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Sequenzspezifische Rekrutierung von Proteinen zum "Inneren Membrankomplex" des Malariaparasiten (Welch, 1897)
No full textMutational analysis of the P. falciparum ARO protein, functional analysis of its predicted binding partner AIP and identification of AIP interacting proteins
No full textDespite tremendous efforts, malaria is still one of the most devastating diseases affecting millions of humans worldwide. The most severe form of the disease is caused by Plasmodium falciparum. One stage of this protozoan parasite, termed merozoite, infects red blood cells, where the parasite multiplies exponentially. This multiplication step is responsible for all clinical symptoms.
The infection of an erythrocyte is coordinated by the complex invasion machinery of the parasite. Specialized secretory organelles (micronemes, rhoptries and dense granules) discharge their protein content to establish an orchestrated cascade of molecular interactions to mediate host cell entry. The dual club-shaped rhoptries are located at the apical pole (apex) of the parasite. The underlying molecular processes governing rhoptry biogenesis at the apex and its activity during secretion are not well understood.
An Apicomplexa-specific protein named ARO (Armadillo repeats only) has been identified in P. falciparum and in
its close relative Toxoplasma gondii. It has been shown that ARO, which localizes to the cytosolic side of the
rhoptries via lipid anchor modification, is essential to orient the nascent rhoptries at the apex. No crystal structure
was available that would allow for a more detailed functional analysis. Research on T. gondii has shown that ARO
interacts with ARO interacting protein (AIP), adenylate cyclase β (ACβ) and myosin F (MyoF), but no information
was available on any ARO interacting proteins in the malaria parasite.
In this work, an AIP homologue was identified in P. falciparum using a BLAST homology search. Subsequent co-localization studies, using fluorescence microscopy, localized fluorescent reporter-tagged versions of AIP to the rhoptry neck. Quantitative analysis of co-localization data demonstrated only a partial overlap with ARO, which showed a pronounced rhoptry bulb localization. Flow cytometry and Giemsa smear analysis were performed to assess the phenotypic effect upon the depletion of AIP from the rhoptry neck using the conditional knock-sideways
approach. The mislocalization of AIP caused a defect in the invasion of erythrocytes by merozoites. To assess AIP interaction partners, the proximity-dependent biotinylation approach followed by mass spectrometry was used. Several candidates could be identified, including ACβ, which was previously implicated in AIP interaction in T. gondii.
In a collaborative approach with the Junop laboratory (Western University, Canada), the crystal structure of PfARO was solved. This structural information was used to probe ARO-AIP interaction. Distinct amino acids were mutated at the putative protein-protein interaction face, and the consequences for ARO-AIP interaction were quantified. It could be shown that mutations within this ARO domain lead to mislocalized AIP.Trotz erheblicher Erfolge in der Malariabekämpfung in den letzten 20 Jahren, ist sie noch immer eine der verheerendsten Infektionskrankheiten, welche Millionen Menschen weltweit betrifft. Die schwerste Form dieser Krankheit wird durch Plasmodium falciparum verursacht. Dieser Parasit kann, im sogenannten Merozoiten-Stadium, in Erythrocyten eindringen und sich in ihnen vermehren. Das damit einhergehende exponentielle Wachstum ist verantwortlich für alle klinischen Symptome der Malaria.
Die Wirtszellinvasion wird durch eine komplexe Invasionsmaschinerie des Parasiten koordiniert. Spezialisierte
sekretorische Organellen (Mikroneme, Rhoptrien und dichte Granula) entleeren ihren Proteininhalt, um in einer kontrollierten Kaskade molekularer Interaktionen den Eintritt in den Erythrocyten zu ermöglichen. Die paarigen, kegelförmigen Rhoptrien sind am apikalen Pol des Parasiten lokalisiert. Die zugrundeliegenden molekularen Prozesse, welche die Rhoptrienbiogenese am apikalen Pol des Merozoiten und deren sekretorische Aktivität ermöglichen, sind gegenwärtig nur teilweise verstanden.
Für ein, für die phylogenetische Gruppe der Apikomplexa, zu welcher auch die Spezies P. falciparum und Toxoplasma gondii gehören, spezifisches Protein names ARO (Armadillo repeats only) konnte gezeigt werden, dass es mit Hilfe von Lipidankern mit der cytosolischen Seite der Rhoptrienmembran interagiert und dort eine essentielle Funktion für die intrazelluläre Positionierung der Rhoptrien ausübt. Weiterführende Arbeiten mit dem ARO-Homolog in T. gondii identifizierten interagierende Proteine, darunter die Adenylatcyclase β (ACβ), Myosin F (MyoF) und ein ARO interagierendes Protein, welches AIP genannt wurde. Dessen Homolog im Malariaparasiten war bislang unerforscht und eine detaillierte Information zur Tertiärstruktur von ARO war nicht vorhanden.
In der vorliegenden Arbeit wurde ein AIP-Homolog mittels der BLAST-Homologie-Suche in P. falciparum identifiziert und das Gen so modifiziert, dass sowohl dessen Lokalisation als auch eine funktionelle Analyse des Genproduktes möglich war. Nachfolgende Fluoreszenzmikroskopie-Kolokalisationsstudien zeigten, dass AIP an den Rhoptrienhals lokalisiert. Die quantitative Auswertung der Kolokalisationstudien zeigte eine nur teilweise
Überlappung mit ARO, welches selbst eine ausgeprägte Lokalisation am Rhoptrienbauch aufwies. Die funktionelle Analyse wurde durch die „knock-sideways“-Methode realisiert, welche eine konditionelle Mislokalisierung von AIP ermöglichte. Es konnte gezeigt werden, dass eine Depletion von AIP vom Rhoptrienhals zu einem Defekt der Invasion von Erythrozyten führt. Um potentielle Interaktionspartner von AIP zu ermitteln, wurde die Methode der entfernungsabhängigen Biotinylierung, gefolgt von Massenspektrometrie, gewählt. Dieses ermöglichte die Erstellung einer Kandidatenliste, die unter anderem auch ACβ beinhaltete.
In einer Kollaboration mit dem Junop Labor (Western University, Kanada) wurde die Kristallstruktur von ARO ermittelt. Die strukturellen Informationen erlaubten eine detailliertere Untersuchung der ARO-AIP-Interaktion. Verschiedene Aminosäuren der vermutlichen Protein-Protein Interaktionsdomäne wurden mutiert und deren Auswirkungen auf die Interaktion von ARO und AIP wurden quantifiziert. Es konnte gezeigt werden, dass Mutationen innerhalb dieser ARO-Domäne zu einer Fehllokalisation von AIP führen
Charakterisierung des Inneren Membrankomplexes in P. falciparum (Welch, 1897)
No full textMalaria stellt für viele Länder der Welt eine ernste Gesundheitsbedrohung dar. Diese Infektionskrankheit wird durch einzellige Parasiten der Gattung Plasmodium verursacht, die von Anopheles-Mücken auf den Menschen übertragen werden. Als direkte Folge der Infektion mit dem tödlichsten Malariaerreger Plasmodium falciparum sterben jährlich 435000 Menschen, insbesondere Kinder unter fünf Jahren. Bis heute steht kein effektiver Impfstoff zur Verfügung und weltweit treten Resistenzen gegen alle geläufigen Substanzen zur Malariabekämpfung auf.
Alle Symptome der Malariaerkrankung resultieren aus der exponentiellen, asexuellen Vermehrung des Parasiten im Blut. Unter anderem während dieser Blutphase der Infektion kommt dem Inneren Membrankomplex (IMC) eine herausragende Rolle während der Invasion in die roten Blutzellen, der Segregation der Tochtermerozoiten und der Gametozytogenese zu. Der IMC besteht aus einer mit dem Zytoskelett assoziierten Doppelmembranstruktur unterhalb der Plasmamembran der Merozoiten. Dieses zelluläre Alleinstellungsmerkmal findet man lediglich bei Einzellern des phylogenetischen Stammes der Alveolata, zu denen neben den Apikomplexa auch die Dinoflagellata und Ciliophora zählen. In Plasmodien sind ca. 35 IMC-Proteine identifiziert und z. T. charakterisiert. Einige spezifische Proteine definieren hierbei einen distinkten Bereich innerhalb des IMC – den Basalkomplex. Diese dynamische Ringstruktur ist essentiell für die Biogenese der Tochterzellen. Die Bedeutung dieser Struktur steht allerdings im klaren Gegensatz zur begrenzten Kenntnis die wir über sie besitzen.
Zur Identifizierung neuer Basalkomplex-Proteine wurde eine induzierbare proximity-dependent biotin identification-Methode (DIQ-BioID) angewendet. Hierbei vermittelt ein FKBP-FRB-Heterodimerisierungsystem die Lokalisation der Ligase BirA* am Basalkomplex-Markerprotein Morn1 und ermöglich damit die Biotinylierung benachbarter Interaktionspartner, die dann aufgereinigt und mit Hilfe der Massenspektrometrie bestimmt wurden.
Dabei wurden als potentielle Basalkomplex-Kandidaten ein bislang uncharakterisiertes Protein (PF3D7_1019100), eine HAD-Protein (PF3D7_1118400), MyoJ sowie u. a. Vertreter der Kinesin-Familie identifiziert. Im Anschluss wurden fünf Vertreter der Kinesine in P. falciparum charakterisiert. Kolokalisations-Studien zeigen, dass die Kinesine 5 und 8.2 im Mikrotubuli-organisierendem Zentrum (MTOC) lokalisieren.
Mislokalisation der individuellen Kinesine in den Kern, bzw. an die Plasmamembran hat keinen Einfluss auf die Proliferation der Parasiten bzw. auf die Ausbildung des IMC. Dies deutet auf ihre redundante Funktion unter den gewählten Versuchsbedingungen hin.
Im zweiten Teil der Arbeit wurde die Analyse des Abbaus des IMC nach erfolgreicher Invasion in die rote Blutzelle initiiert. Hierbei ergab eine proteinbiochemische Analyse, dass der Abbau der IMC-Proteine wahrscheinlich über das Ubiquitin-Proteasom-System erfolgt.
Die Visualisierung der GFP-markierten IMC-Proteine in vivo nach Zusammenbruch der Doppelmembran, zeigt eine unterschiedliche Lokalisation der Proteine, bzw. Proteinfragmente abhängig von ihrem Membranassoziationsmechanismus im IMC. Hochauflösende FIB-SEM-Mikroskopie zur Darstellung der IMC-Membranen in 3D verdeutlicht, dass der IMC innerhalb von weniger als 15 Minuten nach erfolgreicher Invasion in die rote Blutzelle nicht mehr unter der Plasmamembran nachweisbar ist und sich der Abbau in P. falciparum grundlegend vom Abbau des IMC in verwandten Organismen unterscheidet
Biogenese der parasitophoren Vakuolen Membran (PVM) und die Regulierung ihrer Hauptkomponenten, der „early transcribed membrane proteins“ (ETRAMPs), in der Blutphase von Plasmodium falciparum (Welch, 1897)
No full textMalaria still represents a serious threat to humankind. An effective vaccine is still not available and resistances to all common anti-malarial drugs are widespread. The causative agent of malaria - parasites of the genus Plasmodium - are transmitted during a blood meal of an infected, female Anopheles mosquito. The severest form of malaria in humans, falciparum malaria, is caused by the blood stages of P. falciparum. Due to its obligate intracellular lifestyle, only the invasive parasite stage can be found outside of the host cell. Inside their host cells, hepatocyte during the symptomless liver stage and erythrocyte during the blood stage, the parasites reside in a highly specialized compartment, the parasitophorous vacuole (PV) which is surrounded by a membrane (PVM). The PV forms during the invasion process out of host cell membrane, which is immediately altered and supplemented with parasite derived proteins and lipids. In order to modify its host cell, proteins are exported into the host cell cytoplasm. Those parasites proteins have to pass the parasites plasma membrane as well as the PVM. The same applies also for nutrients taken up by the parasites.
Many aspects of this parasite specific compartment have been analyzed before, however its biogenesis had not been examined yet. In this thesis the PV biogenesis was analyzed through the entire development of P. falciparum blood stages by using the recently established 4d-microscopy technique. Utilizing artificial reporters, which were secreted to the lumen of the PV and expressed under the control of stage-specific promoters, this compartment could be observed over the entire 48 hours blood stage development. Furthermore, protein-specific localizations of PV-resident proteins, fused to fluorescent proteins, were examined.
An artificial reporter under the control of the 5´ untranslated region (5´UTR) of the early transcribed membrane protein2 (etramp2) gene was used to visualize the PV of early ring stage parasites immediately after the invasion for the first time. These experiments revealed that PV proteins localize to the far end of arm-like extensions during the amebic phase of ring stage parasites while the marker was barely detectable in the remaining PV. This localization was previously described to be specific for compounds of the P. falciparum translocon for exported proteins (PTEX). However, the observation shown in this work suggest that this is a general localization of several PV proteins during that stage. The reporter cell line, under the control of the etramp2 promoter region, was further used to examine the putative translational repression of etramp2 mRNAs during the schizont stage. This reporter, as well as IFAs against ETRAMP2, showed no complete translational repression and an onset of translation in the very late schizont stage, shortly before its rupture.
During the early trophozoite development the PV appeared smoothly, except for some protrusions, extending from the parasite. These protrusions observed, were mainly identified as the recently identified cavity, an extension of unknown function, bound to the parasites cytosol.
During the PV biogenesis of later stages of trophozoite development two newly identified phases were observed: the strawberry-phase and the gap-phase.
The strawberry-phase always occurred concomitantly with the centralization of the parasites food vacuole (FV), an event characteristic for the transition of the trophozoite to the schizont stage. This new phase is characterized, by a rough appearance of the PV and a discontinuous distribution of the reporter-protein within the PV.
The strawberry-phase was immediately followed by the gap-phase and was characterized by gaps in the reporter-protein distribution. The GFP seemed to be excluded from those distinct areas of the PV. The end of the gap-phase was characterized by the segmentation of newly formed daughter merozoites.
These distinct and reproducible phases of the PV morphology were observed for all reporter cell lines, suggesting general, structural changes. The strawberry-phase may represent the onset of schizogony and the gap-phase its end and the transition to the stage of daughter parasites segmentation. Therefore, they probably represent sub-stages of schizont development, which have to be characterized in more detail on the molecular level in the future.Malaria stellt nach wie vor eine massive Bedrohung für die Menschheit da. Trotz zahlreicher Versuche gibt es immer noch keinen kommerziell erhältlichen Impfstoff und Resistenzen gegen alle bekannten Malaria-Medikamente breiten sich immer weiter aus. Die Malariaerreger, Parasiten der Gattung Plasmodium, werden von weiblichen Anopheles-Mücke, während einer Blutmahlzeit, übertragen. Malaria Tropica, die schwerste Form der Malaria im Menschen, wird von Blutstadien der Spezies P. falciparum ausgelöst. In dieser Phase und auch in der symptomlosen Leberphase sind, bedingt durch die obligat, intrazelluläre Lebensweise des Parasiten, nur dessen invasiven Stadien außerhalb der Wirtszellen zu finden.
Innerhalb ihrer Wirtszellen, Hepatozyten bzw. Erythrozyten, entwickeln sich die Plasmodien stets in einem spezialisierten Kompartimentes, der Parasitophoren Vakuole (PV), die von einer Membran (PVM) umgeben ist. Diese entsteht während des Invasionsprozesses aus der Wirtszellmembran, die jedoch sofort durch parasiteneigene Proteine und Lipide modifiziert wird. Bei der überlebensnotwendigen Modifikationen der Wirtzelle durch den Parasiten und bei der Aufnahme von Nährstoffen, müssen sowohl die Parasiten Plasma Membran, als auch die PVM passiert werden. Dieses Kompartiment wurde vielseitig untersucht, aber nie wurde die Biogenese der PV analysiert. Mit Hilfe der seit kurzem verfügbaren vier-dimensionalen-Mikroskopie für Blutstadien-Entwicklung von P. falciparum konnte in dieser Arbeit die Biogenese dieses Kompartiments genau untersucht werden. Durch die Sekretion von artifiziellen Reportern (Fusionen von einem Signal Peptid (SP) mit Fluoreszenzproteinen unter Kontrolle von stadienspezifischen Promotoren) in das PV-Lumen, konnte die Entwicklung der PV über die kompletten 48 Stunden der Blutphase beobachtet werden. Außerdem wurden die proteinspezifischen Lokalisationen endogener PV Proteine durch die Fusion mit Fluoreszenzproteinen analysiert. Durch die Expression eines artifiziellen Reporters unter der Kontrolle der 5´untranslationierten Region (5´UTR) des Genes für das early transcribed membrane protein2 (etramp2) konnte erstmals auch die PV früher Ringstadien, direkt nach der Invasion, visualisiert werden. Dabei konnten für die amöboiden Formen der Ringstadien distinkte Proteinlokalisationen, in den Enden der amöboiden Verlängerungen, und kaum im Rest der PV beobachtet werden. Diese zuvor als spezifisch für Komponenten des Plasmodium Translokons für exportierte Proteine (PTEX) beschriebene Lokalisation, scheint demnach eine generelle Lokalisation vieler PV Proteine in diesem Stadium darzustellen. Die Reporterzellline, unter der Kontrolle der etramp2 5´ UTR wurde außerdem zur Untersuchung einer postulierten translationellen Repression der etramp2 mRNA im Schizontenstadium genutzt. Es konnte jedoch keine vollständige Repression beobachtet werde, sondern eine Expression des Reporters bereits im späten Schizontenstadium, kurz vor dessen Ruptur. Während der frühen Trophozoitenentwicklung erschien die PV ebenmäßig bis auf einige Extensionen, die vom Parasiten ausgingen. Diese Extensionen repräsentierten überwiegend die kürzlich beschriebene Cavity, eine mit dem Parasitencytosol verbundene Struktur unbekannter Funktion.
Es konnte gezeigt werden, dass die PV Biogenese während des späten Trophozoitenstadiums zwei neu entdeckte Phasen aufweist: die Strawberry-Phase und die Gap-Phase. Die mehrere Stunden andauernde Strawberry-Phase beginnt zeitgleich mit der Zentralisierung der Fressvakuole (FV), welche charakteristisch für den Übergang zum Schizontenstadium ist. Diese Phase ist dadurch gekennzeichnet, dass die PV rau erscheint und Reporterproteine in distinkten Bereichen lokalisieren, kontinuierlich unterbrochen von Bereichen ohne GFP-Signal.
Die Gap-Phase beginnt im Anschluss an die Strawberry-Phase und ist dadurch gekennzeichnet, dass eine oder mehrere Lücken in der Reporterproteinverteilung auftauchen. Das GFP schien von bestimmten Arealen der PV ausgeschlossen zu sein. Das Ende der Gap-Phase ist durch die sichtbare Segmentierung der neu gebildeten Merozoiten gekennzeichnet. Diese distinkten und reproduzierbaren Phasen der PV Morphologie, beobachtet für alle Reporterzelllinen, lassen Rückschlüsse auf generelle, strukturelle Veränderungen zu. Die Strawberry-Phase könnte die Einleitung der Schizogony repräsentieren und die Gap-Phase deren Ende und den Übergang zur Segmentierung der Tochterparasiten. Die beobachten Phasen können somit als Sub-Phasen der Schizontenentwicklung bezeichnet werden, die es auf molekularer Ebene weiter zu erforschen gilt
Das Zytokin IL-22 moduliert die Immunantwort im Verlauf einer Plasmodium berghei ANKA Infektion in der Maus (Mus musculus)
No full textDuring plasmodial infection, it is of crucial importance to maintain the balance between pro- and anti-inflammatory immune response, since the disruption leads to severe malaria pathology. Members of the IL-10 cytokine family have a modulatory effect on the immune response and control the immune system during infection. Especially IL-10 itself acts highly immunosuppressive and its absence leads to a fatal outcome of disease. One member of the IL-10 cytokine family is IL-22. This cytokine is closely related to IL-10 concerning the sequence homology and shares a receptor chain with IL-10. The receptor complex of IL-22, which consists of the IL-10Rß chain and the IL-22Ra1 chain, is thought to be expressed by non-hematopoietic cell, e.g. hepatocytes, even though IL-22 itself is mainly produced by cells of the immune system. In this present study, an increased level of IL-22 was determined in the blood plasma of Plasmodium falciparum (P. falciparum) infected humans compared to healthy participants of the study. The same result was obtained in a comparable murine malaria model which includes the infection of C57BL/6 mice with Plasmodium berghei ANKA (PbA). Furthermore IL-22-deficient mice and wt mice were infected with PbA to elucidate the role of IL-22 during plasmodial infection concerning the pathology and the development of parasitemia. The occurrence of cerebral malaria symptoms was higher in the absence of IL-22 accompanied by an early induction of IFNgamma and a decreased level of parasitemia. Since the PbA sporozoite burden in the liver of IL-22-/- mice is similar to wild type mice, the lower parasitemia is not due to a different infectivity of sporozoites to hepatocytes in the liver, even though hepatocytes express the IL-22 receptor complex. Hence the blood stage of malaria was further characterized and a higher secretion of IFNgamma by different T cell subtypes was found at an early time point of PbA infection in IL-22-/- mice, indicating that the activation of the adaptive immune system is modulated in the absence of IL-22. This was confirmed with the observation that dendritic cells, the classical connection point between the innate and the adaptive immune system, of IL-22-/- mice show an enhanced expression of costimulatory receptors upon stimulation, in-vitro by LPS as well as in vivo during PbA infection. Therefore, it can be assumed that dendritic cells are influenced by IL-22. This assumption can be reinforced by the observation that the IL-22Ra1 chain is detectable upon stimulation of dendritic cells by PCR.Während der Malaria ist es von besonderer Bedeutung das Gleichgewicht zwischen einer pro-inflammatorischen und einer anti-inflammatorischen Immunantwort zu bewahren, da eine Beeinträchtigung des Systems zu einer schweren Pathologie der plasmodialen Infektion führen kann. Mitglieder der Interleukin (IL)-10 Zytokin-Familie besitzen die Fähigkeit die Immunantwort bezüglich einer Infektion zu beeinflussen. Besonders IL-10 selbst kennzeichnet sich durch immunregulatorische Funktionen aus. Dies konnte bereits durch die fatale Auswirkung der Abwesenheit von IL-10 während einer Plasmodium Infektion im Mausmodell gezeigt werden. Ein Mitglied der IL-10 Zytokin-Familie ist IL-22. Dieses Zytokin ist eng mit IL-10, bezüglich der Sequenzhomologie und der Eigenschaft sich eine Rezeptorkette mit IL-10 zu teilen, verwand. Die Expression des IL-22 Rezeptorkomplexes, bestehend aus der IL-10Rß Kette und der IL-22Ra1 Kette, wurde bisher nicht-hämatopoetischen Zellen, z.B. Hepatozyten, zugeschrieben. Im Gegensatz dazu wird IL-22 von Zellen des Immunsystems produziert. In dieser Studie konnte gezeigt werden, dass die IL-22 Konzentration im Plasma Plasmodium falciparum infizierter Menschen im Vergleich zu gesunden Menschen erhöht ist. Das gleiche Ergebnis konnte auch in einem vergleichbaren Mausmodell dargestellt werden, welches die Infektion von Mäusen der Art C57BL/6 mit dem Plasmodium berghei ANKA (PbA) beinhaltet. Des Weiteren wurden IL-22 defiziente Mäuse und wild-typ Mäuse mit PbA infiziert, um die Rolle von IL-22 im Verlauf der Malaria bezüglich der Pathologie und der Parasitämie zu analysieren. Das Auftreten von zerebralen Symptomen war verstärkt in der Abwesenheit von IL-22, begleitet von einer frühen Induktion von IFNgamma als auch einer niedrigeren Parasitämie. Da sich die PbA-Sporozoitenlast in der Leber nicht unterscheidet, kann die verringerte Parasitämie nicht durch eine unterschiedliche Infektiosität der PbA-Sporozoiten gegenüber der IL-22Ra1 Kette exprimierenden Hepatozyten erklärt werden. In der Blutphase konnte eine verstärkte Produktion von IFNgamma durch verschiedene T-Zellpopulationen an einem frühen Zeitpunkt der PbA Infektion gezeigt werden. Dies führte zu der Annahme, dass die Aktivierung des adaptiven Immunsystems in der Abwesenheit von IL-22 modifiziert ist. Die klassische Verbindung zwischen dem angeborenen und dem adaptiven Immunsystem obliegt den dendritischen Zellen, welche in IL-22-/- Mäusen eine verstärkte Expression von kostimulatorischen Rezeptoren aufweisen. Dies konnte sowohl in vitro, durch LPS Stimulation, als auch in vivo, in der PbA Infektion, gezeigt werden. Somit kann davon ausgegangen werden, dass dendritische Zellen durch IL-22 beeinflusst werden können. Diese Behauptung kann durch die per PCR nachgewiesene Expression der IL-22Ra1 Kette auf stimulierten dendritischer Zellen bestätigt werden
Structural and functional insights into apicomplexan gliding and its regulation
No full textApicomplexans are a group of single cell parasitic organisms that are infectious agents of many human and animal diseases. For example, Plasmodium species cause malaria, which infects over 200 million and kills almost 400 thousands people every year. Toxoplasma species have infected about 30-50% of the entire population. While infection is benign for most, it is a threat for immunocompromised patients and pregnant women. Several other apicomplexan species are causative agents of diseases in domesticated animals in Africa, representing further financial and humanitarian burdens.
A typical apicomplexan parasite completes a sophisticated life cycle, usually switching between two host organisms to engage in sexual reproduction in one and the asexual reproduction in the other. During their life cycle, the parasites differentiate into distinct life stages that possess unique shapes and morphologies. Motile life stages, in which the parasites move through the tissues and invade their host cells, are of specific interest because the parasite cells are exposed to the extracellular environment outside the host cells. Consequently, they are more accessible to the host immune system and drugs, making them and their proteins major drug targets.
To move across tissues and invade host cells, apicomplexans use a specific type of motility that does not require a change in their cell shape, called gliding. Many organelles and subcellular structures of the motile apicomplexan stages are designed to mediate efficient gliding and host cell invasion. These parasitic cells are elongated and polarized, forming an apical pole in the anterior and basal end in the posterior of the parasite. The parasites glide and invade the host cell in the apical direction. The apical pole contains specialized secretory organelles, such as micronemes and rhoptries, that discharge important virulence factors essential for gliding and for host cell invasion. Other specialized organelles, alveoli, also called inner membrane complex (IMC), form a network of large flat vesicles underneath the parasite`s plasma membrane to accommodate the molecular motor that powers the motility and invasion process.
This thesis cumulates three separate bodies of work that represent advances in understanding of the processes that are important in gliding motility and host cell invasion by apicomplexan parasites.
The first work (manuscript 1) reveals the structure and the function of the essential light chains (ELCs) of Plasmodium falciparum and Toxoplasma gondii. In apicomplexan parasites, ELCs are part of the glideosome, a larger complex residing between the parasite`s plasma membrane and the IMC. The glideosome consists of a myosin motor protein MyoA, two light chains – ELC and myosin light chain 1 (MLC1) and three glideosome associated proteins (GAPs). It has been shown that ELCs bind the neck domain of MyoA and facilitate an enhanced motor efficiency. However, the molecular mechanism behind this phenomenon remains unclear.
We have shown that the two T. gondii ELCs (TgELC1 and TgELC2) as well as P. falciparum ELC (PfELC) bind a conserved sequence of the MyoA neck domain. We have determined the structures of all ELCs bound in trimeric complexes with their respective MyoA neck domains and MLC1s, representing the first glideosome trimeric complexes shown so far. These structures reveal that the C terminus of PfELC, which is partially unfolded in an unbound state, maintains some degree of flexibility even in the complex, resulting in a different interaction angle compared to TgELCs and explaining lower affinity of PfELC to MyoA compared to its T. gondii analogues. Additionally, we have shed a light on the regulatory function of ELCs, showing that two phosphorylation sites can regulate their binding to MyoA. On the other hand, we proved that the binding of calcium does not regulate the ELC binding and only increases the stability of the trimeric complexes. Finally, we have shown that upon binding, the ELCs induce a formation of secondary structure in MyoA neck, leading to a stiffer MyoA neck that consequently serves more efficiently as a lever arm and increases the motor speed.
In the second project (manuscript 2), we have tackled the role of a rhoptry protein Armadillo Repeat-Only (ARO) and its putative interaction partner, ARO interacting protein (AIP). ARO is anchored to the membrane of the rhoptries from their cytoplasmic side by palmitoylation and myristoylation. In T. gondii, ARO has been shown to be essential for the correct positioning of rhoptries in the apical pole and to interact with AIP1, myosin F (MyoF) and adenylate cyclase beta (ACβ). However, it was not clear whether the same arrangement holds true in P. falciparum.
We solved the crystal structure of PfARO that, with five armadillo repeat motifs, assumes a bean shaped conformation. We identified the P. falciparum homologue of T. gondii AIP1 and showed that AIP1 proteins are only present in apicomplexan organisms, lacking any structural homologues outside of apicomplexan species. Further localisation studies, using super-resolution microscopy, revealed that in P. falciparum, PfARO does not co localise with PfAIP. While PfARO localises to rhoptry bulbs, PfAIP1 is present in rhoptry necks. On the other hand, deletion of the conserved loop of PfARO, that was identified thanks to the solved structure, leads to mis localisation of PfAIP1, suggesting that the two proteins do associate. Finally, proximity-dependent biotin identification approach showed that PfAIP associates with PfACβ and MyoF as in T. gondii, but does not interact with PfARO. Based on these conflicting results, we have proposed two models of PfARO-PfAIP interaction.
The third work (manuscript 3) investigates the structure and function of P. falciparum glycogen synthase kinase (PfGSK3). Human GSK3 regulates diverse processes, such as glycogen metabolism, cell cycle and grow, translation, embryonic development or differentiation of neurons. On the other hand, the role of PfGSK3 is rather elusive. PfGSK3 has been shown to have an impact on parasite`s invasion. During host cell invasion, the parasite forms the moving junction, an interface between the parasitic cell and host cell, through which the parasites glide inside the host cell. The dominant protein forming the moving junction is apical membrane antigen 1 (AMA1) that interacts with rhoptry neck (RON) protein complex on the surface of the red blood cells. AMA1 is a transmembrane protein residing on the surface of Plasmodium species with an N terminal extracellular domain and a short C-terminal cytoplasmic tail. The phosphorylation of this cytoplasmic tail regulates the function of AMA1 and is crucial in the invasion process. The C terminal tail of AMA1 is first phosphorylated by protein kinase A (PKA) and subsequently also by PfGSK3. Consequently, the inhibitors of GSK3 have been shown to impair host cell invasion of the parasite. Although PfGSK3 is an important drug target, its structure and means of regulation are unknown.
In our investigation, we have discovered two factors that regulate the activity of PfGSK3. I have found that PfGSK3 exhibits autophosphorylation, phosphorylating its residues in the activation loop and at the N terminus. We have shown that the N terminus of PfGSK3 is indispensable for its function and that the amount of N terminal phosphorylation positively correlates with PfGSK3 activity. Additionally, we found that bivalent heavy metal ions, such as those of zinc and copper, induce reversible formation of high molecular-weight species of PfGSK3 that are heterogeneous and enzymatically inactive. Thus, our work provide the first insights into processes that possibly regulate the function of PfGSK3 in vivo.Apicomplexa sind einzellige parasitäre Organismen, die Infektionserreger vieler menschlicher und tierischer Krankheiten sind. Zum Beispiel, die Arten der Plasmodien infizieren jedes Jahr über 200 Millionen und töten fast 400 Tausend Menschen mit Malaria. Toxoplasma Arten infizieren etwa 30 50% der Gesamtbevolkerung und obwohl sie für die meisten Menschen nicht gefährlich sind, stellen sie eine Bedrohung für immungeschwächte Patienten und schwangere Frauen dar. Andere Apicomplexa Arten sind Krankheitserreger bei domestizierten Tieren in Afrika und stellen dadurch eine finanzielle und humanitäre Belastungen dar.
Ein typischer Apicomplexa Parasit weißt einen anspruchsvollen Lebenszyklus auf, typischerweise wechselnd zwischen zwei Wirtsorganismen, um in einem die asexuelle Vermehrung und in dem anderen die sexuelle Reproduktion durchzuführen. Während des Lebenszyklus differenzieren sich die Parasiten in verschiedene Lebensstadien, welche immer eine einzigartige Form und Morphologie besitzen. Motile Lebensstadien, die das Gewebe penetrieren können, sind von besonderem Interesse, da die Parasit Zellen außerhalb der Wirtszellen exponiert sind. Die Parasiten sind folglich für die Interaktion mit dem Immunsystem des Wirts und für Arzneimitteln leichter zugänglich, wodurch die motile Lebensstadien und ihre Proteine wichtige Wirkstoffziele sind.
Um das Gewebe zu penetrieren und in die Wirtszellen einzudringen, verwenden Apicomplexa eine bestimmte Art der Motilität, die keine Änderung ihrer Form erfordert: das Gleiten. Viele Organellen und subzelluläre Strukturen der motilen Apicomplexa Stadien vermitteln ein effizientes Gleiten und Eindringen in die Wirtszellen. Diese Parasiten sind länglich und ihre Zellen sind polarisiert. Durch die Polarität formen sie einen apikalen Pol im vorderen Teil und ein basales Ende im hinteren Teil. Die Parasiten gleiten und dringen in apikaler Richtung in die Wirtszelle ein. Der apikale Pol enthält spezialisierte sekretorische Organellen, wie Mikronemen und Rhoptrien, die wichtige Virulenzfaktoren sekretieren, und für das Gleiten und die Invasion der Wirtszellen wichtig sind. Andere spezielle Organellen, Alveolen (auch als Innerer Membran Komplex, IMC, bezeichnet), bauen ein Netzwerk von großen flachen Vesikel unter der Plasmamembran der Parasiten auf, um den molekularen Motor zu beherbergen, der die Motilität und den Invasionsprozess antreibt.
Diese Arbeit fasst drei Manuskripte zusammen, die Fortschritte beim Verständnis der Prozesse darstellen, die für die Gleitmotilität und die Invasion von Wirtszellen durch Apicomplexa Parasiten wichtig sind.
In der ersten Arbeit (Manuskript 1) wurde die Struktur und Funktion Essentieller Leichtketten (essential light chains, ELCs) von Plasmodium falciparum und Toxoplasma gondii entdeckt. In Apicomplexa sind ELCs ein Teil eines größeren Proteinkomplexes zwischen der Plasmamembran des Parasiten und dem IMC, der als Glideosom bezeichnet wird. Das Glideosom besteht aus einem Myosin Motorprotein MyoA, zwei Leichtketten – ELC und Myosin-Leichkette 1 (MLC1) und drei Glideosom-assoziierten Proteinen (GAPs). Es war bereits bekannt, dass ELCs die Halsdomäne von MyoA binden und dadurch die Motoreffizienz verbessern. Der molekulare Mechanismus hinter diesem Effekt war jedoch unklar.
Wir haben gezeigt, dass die beiden T. gondii ELCs (TgELC1 und TgELC2), sowie auch P. falciparum ELC (PfELC) eine konservierte Sequenz der MyoA-Halsdomäne binden. Wir konnten die Strukturen aller ELCs gebunden in Trimerkomplexen mit den jeweiligen MyoA-Halsdomänen und MLC1s bestimmen. Diese sind die ersten atomoranen Strukturen der Trimerkomplexe des Glideosoms. Die Strukturen zeigen, dass der C Terminus von PfELC, der im ungebundenen Zustand teilweise ungeordnet ist, auch im Komplex ein gewisses Maß an Flexibilität beibehält, was zu einem unterschiedlichen Interaktionswinkel im Vergleich zu TgELCs führt und die geringere Affinität von PfELC zu MyoA im Vergleich zu T. gondii erklärt. Zusätzlich haben wir Aufschluss über die Rolle von ELCs in der Regulation des Glideosoms gegeben. Wir haben gezeigt, dass die Bindung der ELCs zu MyoA durch zwei Phosphorylierungsstellen reguliert werden kann. Darüber hinaus haben wir bewiesen, dass die Bindung von Kalzium die ELC-Bindung nicht reguliert, sondern nur die Stabilität der Trimerkomplexe erhöht. Zuletzt haben wir gezeigt, dass die ELCs bei der Bindung eine Sekundärstruktur im MyoA-Hals induzieren, was zu einem steiferen MyoA-Hals führt, der folglich effizienter als Hebelarm dient und den Motorumsatz erhöht.
In der zweiten Arbeit (Manuskript 2) haben wir uns mit der Rolle eines Rhoptrienproteins Armadillo Repeat-Only (ARO) und mit seinem mutmaßlichen Interaktionspartner ARO Interacting Protein (AIP) befasst. ARO wird auf der zytoplasmatischen Membranseite der Rhoptrien durch Palmitoylierung und Myristoylierung verankert. Für T. gondii wurde schon gezeigt, dass ARO für die korrekte Positionierung von Rhoptrien im apikalen Pol essentiell ist und dass es mit AIP1, Myosin F (MyoF) und Adenylatzyklase Beta (ACβ) interagiert. Wir sind deshalb der Frage nachgegangen, ob ein ähnliches Arrangement auch in P. falciparum existiert.
Dazu haben wir die Kristallstruktur von PfARO gelöst, die mit fünf sogenannten „Armadillo repeat“ Motiven eine bohnenförmige Konformation annimmt. Wir identifizierten das Plasmodium-Homolog von T. gondii AIP1 und zeigten dass die AIP1 Proteine nur in Apicomplexa vorhanden sind und ihre strukturelle Homologen in anderen Taxa fehlen. Weitere Untersuchungen der Proteinlokalisation, auch unter Verwendung von Hochauflösender Mikroskopie, zeigten, dass PfARO in P. falciparum nicht zusammen mit PfAIP lokalisiert ist, da PfARO in Rhoptrien-Bauch lokalisiert ist, während AIP1 in Rhoptrien Hals vorhanden ist. Andererseits führt die Deletion der konservierten Schleife von PfARO, die dank der gelösten Struktur identifiziert wurde, zu einer Fehllokalisierung von PfAIP. Dies deutet darauf hin, dass die beiden Proteine trotz allem assoziieren. Schließlich zeigte der bioID Pulldown-Assay, dass PfAIP, wie auch bei T. gondii, mit PfACβ und MyoF interagiert, jedoch nicht mit PfARO. Basierend auf diesen widersprüchlichen Ergebnissen schlagen wir zwei Modelle der PfARO PfAIP Interaktion vor, die mit unseren Daten übereinstimmen.
In der dritten Arbeit (Manuskript 3) wird die Struktur und Funktion der Glykogensynthase-Kinase 3 von P. falciparum (PfGSK3) untersucht. Humanes GSK3 reguliert verschiedene Prozesse wie den Glykogenstoffwechsel, den Zellzyklus und das Wachstum, die Translation, die Embryonalentwicklung oder die Differenzierung von Neuronen. Andererseits ist die Rolle von PfGSK3 schwer fassbar. Es wurde gezeigt, dass PfGSK3 einen Einfluss auf die Invasion von Parasiten hat. Während des Eindringens in den Wirtszellen bildet der Parasit sogenannte moving junction, eine Grenzfläche zwischen der parasitären Zelle und der Wirtszelle, durch die der Parasit in der Wirtszelle gleitet. Das Protein, das einen Großteil der moving junction bildet, ist das apikale Membranantigen 1 (AMA1), das mit dem Rhoptrien-Hals (RON) auf der Oberfläche der roten Blutkörperchen interagiert. AMA1 ist ein Transmembranprotein, das sich auf der Oberfläche von Plasmodium-Spezies befindet. Es besitzt eine N-terminale extrazelluläre Domäne und eine kurze C-terminale zytoplasmatische Sequenz. Die Phosphorylierung dieser zytoplasmatischen Sequenz reguliert die Funktion von AMA1 und ist für den Invasionsprozess von entscheidender Bedeutung. Die C-terminale Sequenz von AMA1 wird zuerst durch Proteinkinase A (PKA) und anschließend auch durch PfGSK3 phosphoryliert. Folglich wurde gezeigt, dass die Inhibitoren von GSK3 die Invasion der Wirtszellen durch den Parasiten beeinträchtigen. Obwohl PfGSK3 ein wichtiges Wirkstoffziel ist, sind Struktur und Regulationsmittel unbekannt.
In unserer Untersuchung wurden zwei Faktoren entdeckt, die die Aktivität von PfGSK3 regulieren. Ich habe festgestellt, dass PfGSK3 durch Autophosphorylierung im Protein selbst Aminosäurereste in der sogenannten Aktivierungsschleife und am N-Terminus phosphoryliert. Wir haben gezeigt, dass der N Terminus von PfGSK3 für die Funktion unverzichtbar ist und dass die Menge der N-terminalen Phosphorylierung positiv mit der PfGSK3-Aktivität korreliert. Zusätzlich fanden wir, dass zweiwertige Schwermetalle-Ionen, wie z. B. Zink und Kupfer Ionen, die reversible Bildung von PfGSK3-Spezies mit einem hohen Molekulargewicht induzieren. Diese Spezies sind heterogen und enzymatisch inaktiv. Unsere Arbeit liefert daher erste Einblicke in Prozesse, die möglicherweise die Funktion von PfGSK3 in vivo regulieren
Identification of novel antiplasmodial agents and validation of PfGSK3 as a potential drug target against malaria
No full textMit über 228 Mio. Infektionen im Jahr 2018, von denen ca. 405 000 tödlich verliefen, ist Malaria eine der bedeutendsten Infektionskrankheiten der Welt. Verursacht wird die Erkrankung durch Protozoen der Gattung Plasmodium, deren asexuelle Vermehrung in den roten Blutzellen für sämtliche klinischen Symptome der Malaria verantwortlich ist. Durch die globale Verbreitung von Multi-Drug-resistenten Parasiten und die Abwesenheit eines effektiven Impfstoffes stellt Malaria nach wie vor eine ernste Bedrohung der globalen Gesundheit dar, weshalb dringend neue antiplasmodiale Wirkstoffe benötigt werden.
Ziel der vorliegenden Arbeit war die Identifizierung und Validierung neuer antiplasmodialer Verbindungen sowie die Charakterisierung der plasmodialen Glykogen Synthase Kinase 3 (PfGSK3) als potentielles antiplasmodiales Drug Target, wobei diese Kinase eine wichtige Rolle bei der Regulation der Erythrozyteninvasion spielt.
Die Invasion von Erythrozyten stellt einen essentiellen Schritt während des parasitären Replikationszyklus dar und wird durch ein Zusammenspiel von hunderten Proteinen vermittelt. Hierbei spielen vor allem Oberflächenproteine eine wichtige Rolle, die durch eine Rezeptor-Liganden-Interaktion eine Bindung an die Wirtszelle ermöglichen. Somit stellt die Wirtszellinvasion einen geeigneten Interventionspunkt für die experimentelle Medikamentenentwicklung dar. Da der Parasit während der Invasion von Erythrozyten für eine kurze Zeit zugänglich für Antikörper des humanen Immunsystems ist, weisen viele der Invasions-beteiligten Proteine einen ausgeprägten Sequenzpolymorphismus auf, der dem Parasiten in der menschlichen Population das Überleben sichert. Eine Möglichkeit, diesen Immunevasionsmechanismus des Parasiten experimentell zu umgehen, stellt sich dar, wenn nicht die Rezeptor-Liganden Interaktion als konzeptioneller Angriffspunkt definiert wird, sondern die ihr zugrunde liegenden Regulationsmechanismen wie zum Beispiel die Phosphorylierung und Dephosphorylierung. Ein Beispiel hierfür ist der essentielle Invasionsligand AMA-1 (Apikales Membran Antigen 1), der mithilfe einer Phosphorylierungskaskade in seiner Aktivität reguliert wird. Hierbei sind mindestens zwei Kinasen beteiligt, namentlich Protein Kinase A und die Glykogen Synthase Kinase 3. Somit stellen auch Kinasen vielversprechende Drug Targets für neue antiplasmodiale Verbindungen dar.
In der vorliegenden Arbeit konnten neue Thieno[2,3-b]pyridin-Verbindungen als PfGSK3-spezifische Inhibitoren identifiziert werden, die eine IC50 zwischen 0,26 und 4,53 µM gegen rekombinante PfGSK3 und 0,6 und 9,4 µM gegen P. falciparum Parasiten aufweisen. Diese spezifischen Inhibitoren wurden in Kombination mit Reverse Genetics Strategien genutzt, um PfGSK3 genauer als antiplasmodiales Target zu validieren. Sowohl die Inhibitoren-basierten Ergebnisse als auch die genetischen Experimente unterstreichen die wichtige Rolle von PfGSK3 bei der Invasion von Erythrozyten durch den Parasiten.
Als Weiterentwicklung der PfGSK3-inhibierenden Thieno[2,3-b]pyridin-Verbindungen wurden zudem Thieno[2,3-b]pyridine-2-carboxamide als potentielle antiplasmodiale Verbindungen validiert. Die untersuchten Verbindungen zeichnen sich durch eine antiplasmodiale Aktivität im nanomolaren Konzentrationsbereich und eine über 100-fache Selektivität gegenüber humanen Zellen aus. Der Wirkmechanismus wird hierbei jedoch trotz strukturell starker Ähnlichkeit zu den Thieno[2,3-b]pyridin-Verbindungen nicht durch eine Hemmung der PfGSK3 vermittelt.
Zusätzlich wurde in der vorliegenden Arbeit ein neuer Naturstoff, PDE-I2 aus Streptomyces sp. als neuer antiplasmodialer Wirkstoff validiert. Dieser wurde mithilfe eines phänotypischen Screens der Wright Actinomycete Collection (WAC) identifiziert und durch mehrstufige Fraktionierungsansätze rein dargestellt. PDE-I2 stellt das Produkt einer unvollständigen Duocarmycin-Synthese in Streptomyces sp. dar. PDE-I2 zeichnet sich durch eine antiplasmodiale Aktivität im unteren nanomolaren Bereich (IC50: 30,9 nM) und eine 1100-fache Selektivität gegenüber humanen Zellen aus. Die Aktivität von PDE-I2 wird wie bei verwandten Verbindungen der Duocarmycin-Familie vermutlich durch Interaktion mit AT-reichen Regionen der genomischen DNA vermittelt.With over 228 million infections in 2018, of which about 405,000 were fatal, malaria is one of the most important infectious diseases in the world. The disease is caused by protozoan parasites of the genus Plasmodium, whose asexual reproduction within red blood cells is responsible for all clinical symptoms of malaria. Due to the global spread of multi-drug resistant parasites and the lack of an effective vaccine, malaria continues to pose a serious threat to global health, highlighting that new antiplasmodial agents are urgently needed.
The aim of the present work was to identify and validate new antiplasmodial compounds as well as to characterize the plasmodial glycogen synthase kinase 3 (PfGSK3) as a potential antiplasmodial drug target. This kinase plays an important role in the regulation of erythrocyte invasion.
The invasion of erythrocytes is an essential step during the parasitic replication cycle and is mediated by the interaction of hundreds of proteins. Parasite surface proteins play a particularly important role in this process, enabling binding to the host cell membrane through receptor-ligand interactions. Thus, host cell invasion represents a suitable intervention point for experimental drug development. Since the parasite is accessible to antibodies of the human immune system for a short period of time during the invasion of erythrocytes, many of the invading proteins exhibit a distinct sequence polymorphism that ensures the survival of the parasite in the human population. For drug development, instead of targeting the receptor-ligand interaction itself, one way to experimentally circumvent the immune evasion mechanism of the parasite is to target the underlying regulatory mechanisms such as phosphorylation and dephosphorylation. An example of this is the essential invasion ligand AMA-1 (Apical Membrane Antigen 1), whose activity is regulated by a phosphorylation cascade. At least two kinases are involved, namely protein kinase A and PfGSK3, making kinases promising targets for new antiplasmodial compounds.
In the present work new thieno[2,3-b]pyridine compounds were identified as PfGSK3-specific inhibitors. All new compounds had IC50 values between 0.26 and 4.53 µM against recombinant PfGSK3 and 0.6 and 9.4 µM against P. falciparum parasites. These specific inhibitors were used in combination with reverse genetics strategies to further validate PfGSK3 as an antiplasmodial target. Both the inhibitor-based results and the genetic experiments emphasise the important role of PfGSK3 in the invasion of erythrocytes by the parasite.
As a further development of the PfGSK3-inhibiting thieno[2,3-b]pyridine compounds, thieno[2,3-b]pyridine-2-carboxamides were also validated as potential antiplasmodial agents. The investigated compounds are characterized by an antiplasmodial activity in the nanomolar concentration range and a more than 100-fold selectivity towards human cells. However, the antiplasmodial effect is not mediated by an inhibition of PfGSK3 despite the strong structural similarity to the thieno[2,3-b]pyridine compounds.
In addition, a new natural compound, PDE-I2, from Streptomyces spp. was validated as a new antiplasmodial agent in the present study. This compound was identified using a phenotypic screen of the Wright Actinomycete Collection (WAC) and was purified by multi-step fractionation approaches. PDE-I2 represents the product of an incomplete duocarmycin synthesis in Streptomyces spp. PDE-I2 is characterized by an antiplasmodial activity in the lower nanomolar range (IC50: 30.9 nM) and a 1100-fold selectivity towards human cells. The activity of PDE-I2 is likely mediated by interactions with AT-rich regions of genomic DNA, as it was shown for related compounds of the duocarmycin family
Identifizierung und Charakterisierung Invasions-relevanter Proteine des Malaria Erregers Plasmodium falciparum (Welch, 1892)
No full textMalaria is a vector-borne disease, which is caused by a protist of the Plasmodium genus. Plasmodium spp. are obligate intracellular parasites with a complex life cycle that alters between a vertebrate and a mosquito host.
One of the essential steps in the vertebrate host is the asexual proliferation within the erythrocytes that allows the exponential multiplication of the pathogen and is responsible for all clinical symptoms in humans. To survive and multiply the parasite invades its host cell rapidly. It relies on an orchestrated cascade of molecular interactions between parasite ligands and surface structure on the erythrocyte. The aim of this work is i) to probe into the role of putative phosphorylation sites in the cytoplasmic domain of one well established parasite ligand called “Erythrocyte Binding Antigen 175” (EBA175) and ii) to identify novel parasite proteins that are secreted and might function as ligands during the invasion process.
Towards the first sub aim – I assessed six predicted phosphorylation sites within the cytoplasmic domain. To do so, I generated a transgenic parasite line with six amino acid exchanges targeting each of these putative phosphorylation sites. Using an assay that allows the quantification of EBA175 function, I could show that – in contrast to other parasite ligands – none of these putative phosphorylation sites are essential for protein function.
The second sub aim of my project focused on the identification of novel secreted proteins playing a role in the invasion process. Candidates were identified using bioinformatics tools that identified genes with i) a transcriptional profile similar to known parasite ligands and other host cell invasion related proteins and ii) encompass a predicted sequence coding for a signal peptide. This resulted in a list of 289 genes fulfilling these criteria out of which 156 were not characterized. Out of these, 38 genes with unpublished function were selected for further analyses. The first step in the functional investigation was the tagging of the genes of interest at the 3´end with GFP, which resulted in 29 transgenic parasite lines with a gene specific GFP tag. Using fluorescence microscopy in live parasites expression and localization of the fusion proteins were investigated and subdivided into five categories. 15 proteins could be localized to the invasion relevant compartments surface, inner membrane or basal complex, and apical organelles. In order to analyze the function of these 15 proteins a gene knock-out approach was initiated that already reveals that 6 proteins of these are redundant and 4 appear to be likely essential. Taking together, this approach allows the rapid identification of novel candidate gene that might play an important role in erythrocyte invasion.Malaria ist eine durch einen Vektor übertragene Infektionskrankheit, die durch einen intrazellulären Parasiten der Gattung Plasmodium ausgelöst wird. Plasmodien haben einen komplexen Lebenszyklus, der zwischen Wirbeltieren und Mücken alterniert. Ein wesentlicher Schritt dieses Lebenszyklus ist die asexuelle Vermehrung, die innerhalb von Erythrozyten im Wirbeltier-Wirt stattfindet. Sie ermöglicht eine exponentielle Vermehrung des Parasiten und ist für das Krankheitsbild der Malaria verantwortlich. Um zu überleben, ist eine schnelle Invasion in die Wirtszelle notwendig. Der Invasionsprozess ist sehr komplex und umfasst viele streng regulierte Wechselwirkungen zwischen Liganden des Parasiten und Rezeptoren auf der Oberfläche der Wirtszelle.
Ein wichtiger und gut charakterisierter Invasionsligand ist „Erythrocyte Binding Antigen 175“ (EBA175). Ziel dieser Arbeit war es zum einen, die Rolle von putativen Phoshphorylierungsstellen innerhalb der zytoplasmatischen Domäne von EBA175 zu untersuchen. Zum anderen sollten neue sekretierte Parasitenproteine identifiziert werden, die als Invasionsliganden in Frage kommen.
Um die Phosphorylierung der zytoplasmatischen Domäne von EBA175 zu untersuchen, wurde eine Zelllinie generiert, in welcher sechs vorhergesagte Phosphorylierungsstellen ausgetauscht wurden, um deren Phosphorylierung zu unterbinden. Mit Hilfe eines Invasionsassays wurde gezeigt, dass – im Gegensatz zu anderen Invasionsliganden des Parasiten – keine dieser putativen Phosphorylierungsstellen einen essentiellen Einfluss auf die Funktionalität des Liganden hat.
Das zweite Projekt zielte auf die Identifikation neuer sekretierter Proteine ab, die eine Rolle im Invasionsprozess spielen. Von anderen Invasionsliganden und Proteinen, die an der Invasion beteiligt sind, ist ein spätes Transkriptionsprofil bekannt. Mit Hilfe eines bioinformatischen Ansatzes wurde nach Kandidatengenen gesucht, die ein solches Profil und zusätzlich ein vorhergesagtes Signalpeptid aufweisen. Aus einer Liste von zunächst 289 Genen wurden 38 Kandidaten mit unbekannter oder nicht veröffentlichter Funktion ausgesucht, um diese weiter zu charakterisieren. Alle Kandidaten wurden zunächst C-terminal mit GFP fusioniert. Es konnten 29 transgene Zelllinien generiert werden, die fluoreszenzmikroskopisch untersucht wurden. Anhand ihrer Lokalisation und Expressionsrate wurden die Fusionsproteine in fünf Gruppen eingeteilt. 15 der Proteine wurden auf der Parasitenoberfäche, an dem Inneren Membran- und Basalkomplex, oder in den apikalen sekretorischen Organellen lokalisiert. All diese Kompartimente können mit der Invasion in Verbindung gebracht werden. Zur weiteren funktionellen Analyse wurde ein Gen-Knock-Out initiiert. Sechs der untersuchten Proteine konnten bereits als redundant eingestuft werden und vier der Kandidaten haben möglicherweise eine essentielle Funktion für den Parasiten.
Zusammenfassend ermöglicht dieser bioinformatische Ansatz die schnelle Identifizierung neuer Kandidatengene, die eine wichtige Rolle bei der Invasion des Parasiten in die Wirtszelle spielen könnten
Transcriptional regulation of virulence gene families in "Plasmodium falciparum"
Get PDFTo date, malaria caused by Plasmodium falciparum is still a major health threat. It contributes to illness and severe disease and is responsible for up to one million deaths per year. The intra-erythrocytic asexual life cycle stage is responsible for the pathology associated with malaria. The major virulence factor P. falciparum erythrocyte membrane protein 1 (PfEMP1) is exposed at the surface of infected red blood cells (iRBC) and mediates binding to endothelial cells. This leads to sequestration of iRBC in the microvasculature and consequently to evasion of removal in the spleen. PfEMP1 is encoded by the 60-member var gene family, which undergoes antigenic variation by in-situ switching. Importantly, var genes are expressed in a mutually exclusive way, such that only one member is expressed whereas all other copies remain silenced. var genes as well as other gene families such as rif, stevor, phist and pfmc-2tm are located in subtelomeric heterochromatic regions. The function of these additional families is largely unknown, but they are thought to be implicated in host-parasite interactions and to contribute to antigenic variation.
With this work, I provide deeper insights into the transcriptional regulation of virulence gene families in P. falciparum by using transfection-based approaches. We functionally identified autonomous cis-acting var promoter elements including an upstream activating sequence that is essential for promoter activation. Notably, an element downstream of the transcriptional start site determines mutually exclusive locus recognition. Further, I used comparative transcriptional profiling to show that mutually exclusive expression is restricted to the var gene family and is not used in the transcription of other subtelomeric gene families. I show for the first time that knock-down of endogenous var gene transcription is also conferred by promoters of a var gene subfamily that is implicated in severe malaria. Taken together, this work provides important insight into the mechanisms involved in the regulation of virulence gene families and antigenic variation in P. falciparum. Moreover, the findings presented here are consistent with a novel mechanism of mutually exclusive gene choice in eukaryotes
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