren Übergang ins Wässrige für die folgenden Untersuchungen essentiell war. 1 mM CoQ10 und 5 mM HO-CoQ10 in ethanolischer Lösung waren bei Raumtemperatur stabil und konnten in wässrigen Medien verdünnt werden. Deshalb wurden die meisten Experimente mit 1 % Ethanol und einer maximalen CoQ10 Konzentration von 10 μM durchgeführt.
Um die physiologische Bedeutung von HO-CoQ10 zu erfassen, wurde sein endogenes Vorkommen mittels Ultra-Hochdruckflüssigkeitschromatographie-gekoppelter Massenspektrometrie aufgeklärt. In Isopropanol- Extrakten aus unaufbereitetetn Rinderherzmitochondrien wurde HO-CoQ10 erstmals nachgewiesen und seine Konzentration in der Mitochondrienmembran auf 100 μM geschätzt. Die Toxizität von exogen appliziertem HO-CoQ10 auf unter Standard-Zellkulturbedingungen kultivierten Krebszelllinien wurde untersucht: Die metabolische Aktivität und Proliferation von HeLa, MelJuso und Jurkat T-Zellen, bestimmt mit Hilfe des CellTiter-Blue®-Reduktionsassays, war unbeeinträchtigt. Zudem konnte in Jurkat T-Zellen bei Analyse der Caspase-Aktivität mittels des Casper-GR-Sensors keine Apoptoseinduktion beobachtet werden.
Da HO-CoQ10 in Mitochondrien detektiert wurde und CoQ10 eine essentielle Rolle in der Elektronentransportkette einnimmt, wurde der Einfluss auf die Respiration untersucht. Hierfür wurde der Sauerstoffverbrauch isolierter Herzmitochondrien aus BL6N-Mäusen mit Hilfe einer Clark-Elektrode gemessen. HO-CoQ10 inhibierte Complex I-, II- und III-assoziierte Atmung. Erstaunlicherweise inhibierte auch die native Substanz CoQ10 die Complex I- und II-assoziierte Respiration; dies jedoch in einem geringeren Ausmaß als HO-CoQ10. Extramitochondriales Calcium steigerte die durch CoQ10 und HO-CoQ10 vermittelte Inhibition gleichermaßen. Die Puffer für Atmungsmessungen enthalten anorganisches Phosphat, welches sich auf die Konzentration an freien Metallionen auswirkt. Deswegen musste die freie Calicumkonzentration mittels des fluoreszenten Calciumindikators Fura-2 festgelegt und -gestellt werden. Photometrische Aktivitätsbestimmungen der Atmungskettenenzyme aus Rinderherzmitochondrien zeigten, dass HO-CoQ10, jedoch nicht CoQ10 Complex I- und Complex II-Oxidoreduktase-Aktivität inhibiert. Decyl-ubichinol:Cytochrom c oxidoreduktase (Complex III) war unbeeinträchtigt. In-Gel-Aktivitätsfärbungen stellten heraus, dass HO- CoQ10 keinen Einfluss auf die Oxidase-Aktivität von Complex I und Complex II hat. Dies deutet darauf hin, dass HO-CoQ10 auf die Q-Bindestellen wirkt. Da CoQ10 ein in-vivo wichtiges Antioxidans ist, das unter bestimmten Umständen abhängig vom Redoxzustand prooxidativ wirkt, wurde die H2O2-Produktion im Überstand gekoppelter Mausherzmitochondrien mit Hilfe eines HRP-basierten Assays mit Amplex® UltraRed untersucht. HO-CoQ10 erhöhte die Complex I- und Complex II-assoziierte Produktionsrate an reaktiven Sauerstoffspezies (ROS). CI-assoziierte Raten mit HO-CoQ10 waren vergleichbar mit Raten in Anwesenheit des Ubichinon- Bindestellen-Inhibitors Rotenon. Im Gegensatz dazu zeigten Experimente mit dem Qi-Bindestellen-Inhibitor von Complex III, Antimycin A, deutlich höhere Produktionsraten und weisen damit auf einen anderen Mechanismus der ROS-Produktion hin. Glyceroldehydrogenase-assoziierte H2O2-Produktion war durch Antimycin A erhöht und durch HO-CoQ10 leicht reduziert. Um den Zusammenhang von Respiration und ROS- Produktion zu untersuchen, wurden Sauerstoffverbrauch und Superoxidproduktion simultan mitttels Elektronenspinresonsanzspektroskopie mit dem Sauerstoffsensor Trityl und der Superoxid-Spinsonde CMH gemessen. Vergleichbar mit Rotenon wurde die CM•-Bildungsrate auch von HO-CoQ10 nicht beeinflusst. Die Elektronenverteilung in Eisen-Schwefel-Clustern von Complex I in NADH-energetisierten Rinderherzmitochondrien wurde mittels Tieftemperatur-Elektronenspinresonanzspektroskopie visualisiert und war nicht durch HO-CoQ10 verändert.
Die vorliegende Arbeit gibt erste Hinweise auf die biologische Bedeutung des wenig beachteten Hydroxy-Analogons von CoQ10. Es konnte gezeigt werden, dass sowohl CoQ10 als auch HO-CoQ10 die mitochondriale Atmung inhibieren. Da andere Studien zeigten, dass die Anreicherung der Substanzen die Fluidität der Membran reduziert, könnte dies der zugrunde liegende Mechanismus für eine Abnahme der Elektronentransfereffizienz sein. Die Potenzierung der Inhibition durch Calcium unterstützt die Beobachtung, dass HO-CoQ10 und CoQ10 die Fähigkeit besitzen Calcium zu binden. Aufgrund des niedrigeren Redoxpotentials wurde prognostiziert, dass HO-CoQ10 ein effektiveres Antioxidans ist und das Potential besitzt, CoQ10 in der medizinischen Behandlung von ROS-korrelierten Krankheiten zu ersetzen. Allerdings zeigte sich, dass HO-CoQ10, höchstwahrscheinlich durch die Blockade von Q-Bindestellen, Atmungskettenkomplexe hemmt und ROS-Produktion stimuliert. Herunterregulation der Respiration und Stimulation von ROS-Produktion durch HO-CoQ10, das in stoffwechselaktivem Herzgewebe in kleinen Mengen gefunden wurde, weist auf Beteiligung in der Regulation von Energiestoffwechsel hin und könnte bei Hochregulation der Synthese als interne Wachstumsbremse agieren
Sex-Dependent Impact of Cytokines on Cytotoxic Lymphocyte Function during Aging
Full text linkCytotoxic T lymphocytes and natural killer cells are effector immune cells which are affiliated with the adaptive and innate immune system, respectively. Their primary tasks are the identification and active elimination of their target cells, including infected or degenerated cells, through different killing pathways. One of these killing pathways is driven by the secretion of effector molecules perforins and granzymes that are stored in lytic granules within the immune cells, inducing cell death. Both cytotoxic T lymphocytes and natural killer cell activity can be induced by supplementation with the cytokine interleukin-2, which then creates a positive feedback loop to further enhance activation. Interleukin-2 signaling begins at the interleukin-2 receptor, consisting of the three subunits CD25, CD122, and CD132, which then activate different downstream pathways, controlling differentiation, proliferation, and survival of the immune cells. Two other fundamental properties influencing the immune response of effector immune cells are age and sex/gender, which impact the abundance and functionality of effector cells, resulting in different susceptibilities to diseases. However, little is known about the sex- and age- differences in interleukin-2 regulation in both mouse and human; therefore, this study aims to investigate the differences in activation, exhaustion, effector molecule expression and secretion in cytotoxic T lymphocytes and natural killer cells of mice and human across age and sex.
Cytotoxic T lymphocytes and natural killer cells were isolated from mouse and human donors of varies ages and both sexes, stimulated accordingly with interleukin-2, and analyzed regarding cytotoxicity using a real time killing assay, expression of surface markers and effector molecules using flow cytometry. Lastly, the secretion of effector molecules and cytokines was quantified using the LegendPlexTM system.
Analysis of murine cytotoxic T lymphocytes from both sexes revealed that while there was no difference in interleukin-2 response in the adult mice, the elderly mice showed a strong sex- specific interleukin-2-mediated decline cytotoxicity in the male mice that was absent in the females. In general, adult mice cytotoxic T lymphocytes were more susceptible to fluctuations in interleukin-2 concentration compared to their elderly counterparts. Only the neutralization of autocrine interleukin-2 inhibited cytotoxicity in all tested cohorts except elderly female mice. These differences are due to enhanced activation as well as expression and secretion of effector molecules but are independent of viability, subtype distribution, and proliferation.
In murine spleen natural killer cells, no general interleukin-2-dependence was observed. However, in all but one cohort, cytotoxicity peaked at 500U IL-2, suggesting that this is an ideal interleukin-2 concentration for natural killer cell stimulation. Both the subtype distribution and the expression of activating natural killer cell receptors showed tendencies depending on the interleukin-2 concentration, with an increasing abundance in mature natural killer cells with decreasing interleukin-2 concentrations. In contrast to cytotoxic T lymphocytes, a sex-specific differences were not found in the elderly but rather in adult mice, where the females exhibited significantly higher cytotoxicity compared to their male counterparts.
Murine blood natural killer cells, though more abundant percentagewise, showed almost no cytotoxic activity. This was generally contradicting the higher abundance of mature natural killer cells but in accordance with the higher expression of inhibitory receptors. Notably, elderly female mice’s blood natural killer cells exhibited lower cytotoxicity due to lower expression of activating receptors.
In natural killer cells healthy human donors, interleukin-2 significantly influenced almost all analyzed parameters, such as cytotoxicity, the expression of activating receptors and exhaustion markers, as well as the expression and secretion of effector molecules, which significantly increased under interleukin-2 supplementation. However, only few sex-specific differences were observed as cytotoxicity tended to be higher in women after interleukin-2 treatment most likely due to a higher expression of activating receptors.
This study functionally characterized cytotoxic T lymphocytes and natural killer cells in the context of interleukin-2 dependence across age and sex. It reveals species-, tissue-, age- and sex-specific differences in interleukin-2 response, indicating diverging regulatory mechanisms of the immune system in mouse and human.Zytotoxische T-Lymphozyten und natürliche Killerzellen sind Effektorzellen des Immunsystems, welche jeweils zum erworbenen und angeborenen Immunsystem gehören. Ihre primären Aufgaben liegen in der Identifikation und aktive Eliminierung ihrer Zielzellen, welche infizierte aber auch entartete Zellen beinhalten, durch verschiedene zytotoxische Signalwege. Einer dieser Signalwege nutzt die Sekretion von Effektormolekülen wie Perforin und Granzymen, welche in den Zellen in Form von lytischen Granula gelagert werden, um den Tod der Zielzelle zu induzieren. Sowohl T-Zellen als auch natürliche Killerzellen können durch die Gabe des Zytokins Interleukin-2 aktiviert werden, welches eine positiven Rückkopplungsschleife auslösen kann, um die Aktivierung zu verstärken. Der IL-2 Signalweg beginnt bei dem Interleukin-2 Rezeptor, bestehend aus den drei Untereinheiten CD25, CD122 und CD132, über den anschließend verschiedene nachgeschaltete Signalwege aktiviert werden, welche unter anderem die Differenzierung, Proliferation und das Überleben der Immunzellen kontrollieren. Zwei weitere fundamentale Eigenschaften, welche die Immunantwort beeinflussen sind das Alter und das Geschlecht (englisch sex und gender), die unter anderem Einfluss auf die Verteilung und Funktionalität dieser Effektorzellen haben, wodurch es zu verschiedenen Prädispositionen in Bezug auf Erkrankungen kommt. Jedoch ist nur sehr wenig zu der Interleukin-2 Regulation dieser Alters- und Geschlechtsbedingter Unterschiede bekannt, weder in der Maus noch im Menschen. Daher soll im Rahmen dieser Arbeit die Aktivierung, Erschöpfung, sowie die Expression und Sekretion von Effektormolekülen in humanen und murinen T-Zellen und natürliche Killerzellen in Abhängigkeit vom Alter und Geschlecht untersucht werden.
Die T-Zellen und natürliche Killerzellen wurden dafür zunächst aus der Maus oder menschlichen Spendern unterschiedlichen Alters und Geschlechts isoliert, mit Interleukin-2 stimuliert und anschließend in Bezug auf Zytotoxizität mittels Echtzeit Zytotoxizitätsassays, sowie der Expression von Oberflächenmarkern und Effektormolekülen mittels Durchflusszytometrie analysiert. Zuletzt wurde die Sekretion der Effektormoleküle und anderer Zytokine mit Hilfe des LegendPlexTM Systems quantifiziert.
Die Analyse muriner T-Zellen aus beiden Geschlechtern zeigte, dass es keine geschlechtsbedingten Unterschiede bei den adulten Mäusen gab, allerdings gab es in den älteren männlichen Mäusen einen starken Interleukin-2-abhängigen Abfall in der Zytotoxizität, welcher bei den weiblichen Mäusen nicht feststellbar war. Grundsätzlich waren die T-Zellen aus den adulten Mäusen bedeutend anfälliger für Schwankungen in der Interleukin-2 Konzentration im Vergleich zu den älteren. Jedoch, lediglich die Neutralisation von autokrinem Interleukin-2 erreichte eine vollständige Inhibition der Zytotoxizität in allen getesteten Kohorten außer den gealterten Weibchen. Dieser Unterschied ist auf eine erhöhte Aktivierung, sowie Expression und Sekretion von Effektormolekülen zurückzuführen, ist allerdings unabhängig von Viabilität, Subtypenverteilung und Proliferation.
In murinen natürliche Killerzellen konnte hingegen keine generelle Interleukin-2-Abhängigkeit beobachtet werden. Jedoch zeigte sich in allen Kohorten außer einer, dass die Zytotoxizität bei einer Interleukin-2 Konzentration von 500U am höchsten ist, was darauf hindeutet, dass es sich hierbei um eine ideale Interleukin-2 Konzentration zur Stimulation von natürliche Killerzellen handeln könnte. Sowohl die Subtypenverteilung als auch die Expression der aktivierenden natürliche Killerzell-Rezeptoren zeigte Interleukin-2-abbhängige Tendenzen mit steigendem Vorkommen reifer natürliche Killerzellen mit fallenden Interleukin-2 Konzentrationen. Im Gegensatz zu T-Zellen konnte kein geschlechtsspezifischer Unterschied in den älteren Mäusen gefunden werden, sondern in den adulten Mäusen, bei denen erneut die Zellen aus den Weibchen eine erhöhte Zytotoxizität zeigten.
Murine natürliche Killerzellen aus dem Blut, obwohl sie einen höheren prozentualen Anteil haben, zeigten fast keine zytotoxische Aktivität. Dies steht in Widerspruch zu dem erhöhten Vorkommen reifer natürliche Killerzellen, entspricht allerdings der erhöhten Expression inhibitorischer natürliche Killerzell-Rezeptoren.
In natürliche Killerzellen aus gesunden menschlichen Probanden hatte die Gabe von Interleukin-2 einen signifikanten Einfluss auf alle untersuchten Parameter, unter anderem auf die Zytotoxizität, die Expression aktivierender Rezeptoren und Erschöpfungsmarker, sowie der Expression und Sekretion von Effektormolekülen, welche alle unter Interleukin-2 Gabe zunahmen. Allerdings zeigten sich hier fast keine geschlechts-spezifischen Veränderung, wobei eine leichte Tendenz zur erhöhten Zytotoxizität nach Interleukin-2 Gabe in Frauen zu finden war, vermutlich aufgrund der erhöhten Expression aktivierender natürliche Killerzell- Rezeptoren.
In dieser Studie wurden zytotoxische T-Lymphozyten und natürliche Killerzellen auf ihre Interleukin-2 Abhängigkeit im Kontext des Alterns und des Geschlechts funktionell charakterisiert. Dabei konnten Spezies-, Gewebe-, Alters- und Geschlechtsspezifische Unterschiede in der Interleukin-2 Antwort festgestellt werden, welche auf Divergenzen in den zugrundeliegenden regulatorischen Mechanismen des Immunsystems von Maus und Mensch hindeuten
Voltametric and Electron Spin Resonance Studies of Cyclic Hydroxylamine CMH and Its Application to Monitor Transient Radicals in Dioxygenase Enzymes
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