1,721,054 research outputs found
Perfil de citocinas, linfócitos T e níveis de óxido nítrico em cães imunizados com as vacinas LBSap e LBSapSal e submetidos ao desafio experimental com Leishmania (Leishmania) chagasi e saliva de Lutzomyia longipalpis.
No full textOs cães representam o reservatório doméstico mais importante de L. chagasi (sin. L. infantum), e uma vacina contra leishmaniose viscer al canina (LVC) pode ser uma importante ferramenta para o controle da leishmanio se visceral humana (LV). Além disso, para a obtenção de uma vacina efetiva, é fundamental o entendimento de eventos relacionados à imunogenicidade após a vacinação e desafio co m o agente etiológico para que seja definida a resposta imune associada à proteção contra a infecção por Leishmania. Assim, neste trabalho foi verificada a imunogenicidade e proteção conferida pela vacinação de cães contra LVC com os imunobiológicos LBSap e LBSapSal. Desta forma, trinta e cinco cães sem raça definida foram distribuídos em sete grupos experimentais, entre os quais: (i) grupo controle C (n = 5) que recebeu 1 mL de salina estéril a 0,9%; (ii) grupo LB (n = 5) que recebeu 600 μg de proteína de Leishmania braziliensis em 1 mL de salina estéril a 0,9%; (iii) grupo Sap (n = 5) que recebeu 1 mg de saponina em 1 mL de salina estéril a 0,9%; (iv) grupo LBSap (n = 5) que recebeu 600 μg de proteína de L. braziliensis associado a 1 mg de saponina em 1 mL de salina estéril a 0,9%; (v) grupo Sal (n = 5) que recebeu extrato de glândula salivar de Lutzomyia longipalpis (SGE) equivalente ao conteúdo de 5 ácinos da glândula salivar em 1 mL de salina estéril a 0,9%; (vi) grupo LBSal (n = 5) que recebeu 600 μg de promastigotas de L. braziliensis associado ao SGE em 1 mL de salina estéril a 0,9%; (vii) grupo LBSapSal (n = 5) que recebeu 600 μg de promastigotas de L. braziliensis associado a 1 mg de saponina e ao SGE em 1 mL de salina estéril a 0,9%. Cada animal recebeu três aplicações subcutâneas no flanco esquerdo em intervalos de quatro semanas. Posteriormente, os cães foram infectados por via intradérmica com 1x10 7 promastigotas de Leishmania (Leishmania) chagasi na presença de saliva de L. longipalpis, sendo avaliados 90 e 885 dias pós desafio. Os níveis de óxido nítrico (NO) e citocinas (IL-4, IL-10, TGF-, TNF-, IL-12, IFN-) foram avaliados em sobrenadantes de cultura de células mononucleares do sangue periférico (CMSP) após estímulo com antígeno solúvel vacinal (VSA) ou antígeno solúvel de L. chagasi (SLcA). O grupo LBSap apresentou altos níveis de IL-4 (T3 e T90dpd), IL-10 (885dpd) e baixos níveis de TGF- (885dpd) após estímulo com antígenos de Leishmania. Além disso, o grupo LBSapSal apresentou baixos níveis de IL-4 (90dpd) e TGF- (90 e 885dpd) após estímulo com antígeno de Leishmania. Adicionalment e, altos níveis de IL-12 foram observados nos grupos LBSap e LBSapSal (T3, 90dpd e 885dpd). Da mesma forma, aumento dos níveis de IFN- foram observados nos grupos LBSap (T3, 90dpd e 885dpd) e LBSapSal (T3, 90dpd e 885dpd). O perfil de citocinas sugere que as vacinas LBSap e LBSapSal podem conferir imunidade protetora contra a infecção por Leishmania. Os resultados obtidos a partir da análise dos níveis de NO confirmaram a hipótese de que as estas vacinas induzem um perfil de resistência contra a infecção por Leishmania. Os principais resultados do presente estudo apontam para uma forte imunogenicidade induzida pela vacinação de cães com LBSap e LBSapSal e submetidos ao desafio experimental com L. chagasi, indicando uma ação destes imunobiológicos compatível com controle do parasito em cães. Novos estudos de avaliação da carga parasitária em medula óssea através da PCR em tempo real podem fornecer importantes informações para um melhor entendimento da eficácia das vacinas LBSap e LBSapSal.Dogs represent the most important domestic reservoirs of L. chagasi (syn. L. infantum), and a vaccine against canine visceral leishmaniasis (CVL) would be an important tool in the control of human visceral leishmaniasis (VL) by decreasing dramatically the infect ion pressure of L. chagasi/L. infantum. Moreover, to obtain a successful vaccine, the understanding of immunogenicity mechanisms involved after vaccination and challenge is crucial to define the protective responses associated against Leishmania infection. Thus, in this work it was investigated the immunogenicity and protective effect of LBSap and LBSapSal vaccination in dogs. In this sense, thirty five mongrel dogs were treated within seven experimental groups as follow: (i) control group C (n = 5) received 1 mL of sterile 0.9% saline; (ii) LB group (n = 5) received 600 µg of Leishmania braziliensis promastigote protein in 1 mL sterile 0.9% saline; (iii) Sap group (n = 5) received 1 mg of saponin in 1 mL sterile 0.9% saline; (iv) LBSap group (n = 5) received 600 µg of L. braziliensis promastigote protein and 1 mg of saponin in 1 mL sterile 0.9% saline; (v) Sal group (n = 5) received sand fly gland extract (SGE) prepared from 5 acini of salivary glands of Lutzomyia longipalpis in 1 mL sterile 0.9% saline; (vi) LBSal group (n = 5) received 600 µg of L. braziliensis promastigote protein plus SGE in 1 mL sterile 0.9% saline; and (vii) the LBSapSal group (n = 5) received 600 µg of L. braziliensis promastigote protein plus 1 mg of saponin together with SGE in 1 mL sterile 0.9% saline. Each animal received three subcutaneous injections in the right flank at intervals of 4 weeks. Afterwards, the dogs were intradermally infected with 1×10 7 late-log-phase promastigotes of Leishmania (Leishmania) chagasi in the presence of sand fly saliva of L. longipalpis and follow-up at 90 and 885 days post challenge (dpc). Nitric oxide (NO) levels (determined as nitrite) and cytokines (IL-4, IL-10, TGF-, TNF-, IL-12, IFN-) were evaluated in culture supernatants of peripheral blood mononuclear cells (PBMC) stimulated by vaccine soluble antigen (VSA) or soluble Leishmania chagasi antigen (SLcA). LBSap group displayed higher levels of IL-4 (T3 and 90dpi), IL-10 (885dpi) and lower levels of TGF- (885dpi) following Leishmania stimulation. Moreover, LBSapSal group presented lower levels of IL-4 (90dpi) and TGF- (90 and 885dpi) after Leishmania stimulation. In addition, higher levels of IL-12 were observed in LBSap and LBSapSal groups (T3, 90 and 885dpi). Likewise, increased levels of IFN- were related to LBSap (T3, 90 and 885dpi) and LBSapSal (T3, 90 and 885dpi) groups. The cytokines profile suggest that LBSap and LBSapSal vaccine have potential protective immunity against Leishmania infection. The results obtained from the analysis of NO levels confirmed the hypothesis that these vaccines induce a potential resistance profile against Leishmania infection. In conclusion, the major findings in the present study point to a strong immunogenicity elicited when dogs were vaccinated with LBSap or LBSapSal and submitted to experimental challenge indicating a compatible action of this immunobiological with the effective control of the parasitism in dogs. Further studies on bone marrow parasitism using real time PCR may provide important information that will lead to a better understanding on LBSap and LBSapSal efficacies
Análise da imunogenicidade e eficácia empregando-se as vacinas LBSap, Leishmune®, Leish-Tec® em uma plataforma de testes in vivo.
No full textPrograma de Pós-Graduação em Biotecnologia. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto.É consenso que a estratégia mais racional para o controle da leishmaniose visceral, que tem como agente etiológico a Leishmania chagasi (sinonímia L. infantum), seria o emprego de uma vacina que proteja o cão impedindo o seu papel de reservatório doméstico do parasito. Assim, considerando o camundongo como modelo experimental amplamente utilizado em ensaios pré-clínicos vacinais anti-Leishmania, é de extrema importância analisar, neste modelo, candidatos vacinais de forma pareada e simultânea. Neste sentido, este projeto avaliou um ensaio pré-clínico vacinal, para análise comparativa de aspectos relacionados a imunogenicidade e eficácia dos candidatos vacinais contra leishmaniose visceral, entre os quais: Leish-Tec® (LT), Leishmune® (LM) e vacina LBSap (composta de antígeno bruto de L. braziliensis e saponina). Dessa forma, camundongos BALB/c foram imunizados com três doses de cada vacina e, após trinta dias da última dose vacinal, os animais foram desafiados experimentalmente com promastigotas de L. chagasi. Trinta dias após o desafio, os animais foram submetidos a eutanásia. Nos tempos antes da 1° dose vacinal (T0), 14 dias após a 3° dose (T1) e antes da eutanásia (T2), amostras de sangue foram coletadas do plexo orbital para realização do leucograma e avaliação do perfil imunofenotípico, ex vivo, de leucócitos circulantes. O baço e o fígado foram coletados no tempo T2 para avaliação da carga parasitária pela técnica de PCR em tempo real. Os resultados obtidos indicam que todas as vacinas são incócuas e seguras para a administração. Dentre as principais alterações relacionadas ao estabelecimento de mecanismos imunoprotetores destaca-se o aumento dos níveis de células NK CD3-CD49b+ observado em T2 para os diferentes grupos vacinais (LT, LM, LBSap). Além disto, ao se avaliar a imunidade adaptativa, foi observado no grupo LT aumento de linfócitos T totais CD3+ em T2, que pode ser associado ao aumento da subpopulação de linfócitos T CD3+CD4+ no mesmo período. De forma interessante, a imunização com vacina LBSap induziu aumento da população de linfócitos T totais CD3+ tanto após o protocolo vacinal (T1) como após o desafio experimental (T2). Este aumento relatado no grupo LBSap parece ser reflexo da expansão da população de linfócitos T CD4+ nos mesmos tempos (T1 e T2). Semelhantemente, o grupo LM apresentou este mesmo perfil de reposta imune com aumento de linfócitos T CD4+ tanto em T1 como em T2. Este perfil imunofenotípico parece ter favorecido o controle do parasitismo tecidual tanto no baço como no fígado para as diferentes vacinas avaliadas. Neste contexto, foi observada redução da carga parasitária esplênica de 36% (LT), 63% (LM) e 42% (LBSap). Além disto, a análise da carga parasitária hepática revelou redução do parasitismo de 48% (LT), 71% (LM) e 62% (LBSap). Estes resultados parecem indicar o estabelecimento de mecanismos imunoprotetores pelos diferentes imunobiológicos avaliados, compatível com a redução da carga parasitária no baço e figado de camundongos imunizados com as vacinas LT, LM e LBSap. Buscando ampliar a identificação de biomarcadores associados a indução de imunoproteção, será realizada como perspectiva a dosagem de imunoglobulinas anti-Leishmania (IgG, IgG1, IgG2a e IgG2b), bem como a análise do perfil de citocinas.The most rational strategy to control visceral leishmaniasis, that presented Leishmania chagasi (syn. L. infantum) as etiological agent, would be the vaccine for protecting the dog and blocking the domestic parasite reservoir status. Thus, considering the experimental mouse model is widely used in anti-Leishmania vaccine pre-clinical trials, it is extremely important to analyze, in this model, vaccine candidates in a simultaneous approach. In this sense, a vaccine pre-clinical trial was performed, including analysis of immunogenicity and protection levels, in different groups, as follows: Leish-Tec®, Leishmune® and LBSap (composed by L. braziliensis antigens plus saponin). Thus, BALB/c mice were inoculated with three doses of each vaccine and challenged with L. chagasi. Thirty days post-challenge all animals were submitted to euthanasia. At the time points before the first dose (T0), after third dose (T1; 14 days after the last dose) and 30 days after L. chagasi challenge (T2) the blood was collected in order to evaluate the hemogram and ex vivo immunophenotyping in whole blood leukocytes. The spleen and liver were collected at T2 for analyzing parasite load quantified by real time PCR. Results displayed that all vaccines are safe and innocuous to the administration in mice. Among the major changes related to the establishment of imunoprotetor mechanisms NK cells (CD3-CD49b+) presented increased levels at T2 in the different vaccine groups (LT, LM, LBSap). Furthermore, the induction of adaptive immunity was observed in LT group showing higher CD3+ T-lymphocytes at T2, which can be associated with CD3+CD4+ T-subset at same time. Interestingly, LBSap immunizations induced higher CD3+ T-lymphocytes in both after vaccine protocol (T1) and experimental challenge (T2). This data would be associated in LBSap group to increased levels in the CD3+CD4+ T-subsets at the same time (T1 and T2). Similarly, LM group presented the same immune profile, displaying increased levels in CD3+CD4+ T-lymphocytes in both T1 and T2. This immunophenotypic profile seems to act in the spleen and liver parasitism control considering the different evaluated vaccines. In this context, the reduction in the spleen parasite load was 36% (LT), 63% (LM) and 42% (LBSap). Moreover, analysis in the liver parasite load demonstrated reduction of 48% (LT), 71% (LM) and 62% (LBSap). These results suggest the establishment of immunoprotection mechanisms in the different evaluated vaccines as related by control in the spleen and liver parasite burden considering LT, LM and LBSap immunized mice. Aiming to further analyze the additional biomarkers associated with immunoprotection, analyzes of anti-Leishmania immunoglobulins (IgG, IgG1, IgG2a and IgG2b) and the cytokine profile will be performed as perspective
Metodologia para ensaios de candidatos vacinais contra leishmaniose visceral canina pelo co-cultivo de linfócitos e macrófagos infectados com Leishmania chagasi.
No full textNos últimos 30 anos, a leishmaniose visceral (LV) tem avançado para áreas urbanas e periurbanas, apontando o cão como principal reservatório da L. chagasi (sin. L. infantum). Neste contexto, pesquisadores consideram como consenso que uma vacina contra a leishmaniose visceral canina (LVC) poderia ser uma importante ferramenta no controle tanto da leishmaniose humana como canina. Por esta razão, foi desenvolvido um novo método para avaliar o sistema imune de cães que poderia ser empregado como uma alternativa para se analisar imunogenicidade e níveis de proteção em candidatos vacinais contra a LVC. Para tanto, foram empregadas células mononucleares do sangue periférico CMSP de cães saudáveis para padronização de: (i) condições in vitro de cultivo de monócitos diferenciados em macrófagos de cães (MD-MC) infectados previamente com L. chagasi e avaliados após 3, 24, 48, 72 e 96h da infecção nos tempos de 2, 3, 4 e 5 dias de diferenciação do MD-MC (n=5 cães saudáveis); (ii) purificação de subpopulações de células T (CD4+ e CD8+) considerando a razão de linfócitos:macrófagos variando de 1:5 a 2:1 (n=12 cães saudáveis). Em todos os experimentos foram utilizados sobrenadante de cultura para analisar diferentes biomarcadores imunológicos, tais como: níveis de óxido nítrico, a produção de mieloperoxidase (MPO) e N-acetilglicosaminidase (NAG); citocinas do tipo 1 (IFN-, TNF-, IL-12), tipo 2 (IL-4) e imunomodulatórias (IL-10); e avaliada a frequência do parasitismo e carga parasitária em MD-MC infectados com L. chagasi. Os resultados revelaram que após 5 dias da diferenciação do MD-MC e 72h da infecção por L. chagasi foi observado um melhor perfil morfológico e da habilidade microbicida. Apesar dos níveis de NAG permanecerem praticamente inalterados, a análise do MPO revelou redução significativa no tempo de cinco dias de diferenciação dos MD-MC, indicando a baixa contaminação por granulócitos neste período. Os experimentos de co-cultivo empregando MD-MC e subpopulações de células T mostrou um perfil marcante nos biomarcadores imunológicos e na atividade microbicida, considerando a razão de linfócitos (CD4+ ou CD8+) : macrófagos de 1:2 e 1:1:1 de linfócitos (CD4+ e CD8+) : macrófagos. Assim, nestas condições do co-cultivo foi observado associação entre a produção de óxido nítrico e os níveis de citocinas do tipo 1, tipo 2 e imunomodulatórias com a manutenção de uma frequência de parasitismo intermediária e estabilização da carga parasitária em MD-MC infectados por L. chagasi. Os dados obtidos com a realização deste trabalho estimulam a continuidade dos estudos empregando esta metodologia de MD-MC co-cultivados com células T CD4+ e/ou CD8+ provenientes de CMSP de cães imunizados com candidatos vacinais contra LVC.In the last 30 years, visceral leishmaniasis (VL) has moved to urban and peri-urban areas, highlighting the dog as the main reservoir of the L. chagasi (syn. L. infantum). In this context, researchers to consider as a consensus that a vaccine against canine visceral leishmaniasis (CVL) would be an important tool in the control of both human and canine visceral leishmaniasis. For this reason, we developed a new method for accessing the immune system of dogs that would be employed as the alternative for analyzing of immunogenicity and protection rate induced by vaccine candidates against CVL. For this purpose, we employed peripheral blood mononuclear cells (PBMC) of healthy dogs for standardizing the: (i) in vitro conditions of canine monocyte-derived macrophages (CM-DM) cultivation previously infected by L. chagasi and evaluated 3, 24, 48, 72 and 96 hours post-infection at the times two, three, four and five days of CM-DM differentiation (n=3 healthy dogs); (ii) the purification of T-cells subsets (CD4+ and CD8+); (iii) L. chagasi infected CM-DM co-cultured with purified T-cells subsets (CD4+ and/or CD8+) evaluated at a lymphocytes:macrophage ratio ranging from 1:5 to 2:1 (n=12 healthy dogs). In all the experiments we analyzed in the culture supernatant different immunological biomarkers, such as: nitric oxide levels, myeloperoxidase (MPO) and N-acetylglucosaminidase (NAG) production; type 1 (IFN-, TNF-, IL-12), type 2 (IL-4) and immunomodulatory (IL-10) cytokines; and described the frequency of parasitism and parasite load in L. chagasi-infected CM-DM. Our major data revealed that after five days and at 72h post L. chagasi-infection CM-DM presented a better pattern of both morphology of the culture and microbicidal ability. Besides the levels of NAG remained practically unchanged, MPO displayed a significant reduction at five days of CM-DM differentiation, indicating lower counts of granulocytes at this period. The CM-DM co-culture experiments using purified T-cells subsets showed an outstanding profile in the immunological biomarkers and microbicidal activity considering the lymphocytes (CD4+ or CD8+) : macrophages ratio of 1:2 and 1:1:1 for lymphocytes (CD4+ and CD8+):macrophages. In this sense, these conditions in the rate of co-culture revealed an association between nitric oxide production and the levels of type 1, type 2 and immunomodulatory cytokines with the maintenance of intermediated frequency in the parasitism and the stabilization of parasite burden in the L. chagasi-infected CM-DM. Our data stimulates to further analyze this methodology in CM-DM co-cultured with purified CD4+ and/or CD8+ T-cells from PBMC of dogs immunized with vaccine candidates against CVL
Avaliação da produção da vacina LBSapSal contra Leishmaniose visceral canina, frente ao desafio intradérmico experimental com Leishmania chagasi e extrato de glândula salivar de Lutzomyia longipalpis.
No full textPrograma de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas. CIPHARMA, Escola de Farmácia, Universidade Federal de Ouro Preto.No Brasil, o controle da leishmaniose visceral (LV) tem sido baseado num “tripé” de ações que preconiza o tratamento de casos humanos, o combate ao vetor e a eliminação de cães soropositivos, que infelizmente não tem alcançado bons resultados na redução dos casos de LV humana e canina. Assim, a imunoprofilaxia surge como uma das alternativas mais importantes para o controle da LV. Considerando que até o momento ainda não existem vacinas que sejam comprovadamente protetoras, nosso grupo de pesquisa tem empregado esforços no desenvolvimento de protótipos vacinais contra leishmaniose visceral canina (LVC). Um destes protótipos é a vacina LBSapSal, composta por antígenos de Leishmania braziliensis associada ao extrato de glândula salivar de Lutzomyia longipalpis (SGE) e ao adjuvante saponina. Estudos prévios em cães vacinados com a vacina LBSapSal revelaram a indução de forte imunogenicidade, marcada pelo aumento de linfócitos T CD8+ circulantes, dos níveis de óxido nítrico séricos e por uma produção balanceada de isotipos de IgG (IgG1/IgG2) indicando uma resposta imune mista do tipo 1 e tipo 2. Tais resultados indicam que a vacina LBSapSal induz uma resposta imune protetora anti-LVC. Desta forma o presente trabalho tem como objetivo central avaliar a capacidade imunoprofilática da vacina LBSapSal através de estudos de proteção após o desafio experimental com promastigotas de Leishmania chagasi. Foram utilizados 20 cães, com idade de 210 dias, sem raça definida que foram subdivididos em quatro grupos experimentais com cinco animais cada um, entre os quais: (i), grupo CID, (ii) grupo Sal, (iii) grupo LBSal e (iv) grupo LBSapSal. Foram ministradas três aplicações vacinais subcutâneas em intervalos de 30 dias. Após 3 meses do último inóculo, os cães foram desafiados com 1x107 promastigotas de L. chagasi associadas ao conteúdo de cinco ácinos de glândula salivar de L. longipalpis por via intradérmica. Estes animais foram acompanhados por um período de 885 dias após o desafio, onde foi coletado material biológico para a realização de análise parasitológica da proteção vacinal. Coletas de tecidos de pele e baço foram realizadas para uma investigação da presença do parasito e da carga parasitária nestes órgãos. Nesta investigação foi realizado o isolamento do parasito pela técnica de esplenocultura utilizando o meio NNN/LIT e avaliação do parasitismo por meio de imunohistoquímica anti-Leishmania, análise de imprints de tecidos por microscopia óptica (Giemsa) e reação de PCR em Tempo Real (qPCR) nos tecidos. Dentre as metodologias parasitológicas, a qPCR apresentou alta sensibilidade para detectar L. chagasi na pele e no baço de cães que apresentam baixa carga parasitária. Os resultados de qPCR nos permitiu observar o aumento dos níveis de eficácia vacinal experimental, em relação ao grupo controle (CID) ao se incorporar antígeno de saliva (Sal) e saliva mais antígeno de Leishmania (LBSal). Adicionalmente, aumento dos níveis de proteção e eficácia foram obtidos pela incorporação do adjuvante saponina aos antígenos de saliva de flebotomíneo e de Leishmania (LBSapSal). Neste sentido, os resultados mostraram que a vacina LBSapSal conferiu 80% de proteção na pele, enquanto que todos os cães apresentaram parasitismo no baço. Nossos dados nos permite supor o potencial que a vacina LBSapSal tem em proteger a pele contra a infecção por L. chagasi Desta forma, nos animais imunizados com LBSapSal, a redução da frequência do parasitismo cutâneo poderia implicar na redução da transmissão de Leishmania para o inseto vetor, podendo contribuir no controle deste parasito.Brazil, control of visceral leishmaniasis (VL) has been based on a "tripod" of action that addresses the treatment of human cases, the vector control and elimination of seropositive dogs, which unfortunately hasn´t achieved good results in reducing cases of human and canine VL. Thus, immunoprophylaxis appears as one of the most important alternative for the control of VL. Considering that so far there are still no proven vaccines that are protective, our research group has used efforts in developing prototypes vaccine against canine visceral leishmaniasis (CVL). One of these prototypes is LBSapSal vaccine consisting of antigens of Leishmania braziliensis associated with salivary gland extract of Lutzomyia longipalpis (SGE) and the saponin adjuvant. Previous studies in dogs vaccinated with LBSapSal revealed the induction of strong immunogenicity, marked by increased levels of CD8 + T circulating cells, of serum nitric oxide and a balanced production of IgG isotypes (IgG1/IgG2), indicating a mixed immune response type 1 and type 2. These results indicate that the vaccine LBSapSal induces an immune response anti-LVC. Thus the present work is mainly aimed to assess the immunoprophylactic ability of the vaccine LBSapSal through studies of protection after experimental challenge with promastigotes of Leishmania chagasi. We used 20 mongrel dogs, aged 210 days, that were divided into four groups with five animals each, including: (i), group CID, (ii) Sal group, (iii) group LBSal and (iv) group LBSapSal. Three vaccine subcutaneous applications were given at intervals of 30 days. After three months of last inoculum, the animals were challenged, intradermally, with 1x107 promastigotes of L. chagasi associated with five lobes of the salivary gland of L. longipalpis. These animals were followed for a period of 885 days after the challenge, wich was collected biological material to perform parasitological analyses of vaccine protection. Samples of skin and spleen were performed to investigate the presence of a parasite and the parasite burden in this organs. In this investigation we performed the isolation of the parasite in spleen samples using NNN/LIT medium, and to evaluate the parasitism by immunohistochemical anti-Leishmania, analysis of tissues imprints by optical microscopy (Giemsa) and by PCR Real-Time (qPCR). Among the parasitological methods, the qPCR presented high sensitivity to detect L. chagasi in the skin and spleen of dogs presenting low parasite burden. The results allowed us to observe the increased levels in the experimental vaccine efficacy in comparission to the control group (CID) by incorporating saliva (Sal) and saliva more Leishmania antigen (LBSal). Additionally, increased levels of protection and efficacy were obtained by incorporation of saponin adjuvant to Leishmania an sand fly saliva antigens (LBSapSal). In this sense, the results shoed that the LBSapSal vaccine elicited 80% of protection in the skin, whereas all dogs presented parasitism in the spleen. Our data allows us hypothesize the potencial that LBSapSal vaccine has in protect the skin againts L. chagasi. Thus, in the animals immunized with LBSapSal the reduction of the frequency of parasitism in the skin could result in the reduction of Leishmania transmission to the insect vector, which may contribute to control this parasite
Avaliação da imunogenicidade de dois novos Imunobiológicos candidatos a vacina contra Leishmaniose visceral canina.
No full textConsiderando a importância de estratégias imunoprofiláticas para o controle da leishmaniose visceral, a inexistência de drogas capazes de curar cães infectados e o aumento de casos de resistência aos antimoniais pentavalentes, o presente trabalho buscou avaliar a imunogenicidade de dois novos imunobiológicos candidatos a vacina contra leishmaniose visceral canina (LVC). Observa-se uma lacuna em estudos que buscam avaliar a imunogenicidade pós-vacinal de imunobiológicos anti-LVC. Assim, o presente estudo propôs uma análise detalhada da imunogenicidade considerando diversos biomarcadores da resposta imune celular e humoral após as três doses das diferentes estratégias vacinais. Trinta e cinco cães sem raça definida foram subdivididos em sete grupos experimentais, entre os quais: (i) grupo controle C (n = 10) que recebeu 1 mL de salina estéril a 0,9%; (ii) grupo LB (n = 5) que recebeu 600 μg de proteína de Leishmania braziliensis em 1 mL de salina estéril a 0,9%; (iii) grupo Sap (n = 5) que recebeu 1 mg de saponina em 1 mL de salina estéril a 0,9%; (iv) grupo LBSap (n = 5) que recebeu 600 μg de proteína de L. braziliensis associado a 1 mg de saponina em 1 mL de salina estéril a 0,9%; (v) grupo Sal (n = 5) que recebeu extrato de glândula salivar de Lutzomyia longipalpis (SGE) equivalente ao conteúdo de 5 ácinos da glândula salivar em 1 mL de salina estéril a 0,9%; (vi) grupo LBSal (n = 5) que recebeu 600 μg de promastigotas de L. braziliensis associado ao SGE em 1 mL de salina estéril a 0,9%; (vii) grupo LBSapSal (n = 5) que recebeu 600 μg de promastigotas de L. braziliensis associado a 1 mg de saponina e ao SGE em 1 mL de salina estéril a 0,9%. Cada animal recebeu três aplicações subcutâneas no flanco esquerdo em intervalos de quatro semanas. Os resultados indicam que a saponina quando presente (Sap, LBSap, LBSapSal) induziu em alguns cães a formação de edema ou de pequeno nódulo local, sem apresentar lesões ulceradas ou outras alterações adversas. A avaliação da inocuidade e toxicidade das diferentes vacinas não revelou contra-indicações para utilização. A avaliação da resposta humoral revelou que os grupos LBSap e LBSapSal apresentaram aumento dos níveis de IgG total, IgG1 e IgG2 anti-Leishmania, sugerindo um perfil de resposta imune misto Th1/Th2. De forma semelhante, no grupo LBSapSal foi observado aumento dos níveis de IgG total, IgG1 e IgG2 anti-SGE, que tem sido previamente relacionado ao estabelecimento de uma resposta imune protetora anti- Leishmania. Além disto, experimentos utilizando Western blot para avaliar a reatividade de anticorpos caninos anti-proteínas do SGE evidenciaram o predomínio de proteínas com peso molecular de 35, 45 e 75 KDa, particularmente no grupo LBSapSal, sendo relacionado a um padrão de resistência contra infecção por Leishmania. A avaliação da resposta celular contou com o estudo imunofenotípico de células mononucleares do sangue periférico (PBMC) e revelou aumento do número de linfócitos B CD21+, linfócitos T CD5+ e das subpopulações T (CD4+ e T CD8+), indicando o estabelecimento de imunidade protetora contra infecção por Leishmania como previamente relatado na LVC. Além disto, foi observada pela análise in vitro redução do índice de proliferação utilizando VSA (vaccine soluble antigen) ou SLcA (soluble Leishmania chagasi antigen) nos grupos LB e Sal, enquanto os grupos LBSap e LBSapSal apresentaram aumento da atividade linfoproliferativa na presença de ambos os estímulos. De forma interessante, foi demonstrado no grupo Sal correlação negativa entre a atividade linfoproliferativa e linfócitos T CD4+ ou monócitos CD14+. Estes resultados permitem especular que a imunização realizada no grupo Sal poderia inibir a atividade de monócitos CD14+ em ativar linfócitos T CD4+ e assim reduzir a atividade linfoproliferativa. Por outro lado, PBMC cultivados in vitro com SLcA do grupo LBSap e com VSA ou SLcA no grupo LBSapSal apresentaram aumento da atividade XI linfoproliferativa acompanhada pela indução de linfócitos T CD8+ antígeno-específicos. Estes resultados sustentam a hipótese de que a vacinação com LBSap e LBSapSal estimularia o desenvolvimento de mecanismos imunoprotetores relacionados ao controle do parasitismo por Leishmania considerando a indução de linfócitos T CD8+ antígeno-específicos para proteínas relacionadas ao agente etiológico da LVC. A avaliação de potenciais células apresentadoras de antígenos (APC) revelou aumento do número de monócitos CD14+ circulantes nos grupos LBSap e LBSapSal. Além disto, altas contagens de APC foram associadas ao aumento da expressão de linfócitos MHC-I no grupo LBSap e de linfócitos CD80 e MHC-I no grupo LBSapSal, sugerindo que esta associação poderia representar a interação entre as respostas imunes inata e adaptativa, refletindo no aumento do perfil de ativação durante as imunizações. Os resultados obtidos pelas análises dos níveis de óxido nítrico (NO) pela avaliação dos níveis de nitrito no sobrenadante de cultura estimuladas com SLcA no grupo LBSap e no soro do grupo LBSapSal confirmam a hipótese de que estas vacinas induzem um perfil associado a resistência contra a infecção por Leishmania. Os resultados obtidos neste trabalho indicam que o potencial imunoprotetor induzido pelas vacinas LBSap e LBSapSal são compatíveis com o controle do agente etiológico da LVC.Considering the importance of immunoprophylactic strategies for the control of visceral leishmaniasis, and the lack of studies concerning the cellular and humoral events that occur during vaccination in dogs, we have attempted to evaluate the immune response of a promising new vaccines candidate against canine visceral leishmaniasis (CVL). Thirty five mongrel dogs were treated within seven experimental groups as follow: (i) control group C (n = 10) received 1 ml of sterile 0.9% saline; (ii) LB group (n = 5) received 600 μg of Leishmania braziliensis promastigote protein in 1 ml sterile 0.9% saline; (iii) Sap group (n = 5) received 1 mg of saponin in 1 ml sterile 0.9% saline; (iv) LBSap group (n = 5) received 600 μg of L. braziliensis promastigote protein and 1 mg of saponin in 1 ml sterile 0.9% saline; (v) Sal group (n = 5) received sand fly gland extract (SGE) prepared from 5 acini of salivary glands of Lutzomyia longipalpis in 1 mL sterile 0.9% saline; (vi) LBSal group (n = 5) received 600 μg of L. braziliensis promastigote protein plus SGE in 1 mL sterile 0.9% saline; and (vii) the LBSapSal group (n = 5) received 600 μg of L. braziliensis promastigote protein plus 1 mg of saponin together with SGE in 1 mL sterile 0.9% saline. Each animal received three subcutaneous injections in the right flank at intervals of 4 weeks. The results obtained indicate that some dogs exhibit local swelling or mild local induration reactions, but no ulcerated lesions or other adverse reactions, after receiving saponin as an adjuvant (Sap, LBSap or LBSapSal groups). The overall tolerance of the candidate vaccines in dogs appeared to be adequate. The evaluation of immunogenicity revealed that animals treated with LBSap and LBSapSal presented higher (P < 0.05) amounts of anti- Leishmania total IgG that were associated with increased (P < 0.05) levels of IgG1 and IgG2, suggesting a mixed Th1/Th2 immune response. Likewise, LBSapSal elicited the production of elevated levels of anti-SGE total IgG, IgG1 and IgG2, that was previously associated in establishing an anti-immune L. chagasi response in human. Additionally, anti-SGE Western blot experiments showed predominance in the recognition of seric proteins with molecular weights of 35, 45 and 71 kDa, particularly following LBSapSal vaccination, and were related to the resistance pattern against Leishmania infection. The immunophenotypic evaluation in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) reveal in the LBSap and LBSapSal increased (P < 0.05) counts of circulating CD21+ B-cells, CD5+ T-cells and CD4+ and CD8+ T-cell subset, suggesting protective immunity against Leishmania infection as has been suggested previously for CVL. Whilst lower stimulation index by either VSA (vaccine soluble antigen) or SLcA (soluble Leishmania chagasi antigen) were recorded for the LB and Sal groups, higher cell reactivities in the presence of both stumuli were related to LBSap and LBSapSal groups. Interestingly, a negative association was demonstrated between cell reactivity and CD4+ T-lymphocytes or CD14+ monocytes following in vitro stimulation in the Sal group. These data support the hypothesis that Sal treatment inhibits CD14+ monocytes in the promotion of CD4+ T-lymphocyte activation and the induction of cell proliferation. In contrast, when in vitro cultures of peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were stimulated with SLcA in the LBSap treatment and VSA or SLcA in the LBSapSal group, increased lymphoproliferation activity was accompanied by a higher frequency of antigen-specific CD8+ T-cells. These results support the hypothesis that induction of CD8+ T-cells may play a protective role in the mechanism of control of parasitism by Leishmania after LBSap and LBSapSal treatment associated with the antigen-specific immune response to antigens from the etiological agent of CVL. The evaluation of potential antigen presenting cells (APC) revealed increased numbers of circulating CD14+ monocytes in the LBSap and LBSapSal groups. Furthermore, the largest APC counts were associated XIII with the highest expression of MHC-I in lymphocytes in the LBSap and CD80 and MHC-I in lymphocytes in the LBSapSal, suggesting that this association could represent interaction between the innate and adaptive immune responses, reflecting an improvement in activation status during immunization. The results obtained from the analysis of nitric oxide (NO) levels (determined as nitrite) in culture supernatants stimulated by SLcA in the LBSap and in the serum of the LBSapSal confirmed the hypothesis that these vaccines induce a potential resistance profile against Leishmania infection. Our data suggested that the potential resistance profile elicited by LBSap and LBSapSal were compatible with effective control of the etiological agent of CVL
Targeting Leishmania infantum Mannosyl-oligosaccharide glucosidase with natural products : potential pH-dependent inhibition explored through computer-aided drug design
Full text linkVisceral Leishmaniasis (VL) is a serious public health issue, documented in more than ninety countries, where an estimated 500,000 new cases emerge each year. Regardless of novel methodologies, advancements, and experimental interventions, therapeutic limitations, and drug resistance are still challenging. For this reason, based on previous research, we screened natural products (NP) from Nuclei of Bioassays, Ecophysiology, and Biosynthesis of Natural Products Database (NuBBEDB), Mexican Compound Database of Natural Products (BIOFACQUIM), and Peruvian Natural Products Database (PeruNPDB) databases, in addition to structural analogs of Miglitol and Acarbose, which have been suggested as treatments for VL and have shown encouraging action against parasite’s N-glycan biosynthesis. Using computer-aided drug design (CADD) approaches, the potential inhibitory effect of these NP candidates was evaluated by inhibiting the Mannosyl-oligosaccharide Glucosidase Protein (MOGS) from Leishmania infantum, an enzyme essential for the protein glycosylation process, at various pH to mimic the parasite’s changing environment. Also, computational analysis was used to evaluate the Absorption, Distribution, Metabolism, Excretion, and Toxicity (ADMET) profile, while molecular dynamic simulations were used to gather information on the interactions between these ligands and the protein target. Our findings indicated that Ocotillone and Subsessiline have potential antileishmanial effects at pH 5 and 7, respectively, due to their high binding affinity to MOGS and interactions in the active center. Furthermore, these compounds were non-toxic and had the potential to be administered orally. This research indicates the promising anti-leishmanial activity of Ocotillone and Subsessiline, suggesting further validation through in vitro and in vivo experiments.Instituto de PatobiologíaFil: Goyzueta-Mamani, Luis Daniel. Universidad Católica de Santa María. Vicerrectorado de Investigación. Computational Biology and Chemistry Research Group; PerúFil: Barazorda-Ccahuana, Haruna Luz. Universidad Católica de Santa María. Vicerrectorado de Investigación. Computational Biology and Chemistry Research Group; PerúFil: Candia-Puma, Mayron Antonio. Universidad Católica de Santa María. Vicerrectorado de Investigación. Computational Biology and Chemistry Research Group; PerúFil: Candia-Puma, Mayron Antonio. Universidad Católica de Santa María. Facultad de Ciencias Farmacéuticas, Bioquímicas y Biotecnológicas; PerúFil: Galdino, Alexsandro Sobreira. Universidade Federal São João Del-Rei. Laboratório de Biotecnologia de Microrganismos; BrasilFil: Machado-de-Avila, Ricardo Andrez. Universidade do Extremo Sul Catarinense. Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde; BrasilFil: Giunchetti, Rodolfo Cordeiro. Universidade Federal de Minas Gerais. Instituto de Ciências Biológicas. Laboratório de Biologia das Interações Celulares; BrasilFil: Giunchetti, Rodolfo Cordeiro. Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de Doenças Tropicais (INCT-DT); BrasilFil: Medina-Franco, José L. Universidad Nacional Autónoma de México. School of Chemistry. Department of Pharmacy. DIFACQUIM Research Group; MéxicoFil: Florin-Christensen, Mónica. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Patobiología Veterinaria; ArgentinaFil: Florin-Christensen, Mónica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Ferraz Coelho, Eduardo Antonio. Universidade Federal de Minas Gerais. Faculdade de Medicina. Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde: Infectologia e Medicina Tropical; BrasilFil: Ferraz Coelho, Eduardo Antonio. Universidade Federal de Minas Gerais. Colégio Técnico da Universidade Federal de Minas Gerais (COLTEC). Departamento de Patologia Clínica; BrasilFil: Chavez Fumagalli, Miguel Angel. Universidad Católica de Santa María. Vicerrectorado de Investigación. Computational Biology and Chemistry Research Group; Per
Desorganização da polpa branca esplênica está associada com a apresentação clínica mais grave da leishmaniose visceral em cães naturalmente infectados
No full textUniversidade Federal da Bahia. Faculdade de Medicina da Bahia. Salvador, BA, Brasil / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, BA, BrasilO baço é o maior órgão linfoide secundário em seres humanos e em cães. Em
ambos, a ausência do baço está associada com um risco aumentado de
ocorrência de infecções localizadas e disseminadas, incluindo sepse
generalizada. A leishmaniose visceral e outras infecções podem alterar a
estrutura histológica do baço, o que leva a uma destruição dos microambientes
da polpa branca. Trabalhos anteriores mostraram que a ruptura da estrutura de
polpa branca é mais frequente em cães com marcadores laboratoriais de
suscetibilidade à leishmaniose visceral, como a cultura esplênica positiva e LST
negativo, do que nos animais em que estes marcadores de susceptibilidade
estavam ausentes. Neste estudo, o nosso objetivo é examinar a relação entre a
desorganização histológica da polpa branca esplênica e a gravidade da
leishmaniose visceral. As amostras e os dados utilizados neste estudo foram
coletados de 206 cães de rua provenientes de uma área endêmica para
leishmaniose visceral, a cidade de Jequié (Bahia, Brasil). Os animais foram
examinados clinicamente e foram realizados os testes ELISA e LST. Aspirados
de baço foram coletados para a cultura, e fragmentos de baço foram coletadas
para estudos de biologia molecular e de estudos morfológicos. Os animais foram
classificados de acordo com o grau de organização estrutural da polpa branca
esplênica em grupos com baço (a), bem organizado, (b) ligeiramente
desorganizado, (c) a moderadamente a extensivamente desorganizado. Em
relação à positividade no ELISA juntamente com a desorganização do baço,
conjuntivite ( P= 0,0116), hiperproteinemia (p= 0,021) foram mais frequentes no
grupo de animais com ELISA positivo e baço desorganizado, quando
comparado com os outros grupos. Os animais polissintomáticos são mais
frequentes no grupo com ELISA positivo e baço do tipo 3 (p= 0,004). Os scores
clínicos atribuídos à intensidade da conjuntivite (P <0,05), dermatite (P <0,05) e
linfadenopatia (P <0,01), alopecia (P <0,01), onicogrifose (P <0,05) foram mais
elevados nos animais com ELISA positivo e baço desorganizado do que outros
grupos, bem como o número de sinais clínicos atribuíveis à leishmaniose
visceral canina (p= 0,0014).Em relação à análise da positividade na cultura
esplênica juntamente com a desorganização do baço, a frequência de cães
polissintomáticos foi maior em animais com baço ligeiramente desorganizado (P
<0,05) e baço desorganizado (P <0,005), do que em animais com baço
organizado. Alopecia (P <0,01), conjuntivite (P <0,05), desidratação (P <0,001),
dermatite (P <0,05), onicogrifose (p <0,01), anemia (P <0,05), úlcera (P <0,001 )
e alto escore clínico (P <0,001) foram mais frequentes em animais com cultura
esplênica positiva e baço desorganizado, do que nos animais com cultura
negativa e baço organizado. Em conclusão, os cães com desorganização do
baço associada com leishmaniose visceral têm mais sinais clínicos e pior estado
clínico do que os animais com leishmaniose visceral, mas sem desorganização
do baço.The spleen is the largest secondary lymphoid organ in human beings and in
dogs. In both in human beings and in dogs, the absence of the spleen is
associated with increased risk of localized and disseminated infection including
overwhelm sepsis. Visceral leishmaniasis and other infections alter the
histological structure of the spleen, leading to a disruption of the white pulp
microenvironments. Previous works have shown that the disruption of the white
pulp structure is more frequent in dogs with laboratorial markers of susceptibility
to visceral leishmaniasis such as positive spleen culture and negative leishmanin
skin test than in animals in which these susceptibility markers were absent. In
this study, our goal is to examine the relationship between the histological
disorganization of splenic white pulp and severity of visceral leishmaniasis.The
samples and data used in this study were collected from 206 stray dogs from an
endemic area for visceral leishmaniasis, the city of Jequie (Bahia, Brazil). The
animals were examined clinically and ELISA and LST were performed. Splenic
aspirates were collected for culture, and fragments of spleen were collected for
molecular and morphological studies. The animals were ranked according to the
degree of structural organization of splenic white pulp of the spleen in groups (a),
well-organized, (b) slightly disordered, (c) moderately extensively disorganized.
In relation to the positive in the ELISA with the disorganization of the spleen,
conjunctivitis (P = 0.0116) hyperproteinemia (p = 0.021) were more frequent in
the group of animals with positive ELISA and disorganized spleen when
compared to the other groups. Polisymptomatic animals are more frequent in the
group with positive ELISA and spleen type 3 (p = 0.004). Clinical scores
attributed to the intensity of conjunctivitis (P <0.05), dermatitis (P <0.05) and
lymphadenopathy (P <0.01), alopecia (P <0.01), onychogryphosis (P <0.05 )
were higher in animals with positive ELISA and disorganized spleen than other
groups, as well as the number of clinical signs attributable to canine visceral
leishmaniasis (p = 0.0014). Regarding the analysis of positive spleen culture
together with splenic disorganization, the frequency of polisymptomatic dogs was
higher in animals with slightly disordered spleen (P <0.05) and disorganized
spleen (P <0.005) than in animals with organized spleen. Alopecia (P <0.01),
conjunctivitis (P <0.05), dehydration (P <0.001), dermatitis (P <0.05),
onychogryphosis (p <0.01), anemia (P <0.05 ), ulcers (P <0.001) and high
clinical score (P <0.001 were more frequent in animals with positive spleen
culture and disorganized spleen than in animals with negative culture and
organized spleen . In conclusion, dogs with disorganization of the spleen
associated with visceral leishmaniasis have more clinical signs and worse clinical
status than animals with visceral leishmaniasis, but without disruption of the
spleen
Desorganização da polpa branca esplênica está associada com a apresentação clínica mais grave da leishmaniose visceral em cães naturalmente infectados
No full textO baço é o maior órgão linfoide secundário em seres humanos e em cães. Em
ambos, a ausência do baço está associada com um risco aumentado de
ocorrência de infecções localizadas e disseminadas, incluindo sepse
generalizada. A leishmaniose visceral e outras infecções podem alterar a
estrutura histológica do baço, o que leva a uma destruição dos microambientes
da polpa branca. Trabalhos anteriores mostraram que a ruptura da estrutura de
polpa branca é mais frequente em cães com marcadores laboratoriais de
suscetibilidade à leishmaniose visceral, como a cultura esplênica positiva e LST
negativo, do que nos animais em que estes marcadores de susceptibilidade
estavam ausentes. Neste estudo, o nosso objetivo é examinar a relação entre a
desorganização histológica da polpa branca esplênica e a gravidade da
leishmaniose visceral. As amostras e os dados utilizados neste estudo foram
coletados de 206 cães de rua provenientes de uma área endêmica para
leishmaniose visceral, a cidade de Jequié (Bahia, Brasil). Os animais foram
examinados clinicamente e foram realizados os testes ELISA e LST. Aspirados
de baço foram coletados para a cultura, e fragmentos de baço foram coletadas
para estudos de biologia molecular e de estudos morfológicos. Os animais foram
classificados de acordo com o grau de organização estrutural da polpa branca
esplênica em grupos com baço (a), bem organizado, (b) ligeiramente
desorganizado, (c) a moderadamente a extensivamente desorganizado. Em
relação à positividade no ELISA juntamente com a desorganização do baço,
conjuntivite ( P= 0,0116), hiperproteinemia (p= 0,021) foram mais frequentes no
grupo de animais com ELISA positivo e baço desorganizado, quando
comparado com os outros grupos. Os animais polissintomáticos são mais
frequentes no grupo com ELISA positivo e baço do tipo 3 (p= 0,004). Os scores
clínicos atribuídos à intensidade da conjuntivite (P <0,05), dermatite (P <0,05) e
linfadenopatia (P <0,01), alopecia (P <0,01), onicogrifose (P <0,05) foram mais
elevados nos animais com ELISA positivo e baço desorganizado do que outros
grupos, bem como o número de sinais clínicos atribuíveis à leishmaniose
visceral canina (p= 0,0014).Em relação à análise da positividade na cultura
esplênica juntamente com a desorganização do baço, a frequência de cães
polissintomáticos foi maior em animais com baço ligeiramente desorganizado (P
<0,05) e baço desorganizado (P <0,005), do que em animais com baço
organizado. Alopecia (P <0,01), conjuntivite (P <0,05), desidratação (P <0,001),
dermatite (P <0,05), onicogrifose (p <0,01), anemia (P <0,05), úlcera (P <0,001 )
e alto escore clínico (P <0,001) foram mais frequentes em animais com cultura
esplênica positiva e baço desorganizado, do que nos animais com cultura
negativa e baço organizado. Em conclusão, os cães com desorganização do
baço associada com leishmaniose visceral têm mais sinais clínicos e pior estado
clínico do que os animais com leishmaniose visceral, mas sem desorganização
do baço.The spleen is the largest secondary lymphoid organ in human beings and in
dogs. In both in human beings and in dogs, the absence of the spleen is
associated with increased risk of localized and disseminated infection including
overwhelm sepsis. Visceral leishmaniasis and other infections alter the
histological structure of the spleen, leading to a disruption of the white pulp
microenvironments. Previous works have shown that the disruption of the white
pulp structure is more frequent in dogs with laboratorial markers of susceptibility
to visceral leishmaniasis such as positive spleen culture and negative leishmanin
skin test than in animals in which these susceptibility markers were absent. In
this study, our goal is to examine the relationship between the histological
disorganization of splenic white pulp and severity of visceral leishmaniasis.The
samples and data used in this study were collected from 206 stray dogs from an
endemic area for visceral leishmaniasis, the city of Jequie (Bahia, Brazil). The
animals were examined clinically and ELISA and LST were performed. Splenic
aspirates were collected for culture, and fragments of spleen were collected for
molecular and morphological studies. The animals were ranked according to the
degree of structural organization of splenic white pulp of the spleen in groups (a),
well-organized, (b) slightly disordered, (c) moderately extensively disorganized.
In relation to the positive in the ELISA with the disorganization of the spleen,
conjunctivitis (P = 0.0116) hyperproteinemia (p = 0.021) were more frequent in
the group of animals with positive ELISA and disorganized spleen when
compared to the other groups. Polisymptomatic animals are more frequent in the
group with positive ELISA and spleen type 3 (p = 0.004). Clinical scores
attributed to the intensity of conjunctivitis (P <0.05), dermatitis (P <0.05) and
lymphadenopathy (P <0.01), alopecia (P <0.01), onychogryphosis (P <0.05 )
were higher in animals with positive ELISA and disorganized spleen than other
groups, as well as the number of clinical signs attributable to canine visceral
leishmaniasis (p = 0.0014). Regarding the analysis of positive spleen culture
together with splenic disorganization, the frequency of polisymptomatic dogs was
higher in animals with slightly disordered spleen (P <0.05) and disorganized
spleen (P <0.005) than in animals with organized spleen. Alopecia (P <0.01),
conjunctivitis (P <0.05), dehydration (P <0.001), dermatitis (P <0.05),
onychogryphosis (p <0.01), anemia (P <0.05 ), ulcers (P <0.001) and high
clinical score (P <0.001 were more frequent in animals with positive spleen
culture and disorganized spleen than in animals with negative culture and
organized spleen . In conclusion, dogs with disorganization of the spleen
associated with visceral leishmaniasis have more clinical signs and worse clinical
status than animals with visceral leishmaniasis, but without disruption of the
spleen
Produção e análise de partículas sub-micrométricas poliméricas em modelo murino com potencial aplicação em vacinas anti-Leishmania.
No full textPrograma de Pós-Graduação em Biotecnologia. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa de Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto.A leishmaniose visceral é causada pela Leishmania chagasi (sinonímia Leishmania infantum) e para se evitar a transmissão da doença, o desenvolvimento da vacina anti-leishmaniose visceral canina (LVC) é considerada a principal estratégia racional. Neste contexto, diferentes estudos propõem que seria possível um incremento na imunogenicidade vacinal anti-Leishmania ao se realizar o encapsulamento do antígeno. O objetivo deste estudo foi produzir partículas sub-micrométricas (SMP), com potencial para encapsular antígenos candidatos contra Leishmania em modelo murino e analisar o perfil inflamatório e toxicidade. Neste contexto foi realizada a produção de partículas a partir da reação entre a fase oleosa, contendo diferentes concentrações de Ácido Polilático (PLA) e acetona, e a fase aquosa, contendo diferentes concentrações de quitosana, antígeno de Leishmania braziliensis e água. Após evaporação do solvente, o tamanho das partículas foi analisado por espectroscopia de correlação de fótons, após diluição das amostras em água ultra-pura. O tamanho das SMPs obtidas variou entre 200nm e 1200μm, demonstrando variação dependente da concentração dos constituintes utilizados. Além disso, foi obtido potencial zeta variando entre +57,0 e +71,6, apresentando 64% de eficiência de encapsulamento antigênico, o que demonstrou a elevada plasticidade dos materiais usados na produção das partículas. Desta maneira, foi realizada análise da toxicidade e perfil inflamatório. Nesta etapa, foram analisados três grupos (n=5/tempo) de camundongos BALB/c, que foram acompanhados por até 72 horas após o inóculo intradérmico. Vale destacar que os diferentes inóculos foram realizados na região dorso-lombar, em volume de 100L, sendo avaliados os seguintes grupos experimentais: (i) grupo controle (C) inoculado com de solução salina estéril 0,85%, (ii) grupo partícula branca 1 (PB1) composto pelo inóculo correspondente a solução de SMP capazes de encapsular 60μg de antígeno de L. braziliensis, medindo em torno de 800nm, e, (iii) grupo partícula branca 2 (PB2) composto pelo inóculo correspondente a solução de SMP capazes de encapsular 60μg de antígeno de L. braziliensis, medindo em torno de 400nm. As análises, após os diferentes inóculos, foram realizadas em cinco tempos distintos (1/6/24/48/72 horas). Assim, após cada um dos tempos os animais foram submetidos a eutanásia para coleta de material biológico. Neste sentido, o soro foi coletado antes e após 72 horas dos diferentes inóculos para análise da função hepática (ALT, AST) e renal (ureia e creatinina). Além disto, após os diferentes tempos avaliados, um fragmento de pele da região do inóculo foi destinado a histopatologia, análise de ativação celular por NAG e MPO, e dosagem de citocinas. Não foram observadas alterações locais (nódulo ou ulceração), clínicas e comportamentais, bem como na função hepática e renal. Em relação as análises histopatológicas, a cinética inflamatória revelou infiltrado polimorfonuclear moderado no grupo C, com redução da inflamação local, em 24 horas. Para as PB1 e PB2, após 48 horas do inóculo, foi observado um infiltrado polimorfonuclear variando de moderado a intenso, com hiperemia, macrófagos e linfócitos distribuídos em toda a derme. Após 72 horas do inóculo houve resolução da inflamação no grupo PB1. Por outro lado, o grupo PB2 apresentou manutenção do infiltrado inflamatório, com redução de polimorfonucleares e aumento de células mononucleares, confirmados pela análise dos níveis NAG e MPO (macrófagos e neutrófilos, respectivamente) e presença das citocinas IL-6 e TNF-α. Diante do exposto, neste estudo foi possível concluir que ambas as PSM avaliadas (PB1 e PB2) são potenciais indutoras de inflamação local, sem causar alterações locais e sistêmicas aos animais. Deste modo, estas partículas poderiam ser utilizadas em formulações vacinais anti-Leishmania apresentando a vantagem de desencadear reação inflamatória local (efeito adjuvante), além de serem capazes de encapsular antígenos de L. braziliensis.Visceral leishmaniasis is caused by Leishmania chagasi (synonym Leishmania infantum) and to prevent the transmission of this disease, the development of anti-canine visceral leishmaniasis (CVL) vaccine is considered the main rational strategy. In this context, several studies suggest that it would be possible an increase in anti-Leishmania vaccine immunogenicity when performing encapsulation of the antigen. The aim of this study was to produce and analyze the inflammatory profile and toxicity of sub-micrometer particles (SMP) with the potential to encapsulate candidate antigens against Leishmania in a murine model. In this context, particle production was carried out from the reaction between the oily phase, containing different concentrations of polylactic acid (PLA) and acetone, and the aqueous phase, containing different concentrations of chitosan, Leishmania braziliensis antigen and water. After evaporation of solvent, the particle size was analyzed by photon correlation spectroscopy after diluting the samples in ultra-pure water. The size of SMPs obtained varied between 200nm and 1200μm, demonstrating variation dependent of concentration of constituents used. In addition, the zeta potential was obtained ranging between +57.0 and +71.6, with 64% efficiency of antigen encapsulation, which demonstrated the high plasticity of the materials used in the production of the particles. Thus, analysis of the toxicity and inflammatory profile was performed. At this stage, three groups (n=5/time) of BALB/c mice, who were followed for up to 72 hours after intradermal inoculation were analyzed. The different inoculations were performed in the dorsal-lumbar region (volume 100μL). The following experimental groups studied were: control group (C) inoculated with sterile saline 0.85% (i), (ii) white particle group 1 (PB1) comprises the corresponding inoculum solution SMP capable of encapsulating 60μg antigen of L. braziliensis measuring about 800nm, and (iii) white particle group 2 (PB2) comprises the corresponding inoculum solution SMP capable of encapsulating 60μg of the L. braziliensis antigen, measuring around 400nm. The analysis after the different inocula were made at five different times (1/6/24/48/72 hours). Thus, after each time the animals were euthanized for collection of biological material. In this sense, serum was collected before and 72 hours after the different inocula for analysis of liver function (ALT, AST) and kidney (urea, creatinine). In addition, after the different time periods studied, a fragment of the skin region of the inoculum was intended for histopathology analysis of cell activation by NAG and MPO, and measurement of cytokines. Nonlocal (lump or ulceration), clinical and behavioral changes were observed, as well as liver and kidney function was regular. Regarding the histopathological analysis, the inflammatory infiltrate kinetics revealed moderate polymorphonuclear in group C, with reduced local inflammation in 24 hours. PB1 and PB2 showed 48 hours after inoculation a polymorphonuclear infiltrate ranging from moderate to intense, with hyperemia, macrophages and lymphocytes distributed throughout the dermis. After 72 hours it was observed resolution of inflammation in PB1 group. On the other hand, the PB2 group showed maintenance of the inflammatory infiltrate, with reduction of polymorphonuclear and increase of mononuclear cells, as confirmed by analysis of NAG and MPO levels (macrophages and neutrophils, respectively) and the presence of IL-6 and TNF-α. Given the above, in this study it was concluded that both the evaluated SMPs (PB1 and PB2) are potential inducers of local inflammation without causing local and systemic changes to animals. Thus, these particles could be used in vaccine formulations against Leishmania and have the advantage of eliciting a local inflammatory response (adjuvant effect), and are able to encapsulate antigens of L. braziliensis
Estudo da interação molecular da Nitazoxanida por meio de uma abordagem proteômica e efeitos sobre danos teciduais.
No full textPrograma de Pós-Graduação em Biotecnologia. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa de Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto.A Nitazoxanida (NTZ) é um antiparasitário de amplo espectro de ação utilizado no
tratamento de infecções intestinais ocasionados por helmintos, protozoários e
gastroenterites virais causadas por Rotavírus e Norovírus. Além disso, estudos
demonstraram que a NTZ apresenta atividades antibacterianas, anti-inflamatórias,
antivirais e antitumorais. O amplo espectro de atividade está relacionado tanto a NTZ,
quanto ao seu metabólito ativo Tizoxanida (TIZ). No entanto, alguns efeitos colaterais
podem ser observados após ingestão desse fármaco. Poucos estudos foram realizados
com o objetivo de investigar as interações da NTZ com proteínas de mamíferos e o seu
efeito em células normais, tendo em vista seu efeito antiproliferativo em células
tumorais. Diante disso, no presente trabalho, a TIZ foi imobilizada em Sepharose 4B e
submetida a ligação com homogenatos de encéfalo, rim, fígado e intestino de ratos
Wistar, com o objetivo de isolar e identificar proteínas que interagem de forma
específica com a TIZ. Além disso, foi avaliado o efeito antiproliferativo da NTZ em
células normais, por meio de ensaio de reparação tecidual em camundongos Swiss. Por
meio da espectrometria de massas foram identificadas 60 enzimas com critérios de
elevada estringência, que podem ter suas atividades alteradas pela NTZ. A modelagem
molecular realizada com a NTZ, TIZ e as enzimas Glutathione S-transferase P1
(GSTP1), Glutathione S-transferase M2 (GSTM2), NAD(P)H dehydrogenase [quinone]
1 (NQO1), Fumarylacetoacetase (FAH) e Hydroxysteroid (17-beta) dehydrogenase 10
(17β-HSD10), permitiu a proposição do sítio de ligação dessas enzimas que justificam
uma inibição competitiva pela NTZ/TIZ. A modelagem com Protein disulfideisomerase (PDI), permitiu a proposição de uma inibição na PDI humana pela TIZ, por
meio do impedimento de estabilização da sua conformação no estado reduzido. Esses
resultados colocam a GSTP1, GSTM2, NQO1 e PDI como possíveis alvos dos efeitos
antitumorais que foram demonstrados para NTZ, uma vez que estas enzimas são
essenciais para manutenção das células tumorais; a FAH como possível alvo de efeitos
colaterais em função do acúmulo do seu metabólito tóxico; e a 17β-HSD10 como
possível alvo de novas alternativas para o tratamento do Alzheimer, devido ao possível
envolvimento dessa enzima no desenvolvimento da doença. Além disso, nossos estudos
de reparação tecidual em camundongos tratados com NTZ 10-3M, NTZ 10-5M e NTZ
10-6M, demonstraram macroscopicamente que não houve um efeito modificador da
proliferação tecidual que limitasse o fechamento das áreas das feridas, e que
microscopicamente o grupo NTZ 10-3M apresentou feridas num grau de maturidade
mais avançado, compatível com o estágio proliferativo do processo cicatricial em
comparação ao grupo controle. Os resultados desse trabalho corroboram com os
mecanismos dos efeitos antitumorais descritos para esse fármaco, interpretam as
interações moleculares para auxiliar no desenvolvimento de novas estruturas e sugerem
a possibilidade de aplicação no tratamento da doença de Alzheimer.Nitazoxanide (NTZ) is a broad-spectrum antiparasitic used to treat intestinal infections
caused by helminths, protozoa, and viral gastroenteritis occasioned by Rotavirus and
Norovirus. Besides, studies have demonstrated that NTZ exhibits antibacterial, antiinflammatory, antiviral, and antitumor activities. The broad spectrum of activity is
related to both NTZ and its active metabolite Tizoxanide (TIZ). However, some side
effects may be observed after ingestion of this drug. Few studies have been conducted
to investigate the interactions of NTZ with mammalian proteins and their effect on
normal cells concerning their antiproliferative effect on tumor cells. Therefore, in the
present study, TIZ was immobilized on Sepharose 4B and bonded with the brain,
kidney, liver and intestine homogenates of Wistar rats, to isolate and identify proteins
that interact specifically with TIZ. In addition, the antiproliferative effect of NTZ on
normal cells was evaluated by tissue repair assay in Swiss mice. Through mass
spectrometry, 60 enzymes with high stringency criteria were identified, which may have
their activities altered by NTZ. Molecular modeling performed with NTZ, TIZ,
Glutathione S-transferase P1 (GSTP1), Glutathione S-transferase M2 (GSTM2),
NAD(P)H dehydrogenase [quinone] 1 (NQO1), Fumarylacetoacetase (FAH) and
Hydroxysteroid (17-beta) dehydrogenase 10 (17β-HSD10) enzymes, allowed the
proposition of the binding site of these molecules that justify a competitive inhibition by
NTZ/TIZ. Protein disulfide-isomerase (PDI) modeling allowed the proposition of
inhibition in human PDI by TIZ, by preventing the stabilization of its conformation in
the reduced state. These results place GSTP1, GSTM2, NQO1, and PDI as possible
targets of the antitumor effects that have been demonstrated for NTZ, since these
enzymes are essential for tumor cell maintenance; FAH as a possible target of side
effects due to the accumulation of its toxic metabolite; and 17β-HSD10 as a possible
target for new alternatives for Alzheimer's treatment, due to the possible involvement of
this enzyme in the development of the disease. Also, our tissue repair studies in NTZ
10-3M, NTZ 10-5M, NTZ 10-6M treated mice, macroscopically demonstrated that there
was no tissue proliferation modifying effect limiting wound closure, and
microscopically the NTZ 10-3M group presented wounds at a more advanced maturity
level, compatible with the proliferative stage of the healing process compared to the
control group. This work’s results corroborate with the mechanisms of antitumor effects
described for this drug, they interpret the molecular interactions to assist in the
development of new structures and suggest the possibility of application in the
treatment of Alzheimer’s disease
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