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7.13-Biosynthesis of heme and vitamin B<sub>12</sub>
No full textThe biosyntheses of the modified tetrapyrroles heme and adenosylcobalamin are outlined. The two compounds are made via a branched biosynthetic pathway that forks at the first macrocyclic intermediate uroporphyrinogen III. For heme synthesis, modification of the peripheral acetate and propionate side chains, oxidation, and ferrochelation yields heme. In contrast, an extensive program of peripheral methylation, cobalt insertion, side chain amidation, ring contraction, decarboxylation, and the attachment of upper and lower axial ligands for the cobalt ion are required for cobalamin synthesis. This review outlines the individual steps in molecular detail and reflects on the range of different chemistries and enzymes that are involved in making these two essential metalloprosthetic groups
Untersuchung der Naturstoffproduktion in S. ghanaensis ATCC 14672: Deletion des Gens moeO5
No full textThe last steps of the alternative heme biosynthesis in Archaea: Characterization of the proteins AhbA, AhbB, AhbC and the Radical SAM enzyme AhbD from Methanosarcina barkeri
No full textDas zyklische Tetrapyrrol Häm ist für nahezu alle Lebewesen essentiell. In Eukaryoten wird Häm über einen Syntheseweg generiert, der seit längerem charakterisiert ist. In Sulfat-reduzierenden Bakterien sowie allen Häm produzierenden Archaea wurde ein alternativer Häm-Biosyntheseweg entdeckt. Dieser führt über die Intermediate Precorrin-2, Sirohydrochlorin, Sirohäm (SH), 12,18-Didecarboxysirohäm (DDSH) und Fe Coproporphyrin III (Fe-Copro III). In dieser Arbeit wurden die alternativen Häm-Biosyntheseproteine AhbAB, AhbC und AhbD aus dem methanogenen Archeon Methanosarcina barkeri funktionell charakterisiert. Durch in-vivo-Enzymtests konnte gezeigt werden, dass AhbA und AhbB (Mbar_A1459 und Mbar_A1460) SH zu DDSH umsetzen. AhbAB liegt als heterodimerer Komplex vor, der das Endprodukt Häm bindet und könnte daher an einem regulatorischen feedback-Inhibitionsmechanismus beteiligt sein. Ebenfalls wurde in vivo gezeigt, dass AhbC (Mbar_A1793) Fe-Copro III generiert. Rekombinant produziertes AhbD (Mbar_1458) aus M. barkeri wurde erfolgreich gereinigt und bindet zwei [4Fe 4S]-Cluster. Eine Umsetzung von Fe-Copro III zu Häm durch AhbD wurde in in vitro-Enzymtests erfolgreich nachgewiesen. Da es zu den Radical SAM (RS) Enzymen gehört, startet seine Katalyse durch Spaltung von S Adenosylmethionin (SAM) an einem der beiden [4Fe 4S]-Cluster zu einem 5‘-Deoxyadenosyl-Radikal. Durch Generierung von AhbD-Varianten, bei denen entweder die N-terminale bzw. die C-terminale Clusterbindung aufgehoben wurde, konnte durch SAM-Spaltungstests das N terminale Cluster in Anwesenheit von Fe-Copro III als RS-Cluster identifiziert werden. Das zusätzliche C terminale Cluster des AhbD konnte durch ESR- und CV-Messungen ebenfalls als redoxaktives Cluster identifiziert werden, was eine Rolle dieses Clusters für den Elektronentransfer bei einem späteren Reaktionsschritt wahrscheinlich macht. Substratbindungstests sowie Enzymtests mit Substratanaloga zeigten, dass keines der Cluster für die Substratbindung essentiell ist, jedoch das zentrale Metallatom des Substrates für die vollständige Bildung des Produkts von Bedeutung ist. Weiterhin wurde das AhbD-Homolog aus Metallosphaera sedula (Msed_0512) erfolgreich gereinigt und kristallisiert, wobei erste hexagonale kristalline Strukturen beobachtet wurden.The cyclic tetrapyrrole heme is essential for almost all living organisms. In eukaryotes heme is synthesized via a well-characterized pathway. An alternative pathway was found to be operative in sulfate-reducing bacteria and all heme-producing Archaea. In this pathway the intermediates precorrin-2, sirohydrochlorin, siroheme (SH), 12,18-didecarboxysiroheme (DDSH) and iron-coproporphyrin III (Fe-copro III) are formed, which are not part of the classical heme biosynthesis route. In this work, the alternative heme biosynthesis proteins from the methanogenic archeon Methanosarcina barkeri AhbAB, AhbC and AhbD were functionally characterized. In vivo enzyme assays showed, that AhbA and AhbB (Mbar_A1459 and Mbar_A1460) convert SH into DDSH. AhbAB form a heterodimeric complex, which is able to bind the end-product heme. Thus, a role for AhbAB in a regulatory feedback mechanism might be possible. Further, AhbC (Mbar_A1793) was shown to catalyze the conversion of DDSH into Fe copro III in vivo. Recombinantly produced AhbD (Mbar_1458) from M. barkeri was purified indicating the binding of two [4Fe 4S] clusters. The conversion of Fe-copro III into heme by the action of AhbD was confirmed by in vitro enzyme assays. AhbD belongs to the Radical SAM (RS) enzymes and its catalysis starts with the cleavage of S adenosylmethionine (SAM) into a 5‘ deoxyadenosyl radical at one of the [4Fe 4S] clusters. By generation of cluster variants, which are able to bind either the N terminal or the C-terminal cluster, the N-terminal cluster was identified as the only Radical cluster in AhbD using SAM cleavage assays with Fe copro III. The auxilliary C-terminal cluster was shown to be redox-active with EPR and CV measurements. Since it is also essential for the enzyme’s overall activity these measurements indicated a role for the cluster in electron transfer. Studies for substrate binding and enzyme assays using substrate analogs showed, that the cluster is not essential for substrate binding. The central metal ion of the substrate is important for a complete conversion of substrate. Additionally, the homolog of AhbD from Metallosphaera sedula (Msed_0512) was also purified and crystallized. First crystal-like hexagonal structures were obtained for the first time
Biosynthesis of the isobacteriochlorine heme d1: Characterisation of the proteins NirJ and NirDLGH from Pseudomonas aeruginosa
No full textIn der vorliegenden Arbeit wurde erfolgreich NirJ aus Hydrogenobacter thermophilus als Eisen-Schwefel-Protein charakterisiert. Anschließend wurde mittels Eisen- und Schwefelbestimmungen gezeigt, dass ein [4Fe-4S]2+ -Zentrum pro NirJ vorliegt. UV/Vis-spektroskopische Untersuchungen unterstützten diesen Befund.
Des Weiteren wurden in dieser Arbeit die Proteine NirDLGH aus P. aeruginosa charakterisiert. Es konnte gezeigt werden, dass die Einzelproteine NirD, NirL, NirG und NirH als Homodimere vorliegen. Interessanterweise konnte ebenfalls das Auftreten von heterodimeren Proteinkomplexen NirD/L bzw. NirG/H gezeigt werden. Ein tetramerer Komplex wurde nicht beobachtet.
Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde mittels Primer-Extension-Analyse gezeigt, dass sich im nir-Operon von P. aeruginosa -42 bp upstream von nirJ ein Transkriptionsstartpunkt befindet. Dies deutet auf das Vorhandensein eines separaten nirJEN-Transkripts hin. Durch lacZ-Reportergenfusionen konnte gezeigt werden, dass die Aktivität des neu entdeckten nirJ-Promotors unter anaeroben Wachstumsbedingungen und in Gegenwart von Nitrat im Vergleich zu aeroben Bedingungen um das Dreifache induziert wird. Die Induktion erfolgt dabei durch die Proteine NirDLGH. Des Weiteren konnte durch Gelretardationsexperimente eine Bindestelle für die Proteine NirDLGH ca. -85 bp upstream von nirJ identifziert werden. Dabei wurden die Einzelproteine NirL und NirH bzw. die Proteinkomplexe NirD/L und NirG/H als DNA-bindende Proteine identifiziert. Diese Tatsache konnte mittels initialer DNaseI-Protektionsanalysen verifiziert werden.
Somit konnte gezeigt werden, dass es sich bei den Proteinen NirDLGH aus P. aeruginosa um Transkriptionsfaktoren handelt. Es sei erwähnt, dass eine zusätzliche enzymatische Funktion der Proteine durchaus denkbar wäre.
Das Protein NirDL aus H. thermophilus wurde erfolgreich kristallisiert. Ein Datensatz mit einer Auflösung von 3.2 A konnte aufgenommen werden.In this study it was possible to produce and purify recombinant NirJ from Hydrogenobacter thermophilus. Through iron and sulfur determination it was shown that this protein contains one [4Fe-4S]2+ cluster per molecule. This finding was substantiated by UV/Vis-spectroscopy. Yet, it was not possible to assign any enzymatic function to NirJ using an in vitro activity assay.
Further, the recombinant proteins NirD, NirL, NirG and NirH from P. aeruginosa were produced and purified to homogeneity revealing heterodimeric protein complexes between NirD/L and between NirG/H. The individual proteins NirD, NirL, NirG and NirH were shown to be homodimeric.
Using primer extension analysis a so far unrecognized transcription start site located 42 bp upstream of the P. aeruginosa nirJ gene was identified, indicating the presence of a separate nirJEN transcript. Using lacZ-reporter gene fusions it was shown that the expression of lacZ, which was placed under the control of the nirJ promoter, was increased by 3-fold under anaerobic growth conditions in the presence of nitrate relative to the level observed under aerobic growth conditions. P. aeruginosa NirDLGH were required for the anaerobic induction of the nirJ promoter. DNA retardation assays and DNaseI footprinting proved that NirL, NirH, NirD/L and NirG/H bind to DNA in a region approx. 85 bp upstream of nirJ.
Thus, the role of NirDLGH as transcription regulators in P. aeruginosa could be shown. It should be mentioned that an enzymatic function of those proteins as discussed in Chapter 3 might be feasible as well.
The H. thermophilus protein NirDL was crystallized. It was possible to record a data set with a resolution of up to 3.2 A. The structure is being solved at the Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung in Braunschweig in cooperation with Dr. Stefan Schmelz
Investigation of the maturation of cytochrome cd1 nitrite reductase NirS from Pseudomonas aeruginosa PAO1
No full textDie Cytochrom cd1 Nitritreduktase NirS aus P. aeruginosa ist ein gut charakterisiertes Protein. Trotz der bekannten Eigenschaften ist wenig über die Biosynthese und nichts über den Einbau des essenziellen Kofaktors Häm d1 in die NirS bekannt. Diese Arbeit diente dazu, neue Erkenntnisse über die Rolle der Proteine NirF und NirN zu gewinnen.
Zunächst wurden NirF und NirN aus P. aeruginosa in silico analysiert. Nachdem festgestellt wurde, dass NirF eine Lipoprotein-Signalsequenz besitzt, wurde die Assoziation des Proteins an der inneren Membran von P. aeruginosa durch isopyknische Saccharose-Gradientenzentrifugation und Western-Blot-Analysen bewiesen
In dieser Arbeit konnte erstmals eine Häm d1-freie NirS in E. coli produziert und gereinigt werden. Das hochreine Protein konnte zur Erzeugung von spezifischen Antikörpern eingesetzt werden, die in Western-Blot-Analysen, Immunopräzipitationen und Immunoaffinitätsreinigungen zum Einsatz kamen.
NirN konnte gereinigt werden und spezifische Antikörper gegen NirN erzeugt werden. Diese Antikörper wurden ebenfalls in verschiedenen Experimenten erfolgreich eingesetzt.
In einer Reihe von Interaktionsexperimenten zwischen NirN und NirS konnte erstmals ein Komplex zwischen den Proteinen NirS und NirN nachgewiesen werden. Weiterhin zeigten diese Experimente und zusätzliche Pull-down-Analysen von NirF, dass dieses Protein ebenfalls an der Interaktion von NirN und NirS beteiligt ist und selbst mit diesen Proteinen interagiert.
Abschließend wurde eine nirN-Deletionsmutante von P. aeruginosa daraufhin untersucht, ob NirN an der Häm d1-Biosynthese beteiligt sein kann. Dabei gab es erstmals Hinweise darauf, dass NirN am letzten Schritt der Häm d1-Biosynthese oder der Kofaktorinsertion in NirS beteiligt sein könnte.
Die Ergebnisse dieser Arbeit trugen wesentlich zum besseren Verständnis der im Periplasma von P. aeruginosa ablaufenden Prozesse zur Nitritreduktase-Maturation bei. Zudem konnte ein neues NirS-Maturationsmodell postuliert werden.NirS, the cytochrome cd1 nitrite reductase of P. aeruginosa is a well characterized enzyme catalyzing the reduction of nitrite to nitric oxide. Despite its known structure and biochemical properties, less is known about the biogenesis of this protein. The biosynthesis and insertion of the heme d1-cofactor are poorly understood processes. The main objective of this work was to gain more insights into the roles of the proteins involved in the last step of heme d1-biosynthesis and cofactor-insertion into NirS.
A first analysis of the protein NirF from P. aeruginosa in silico revealed a potential lipoprotein signal of NirF responsible for the attachment of the protein to the periplasmic face of the inner membrane. This was proven by isopycnic sucrose gradient centrifugation and western-blot-analysis.
Furthermore, a heme d1-free version of NirS was produced in E. coli for the first time, purified and used for generation of antibodies, which were used in western-blot-analysis, immunoprecipitations and immuno affinitychromato-graphy.
The protein NirN was purified and used for generating specific monoclonal and polyclonal antibodies. These antibodies were successfully used in several experiments.
Interaction studies using co-immunoprecipitation and immunoaffinity chromatography revealed an interaction between NirS and NirN after in vivo protein-cross-linking. Furthermore, this interaction was dependent on the presence and interaction of NirF with the NirS-NirN-complex, which was shown in pull down-analysis and immunoaffinity chromatography.
After analyzing the periplasmic fraction of a nirN-deletion strain of P. aeruginosa, new insights into the involvement of NirN in the heme d1-biosynthesis were gained.
The results of this work led to a better understanding of the NirS maturation system and indicated the involvement of NirN and NirF in the last step of heme d1-biosynthesis and cofactor-insertion into NirS. All results are combined in a new model for the NirS maturation
Structural and functional characterization of the siroheme decarboxylases NirDLGH from Pseudomonas aeruginosa and NirDL from Hydrogenobacter thermophilus
No full textUnter anaeroben Bedingungen gewinnen Pseudomonas aeruginosa und Hydrogenobacter thermophilus Energie durch die Reduktion von Nitrat zu Stickstoff während der Denitrifikation. Im zweiten Schritt der Denitrifikation reduziert die Cytochrom-cd1-Nitritreduktase (NirS) Nitrit zu Stickstoffmonoxid. Die NirS enthält zwei Kofaktoren Häm c und Häm d1. Die Enzyme, die an der Häm d1-Biosynthese beteiligt sind, sind durch das Genecluster nirSMCFDLGHJEN kodiert.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Sirohäm-Decarboxylasen NirDLGH (P.a.) und NirDL (H.th.) charakterisiert.
Dabei konnte gezeigt werden, dass die Proteine NirL und NirH als Repressor bzw. Aktivator für die nirJEN-Gene fungieren, wobei die alleinige Überproduktion von NirL oder NirH keinen Einfluss auf die Promotoraktivität hat.
Die enzymatische Aktivität von NirDLGH (P.a.) konnte ebenfalls nachgewiesen werden. Dabei wird das Substrat Sirohäm (SH) über das Intermediat Monodecarboxy-Sirohäm (MDSH) zu 12,18-Didecarboxy-Sirohäm (DDSH) umgesetzt. Zusätzlich wurde gezeigt, dass NirDL in vitro SH als Substrat nutzt und MDSH entsteht. NirGH kann SH nicht als Substrat verwerten sondern nutzt MDSH und setzt es zu DDSH um.
Zusätzlich wurde die Struktur des NirDLGH-Homologons NirDL (H.th.) ohne und mit dem künstlichen Substrat Eisen-Uroporphyrin III (FeUroIII) geklärt. Dabei zeigte sich, dass das Protein ein Helix-Turn-Helix-Motiv beinhaltet, das für Transkriptionsregulatoren typisch ist. Zusätzlich dazu enthält NirDL eine Substratbindedomäne, die durch die Bindung des Substratanalogons deutlich sichtbar war. Ähnlich wie NirDLGH (P.a.) ist NirDL (H.th.) ebenfalls in der Lage SH zu DDSH umzusetzen.
Durch den gezielten Austausch einzelner Aminosäuren und der Untersuchung der NirDL-Varianten konnte diesen Aminosäuren spezifische Aufgaben in der Enzymaktivität und Substratbindung zugeordnet werden. Die Aminosäure Histidin-261 ist für die Bindung und Koordinierung des Substrats im aktiven Zentrum zuständig, wohingegen das Histidin-93 direkt an der Decarboxylierung des Substrats beteiligt ist.
Ausgehend von den Ergebnissen der NirDL-Varianten wurde ein potentieller Reaktionsmechanismus nach dem Vorbild der Uroporphyrinogen III-Decarboxylase postuliert.
Zusammenfassend kann gesagt werden, dass NirDLGH (P.a.) und NirDL (H.th.) an der Häm d1 Biosynthese beteiligt sind. Während NirDL (H.th.) Strukturelemente eines Transkriptionsregulators aufweist, konnte die regulatorische Aktivität für NirDLGH (P.a.) nachgewiesen werden.Pseudomonas aeruginosa and Hydrogenobacter thermophilus generates energy under anaerobic growth conditions through the stepwise reduction of nitrate to molecular nitrogen during denitrification. In the second step of denitrification nitrite is converted into nitric oxide by the cytochrome cd1 nitrite reductase (NirS). NirS contains two essential cofactors, heme c and heme d1. The enzymes which are involved in the synthesis of the isobacteriochlorin heme d1 are encoded by the nirSMCFDLGHJEN gene cluster. During this work the siroheme decarboxylases NirDLGH (P.a.) and NirDL (H.th.) were functionally and structurally characterized.
This work showed that the proteins NirL and NirH seem to act as a repressor and activator for the nirJEN-genes, nevertheless an overproduction of these proteins had no influence on the regulator activity.
Additionally, the enzymatic activity of NirDLGH (P.a.) was shown. The substrate siroheme (SH) is converted to 12, 18-didecarboxy-siroheme (DDSH) via the intermediate monodecarboxy-siroheme (MDSH). The product DDSH is formed only in the presence of all four proteins NirDLGH. The heterodimeric complex NirDL uses SH as a substrate and catalyzes the conversion of SH to MDSH. NirGH is not able to utilize SH as a substrate. However, MDSH can be used as substrate and is converted into DDSH.
The crystal structure of the homologous NirDL protein (H.th.) was solved as an apo protein and in complex with the substrate analogue iron-uroporphyrin III (FeUroIII). The protein illustrated a helix-turn-helix-motif, which is characteristic for a transcription regulator. Based on the co-complex structure of NirDL and the substrate analogue the putative active site was identified. Similarly to the activity of NirDLGH (P.a.), NirDL (H.th.) was able to convert SH into DDSH. By employing specific amino acid exchange, specific functions for different amino acids were assigned. For instance, the amino acid histidine-261 is involved in the coordination and binding of the substrate and the histidine-93 is directly responsible for the decarboxylation of the acetate site chains. A putative reaction mechanism based on the results of the NirDL variants was proposed. All in all it has been shown that NirDLGH (P.a.) and NirDL (H.th.) are involved in the heme d1 biosynthesis and NirDLGH (P.a.) acts as a transcriptional regulator
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