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Funktionelle Analyse des "Apikalen Membran Antigens 1" (AMA1) : Untersuchung zur Rolle der Phosphorylierung des Vakzinkandidaten im Malariaerreger Plasmodium falciparum (Welch, 1897)
No full textMalaria ist mit über 300 Million Neuinfektionen und etwa 1 Million krankheitsbedingter Todesfälle eine der bedeutendsten Infektionskrankheiten der Gegenwart.
Auslöser sind Parasiten der Gattung Plasmodium, welche in der Lage sind
Erythrozyten zu invadieren und zu modifizieren. Die Invasion ist ein präzise koordinierter Prozess, der auf der genauen Abfolge von Proteinsekretion und spezifischer Protein-Protein Interaktionen beruht. Rezeptor-Phosphorylierung scheint dabei ein wichtiger Regulationsmechanismus zu sein. Dies wurde unter Anderem für den Vakzinkandidaten "apikale membran antigen 1" (AMA1) gezeigt. Das Typ-I-Transmembranprotein bindet mit seiner extrazellulären Domäne an einen Rezeptor-Komplex in der Erythrozytenmembran, was die Voraussetzung für die Invasion der Wirtszelle durch den Parasiten ist. Es konnte außerdem gezeigt werden, dass die Phosphorylierung der zytoplasmatischen Domäne (CPD) von AMA1 an Serin 610 durch die Proteinkinase A (PKA) essentiell für die Funktion des Proteins ist. Mehrere unabhängige Untersuchungen konnten in der CPD von AMA1 neben S610 noch 5 weitere putative Phosphorylierungsstellen nachweisen.
Das Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung dieser zusätzlichen Phosphorylierungsstellen in Hinsicht auf deren physiologische Funktion und die identifizierung der verantwortlichen Kinase(n). Durch die Herstellung von Substitutionsmutanten konnte gezeigt werden, dass die Serine S588, S601 und S590 in vivo keinen Einfluss auf die Funktion von AMA1 während der Erythrozyteninvasion
haben. Dies steht im Gegensatz zu den Mutationen der Threonine T612 und
T613, die zu einer 40 %igen bzw. 70 %igen Invasionsinhibition führten. Es konnte gezeigt werden, dass die quantitative Phosphorylierung von T613 erst nach der initialen Phosphorylierung von S610 durch die cAMP-abhängige ProteinkinaseA nachweisbar ist. Als potenzielle Kinase für die T613-Phosphorylierung wurde die "Glykogen Synthase Kinase 3" (GSK3) genauer charakterisiert, da der Bereich
um T613 einer GSK3 Substrat-Erkennungsstelle ähnelt. Die GSK3 kann
vor-phosphoryliertes Substrat weiter phosphorylieren, wird im intraerythrozytären Zyklus exprimiert und ist für diesen essentiell. Es konnte gezeigt werden, dass die rekombinante GSK3 AMA1 T613-abhängig phosphoryliert und dass das Enzym in Schizonten zytosolisch exprimiert wird. Die Aktivierung von AMA1 scheint somit ein Zwei-Stufen-Prozess zu sein, in dem nicht nur die PKA sondern auch die GSK3 eine entscheidende Rolle spielt
Optimales Fitting von Proteinstrukturen in Elektronenmikroskopie-Dichteverteilungen
No full textIn dieser Dissertation wird die Rolle des systematischen Fittings im Kontext des integrativen strukturellen Modelings betrachtet. Diese Art des Modelings dient dazu, Modelle von makromolekularen Komplexen aus verschiedenen Datenquellen zu generieren und ist zum Beispiel in Form der Softwarepipeline Assembline implementiert. Die Datentypen, welche integriert werden, umfassen neben Eektronendichtekarten, welche aus der Kryoelektronenmikroskopie und der Kryoelektronentomographie gewonnen wurden, auch Kristallstrukturen von Komplexen, Proteinen, RNA-Strukturen und Protein-Untereinheiten sowie Crosslinks und biochemische Informationen. Das systematische Fitting ist der erste Schritt in der Assembline Softwarepipeline und stellt ein Ensemble möglicher Positionen und Orientierungen der Strukturen, aus welche sich der makromolekulare Komplex zusammensetz, zur Verfügung. Aus diesen möglichen Positionen und Orientierungen wird in der weiteren Pipeline eine Anzahl von wahrscheinlichen Modellen generiert. Das systematische Fitting kann, im Rahmen der Assembline pipeline, als einer der informationsreichsten Quellen angesehen werden. Es gibt eine Anzahl von Möglichkeiten, wie man das systematische Fitting durchführen kann. Von Fall zu Fall können die Ergebnisse sehr unterschiedlich ausfallen. Diese Arbeit untersucht die Frage, wie ein Maximum an Information aus den gegebenen Daten gewonnen werden kann und welche computerwissenschaftlichen, numerischen und mathematischen Konzepte genutzt werden können, um das Modellieren von biomolekularen Komplexen zu optimieren. Verschiedene Modellingprojekte wurden in verschienden Kapazit aten begleitet. Die Strukturbestimmung des TFIIIC-Komplexes (Transkriptionsfaktoruntereinheit C des Pr ainitiationskomplexes der Polymerase III in Eukaryoten) wurde sowohl durch systematisches Fitting als auch strukturelles integratives Modelling unterstützt. Obwohl die Gesamtstruktur des TFIIIC nicht bestimmt werden konnte, konnte die Struktur des Subkomplexes A ermittelt werden. Für die zum Subcomplex B gehörigen Domäne Brf1-TBP und A konnten schliesslich wahrscheinliche Positionen und Orientierungen in einer negative stain Elektronendichtekarte von TFIIIC bestimmt werden ([83]). In einem weiterem Modellingprojekt ist es gelungen einen Subkomplex, den sogenannte P-Komplex, in einem in-situ Tomogram einer Speiche der Kernpore in s. cerevisia wahrscheinliche Positionen und Orientierungen durch systematisches Fitting zuzuordnen. Hier wurde programmatische Werkzeuge zur einfacheren Auswertung der statistischen Analyse des systematischen Fittings implementiert und eine Analyse und Rechtfertigung der verschiedenen Scoring-Optionen im systematischen Fitting zur Verfügung gestellt ([85]). Die Assembline Software pipeline wurde erstmals der Öffentlichkeit zugänglich gemacht, zusammen mit ausführlichen Beispielen und Anleitungen, um die Benutzung zu vereinfachen. Hier wurden ein neues Konvergenzkriterium implementiert, welches unnötige lange Monte-Carlo-L aufe verhindert([26]). Desweiteren wurden die grundlegenden Datentypen und einige der Algorithmen, welche im systematischen Fitting essentiell sind, auf modernen GPU(Graphical Processing Unit)-Systemen implementiert und getestet. Hierbei wurde darauf geachtet, die spezifischen Eigenheiten der GPU-Architektur zu gut wie möglich auszunutzen und die Nutzung mehrer GPUs in großen Clustern zu ermöglichen. Methoden der numerischen Mathematik wurden genutzt, um dem systematischen Fitting verfeinerbare, 6-dimensionale Suchgitter zur Verfügung zu stellen. Diese ermöglichen zudem das berechnen 6-dimensionaler Statistiken, welche das gewählte Fittingprotokoll als Gesamtes charakterisiert. Desweiteren wurde die partial-surface-score als Scoring Methode eingeführt, welche insbesondere unvollständige Oberachensegmente fitten kann. Ein erschöpfender adaptiver paralleler Suchalgorithmus für 6-dimensionale Räume wurde beschrieben, implementiert und getestet im Fall von TFIIIC. Das erwartete lokale Minimum wurde erfolgreich gefunden in einer Zeit von ca 1:8 s. Methoden der Informationstheorie wurden benutzt, um das Ergebnis eines systematischen Fittingprotokolls (im obigen Sinne) auf seinen Informationsgehalt zu uberprüfen. Somit wurde ein Kriterium erschaffen,mit dem sich informationsreichere von informations armeren Fittingprotokollen unterscheiden lassen. Dies wurde an zwei konkreten Probleme getestet: Der Unterscheidung des Informationsgehaltes zweier verschiedener Scoringmethoden und der Optimierung des Informationsgehaltes einer Scoringmethode mit Hinsicht auf einen Parameter
Description of characteristic genes and potential transcription factors of Il22ra2-expressing cells
No full textDoctoral dissertation in the field of biology
The dysregulation of BRCA1, PTEN, or CHK1 influences therapy resistance of breast cancer cells by affecting DNA repair and DNA replication stress signaling
No full textBreast cancer is the most frequently diagnosed cancer worldwide. Despite good available therapeutic options, more than half a million women still die each year due to breast cancer. A major reason contributing to this high number is the development of therapy resistances. Thus, identification of proteins and associated pathways that are involved in resistance development are a focus of the cancer research field. A common mechanism by which tumor cells become resistant to therapy is their tolerance to genomic instability, which leads to accumulation of tumor-promoting mutations. DNA replication stress and defects in DNA repair pathways have been shown to contribute to genomic instability, thereby supporting the development of resistance to chemotherapeutics and radiotherapy. Since increased replication stress is a hallmark of cancer cells, it has been identified as a promising target for new therapeutic approaches. The aim of this thesis was to exploit how the replication stress response contributes to therapy resistance, depending on the dysregulation of the three selected candidate proteins BRCA1, PTEN, and CHK1. BRCA1 is a key protein of the DNA repair pathway homologous recombination and involved in DNA replication fork protection of stalled forks. An isogenic MCF7 BRCA1 mutated cell system with therapy resistant and sensitive clones was generated. The observed resistance to different DNA damaging sources correlated to low level of replication stress, efficient DNA repair and high CHK1 activation. CHK1, one of the main proteins of the replication stress response and highly expressed in chromosomal unstable tumors, counteracts exogenously induced replication stress by anti-cancer therapies. Similar results were observed in BRCA1 proficient MDA-MB-231 cells with resistant and sensitive sublines. An inhibition of the ATR-CHK1 axis led to sensitization of the resistant cell lines. PTEN prevents genomic instability through association with replication forks. Analysis of the TCGA dataset revealed that a low PTEN expression correlated with a high chromosomal instability score and significantly worse overall survival in breast cancer patients. Low PTEN expression was associated with increased replication stress, manifested by increased origin firing in several breast cancer cell lines. Additionally, PTEN expression correlated with the fork stability upon replication stress induction. The elevated replication stress led to increased sensitivity against PARP1 inhibition. The observed results show that the replication stress response is a suitable target to sensitize resistant cancer cells to radio- and chemotherapy, which was independent of the analyzed breast cancer subtype and BRCA status. This suggests that a wide range of breast cancer patients could benefit from combination therapies that target the replication stress response.Brustkrebs ist weltweit die am häufigsten diagnostizierte Krebsart. Trotz guter Behandlungsmöglichkeiten sterben mehr als eine halbe Million Frauen jedes Jahr daran. Ein Grund für diese hohe Zahl ist die Entstehung von Therapieresistenzen. Die Identifizierung von Proteinen und damit verbundenen Signalwegen, die an der Resistenzentwicklung beteiligt sind, ist daher ein Schwerpunkt der Krebsforschung. Genomische Instabilität von Tumorzellen begünstigt das Auftreten weiterer tumorfördernder Mutationen und daraus resultierende Resistenzen. DNA-Replikationsstress und Defekte in der Reparatur von DNA-Schäden tragen zur genomischen Instabilität bei und begünstigen die Entwicklung von Chemo- und Strahlenresistenz. Da erhöhter Replikationsstress ein Merkmal von Krebszellen ist, ist es ein vielversprechendes Ziel für neue therapeutische Ansätze. Das Ziel dieser Arbeit war es, den Beitrag der Replikationsstressreaktion für die Therapieresistenz, in Abhängigkeit von der Deregulierung der drei Kandidatenproteine BRCA1, PTEN und CHK1 zu untersuchen. BRCA1 ist ein Schlüsselprotein des DNA-Reparaturweges homologe Rekombination und beteiligt am Schutz vom angehaltenen DNA-Replikationsgabeln. Es wurde ein isogenes MCF7 BRCA1-mutiertes Zellsystem mit therapieresistenten und -empfindlichen Klonen erzeugt. Die beobachtete Resistenz korrelierte mit geringem Replikationsstress, effizienter DNA-Reparatur und erhöhter CHK1-Aktivierung. CHK1, eines der wichtigsten Proteine der Replikationsstressreaktion, wirkt durch hohe Expression dem durch Krebstherapien induziertem Replikationsstress entgegen. Diese Beobachtungen konnten in BRCA1-kompetenten MDAMB-231-Zellen mit resistenten und empfindlichen Sublinien bestätigt werden. Eine Inhibition der ATR-CHK1-Achse führte zur Sensibilisierung der resistenten Zelllinien. PTEN verhindert eine genomische Instabilität durch Assoziation mit Replikationsgabeln. Eine Analyse des TCGA-Datensatzes ergab, dass eine niedrige PTEN-Expression mit hoher chromosomalen Instabilität und einer signifikant schlechteren Gesamtüberlebensrate bei Brustkrebspatientinnen korreliert. Verschiedene Zelllinien mit niedriger PTEN-Expression wiesen erhöhten Replikationsstress auf, der sich durch die vermehrte Aktivierung von ruhenden Replikationsursprüngen äußerte. Darüber hinaus wurde eine Korrelation von PTENExpression und Stabilität der Replikationsgabel nach Induktion von Replikationsstress beobachtet. Erhöhter Replikationsstress führte zu einer höheren Empfindlichkeit gegenüber PARP1-Inhibition. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Replikationsstressreaktion ein geeignetes Ziel ist, um resistente Krebszellen gegenüber Radio- und Chemotherapie zu sensibilisieren, unabhängig vom Brustkrebs-Subtyp und BRCA Status. Dies deutet darauf hin, dass ein breites Spektrum von Brustkrebspatientinnen von Kombinationstherapien profitieren könnte, die auf die Replikationsstressreaktion abzielen
Establishment of cell lines expressing erythrocyte membrane protein 1 (PfEMP1) variants of choice to study Plasmodium falciparum cytoadherence associated functions
No full textMalaria, caused by a unicellular eukaryotic apicomplexan parasite of the genus Plasmodium, remains a leading cause of morbidity and mortality globally. The pathological most relevant species for humans is Plasmodium falciparum which is responsible for almost all of the malaria related deaths. The symptoms of the disease are exclusively caused by the asexual stages of the parasite’s life cycle, during which the parasites multiply in erythrocytes of the host. Erythrocytes infected with P. falciparum can cytoadhere to various host receptors and ligands on the endothelium to evade the removal of the infected erythrocytes in the spleen. This can lead to blockage and inflammation of blood vessels, cutting off tissue from oxygen support, and resulting in severe forms of the disease, such as cerebral malaria. The interaction of infected erythrocytes with the host´s endothelium is mediated by a large parasite encoded transmembrane protein presented on the erythrocyte surface termed Plasmodium falciparum erythrocyte membrane protein 1 (PfEMP1). PfEMP1 variants possess differing binding properties and are expressed by a multigene family, the var genes. The expression of var genes in the parasite is mutually exclusive so that a parasite expresses only a single var gene. Furthermore, the parasites can switch their var gene expression over time, enabling the parasites to persistently evade the host´s immune system, facilitating long lasting infections. PfEMP1 is considered a key factor for the parasite’s virulence and survival, rendering it as the main virulence factor of P. falciparum parasites. However, the study of specific PfEMP1 variants and var genes has been hampered by PfEMP1s large size and the fact that parasite in vitro cultures are a mix of parasites expressing different PfEMP1s, making them inaccessible to genetic manipulation and molecular analysis.
In this thesis, selection linked integration (SLI) was exploited to generate cell lines that express a single HA-tagged PfEMP1 of choice in the entire population of parasites in an in vitro culture. The predominant expression of targeted var genes were validated for transgenic 3D7 and IT4 (formerly FCR3) lab strains by bulk RNA sequencing. The trackability of the HA-tagged PfEMP1s in the cell was demonstrated with immunofluorescence assays. Trypsin cleavage assays confirmed the surface presentation of the targeted PfEMP1 variant in most cases. SLI modified 3D7 and IT4 parasites expressing VAR2CSA or a CD36-binding PfEMP1 variant on the erythrocyte surface were tested and compared for binding against corresponding ligands. This provided empirical evidence that the IT4 strain is superior for the study of PfEMP1-mediated binding while 3D7 parasites only showed poor binding. To increase binding assay throughput and comparability, a semi-automated pipeline was developed for standardized evaluation of binding assays.
Furthermore, PfEMP1 variants were activated in IT4 parasites that showed specific binding against the major endothelial cell receptors CD36, ICAM-1 and EPCR, validating the feasibility of this approach. These cell lines are expected to facilitate the study of the binding properties of different PFEMP1 variants without the need to subject the parasites to elaborate receptor or antibody selection procedures. This will enable the comparison of binding capacities and to explore potentially novel interacting receptors of specific PfEMP1 variants.
The trackability of the HA-tagged PfEMP1 was further exploited to study PfEMP1 transport into the host cell in 3D7 parasites. In order to do this, an approach to conditionally block protein transport through PTEX, the translocon pumping exported proteins into the host cell, was chosen. When PTEX was blocked, PfEMP1 was no longer exported. The timing of this approach in the parasite blood cycle was chosen in a way to minimize the effect of accessory factors needed for PfEMP1 transport which would indirectly lead to a failure of PfEMP1 export. Overall, these experiments indicated that PfEMP1 is transported by PTEX into the host cell.
Next, BioID experiments were conducted to determine the proxiome of PfEMP1 in living parasites. For this the biotin ligase BirA* was fused to three distinct positions of PfEMP1, resulting in three different cell lines. Testing of the cell lines expressing the PfEMP1-BirA* fusions showed that the modified PfEMP1s were predominantly expressed in the parasite cultures and functionally presented on the host cells surface, exhibiting binding against the expected receptors. Large scale BioID experiments with subsequent mass spectrometry analysis of biotinylated proteins identified proteins shown to be important for PfEMP1s transport and function as well as previously characterized and uncharacterized proteins of the Maurer´s clefts, erythrocyte membrane and other host cell structures. The proxiome of the three positions showed marginal differences to each other, indicating that PfEMP1 is not transported as an integral membrane protein. Furthermore, only partial overlap with a Maurer’s clefts proxiome indicated the detected hits were PfEMP1-specific. Notably six exported proteins with unknown function previously not linked to cytoadherence were identified and termed PfEMP1-interacting candidate 1-6 (EMPIC1-6).
Subsequently, a modified version of SLI, SLI2, was utilized to introduce a second endogenous modification to the cell lines harboring a SLI-activated var gene. This was used to disrupt candidate proteins identified in the proxiome to evaluate their role in PfEMP1-mediated cytoadherence. The evaluation of PfEMP1 presentation and function with trypsin cleavage assays and binding assays led to the discovery of two novel proteins that are needed for the efficient cytoadherence of P. falciparum parasites despite the fact that their disruption did not ablate PfEMP1 surface transport.
In summary, this thesis -by utilizing SLI techniques - successfully generated and validated cell lines expressing specific PfEMP1 variants, which is expected to substantially aid studies on the interaction between these proteins and host cell receptors, var gene switching mechanisms and transport of PfEMP1. This work not only advances our understanding of P. falciparum´s main virulence factor but also opens new avenues to illuminate the cellular mechanisms that enable cytoadherence, leading to a better understanding of the parasite-host interactions.Malaria wird durch einen einzelligen eukaryotischen Apicomplexa-Parasiten der Gattung Plasmodium verursacht und bleibt weltweit eine führende Ursache für Morbidität und Mortalität. Die für den Menschen pathologisch relevanteste Spezies ist Plasmodium falciparum, welche für fast alle Malaria-bedingten Todesfälle verantwortlich ist. Die Symptome der Krankheit werden ausschließlich durch die asexuellen Stadien des Lebenszyklus des Parasiten verursacht. Während dieser vermehrt sich der Parasiten in den Erythrozyten des Wirts. Erythrozyten, die mit P. falciparum infizierte sind, können an verschiedene Rezeptoren und Liganden des Wirts auf den Endothelzellen zytoadhärieren, wodurch diese der Zerstörung durch die Milz entgehen. Dies kann zu Entzündungen bis hin zum Verschluss der Blutgefäße führen, wodurch Gewebe von der Sauerstoffversorgung abgeschnitten wird. Dies führt zu schweren Formen wie zum Beispiel Malaria, einer der schwersten Komplikationen dieser Infektion. Die Interaktion infizierter Erythrozyten mit den Endothelzellen des Wirts wird durch ein großes auf der Oberfläche der Erythrozyten präsentiertes Parasite-Transmembranprotein hervorgerufen, bekannt als P. falciparum erythrocyte membrane protein 1 (PfEMP1). Verschiedene PfEMP1-Varianten besitzen unterschiedliche Bindungseigenschaften und werden von einer Multigenfamilie, den var-Genen, kodiert. Die Expression von var-Genen im Parasiten ist sich gegenseitig ausschließend, das heißt, dass ein Parasit jeweils nur ein einzelnes var-Gen exprimiert. Außerdem verändern die Parasiten ihre var-Gene expression über die Zeit. Dies ermöglicht es den Parasiten, dauerhaft dem Immunsystem des Wirts zu entgehen und langanhaltende Infektionen zu manifestieren. PfEMP1 wird deshalb als Schlüsselfaktoren für die Virulenz und das Überleben des Parasiten angesehen, weshalb dieser als Hauptvirulenzfaktor von P. falciparum-Parasiten bezeichnet werden. Die Untersuchung spezifischer PfEMP1-Varianten und var-Gene wird durch die große Größe von PfEMP1 sowie durch die Tatsache erschwert, dass Parasiten in In-vitro-Kulturen eine Mischung von var-Genen exprimieren. Dies macht sie für genetische Manipulationen und molekulare Analysen schwer zugänglich.
In dieser Dissertation wurde das Selection Linked Integration (SLI)-System genutzt, um Zelllinien zu generieren, die in der gesamten Parasitenpopulation einer in-vitro-Kultur ein einzelnes erwünschtes HA-markiertes PfEMP1 exprimieren. Die Expression der Ziel-var-Gene wurde für transgene SLI-Parasitenpopulationen durch Bulk-RNA-Sequenzierung validiert. Die HA-markierten PfEMP1s konnte in der Zelle mit Immunfluoreszenzexperimenten lokalisiert werden und der Oberflächenproteinverdau mit Trypsin bestätigte für die meisten Zelllinien die Oberflächenpräsentation der modifizierten PfEMP1-Variante. Es wurden zwei P. Falciparum Laborstämme mit SLI-modifiziert, 3D7 und IT4 (ehemals FCR3), die VAR2CSA oder eine CD36-bindende PfEMP1-Variante auf der Oberfläche der Erythrozyten exprimierten, wurden auf ihre Bindungseigenschaften verglichen, indem ihre Bindung gegenüber entsprechenden Liganden getestet wurden. Dies lieferte empirische Hinweis dafür, dass der IT4-Parasitenstamm für die Untersuchung von PfEMP1-Bindungen geeigneter ist als der 3D7-Parasitentamm, welcher lediglich schwache Bindung zeigte. Um den Durchsatz und die Vergleichbarkeit von Bindungsexperimenten zu verbessern, wurde eine semi-automatisierte Pipeline für eine standardisierte Auswertung von Bindungsexperimenten entwickelt.
Darüber hinaus wurden in IT4-Parasiten PfEMP1-Varianten aktiviert, welche eine spezifische Bindung gegen die prominentesten interagierenden Zellrezeptoren, CD36, ICAM-1 und EPCR zeigten. Dies validierte die Zuverlässigkeit des SLI-Systems für diese Anwendungen. Es ist zu erwarten, dass diese Zelllinien die Erforschung der Bindungseigenschaften verschiedener PfEMP1-Varianten vereinfachen, da diese Parasiten ohne Rezeptor- oder Antikörperselektion generiert wurden. Dies ermöglicht den Vergleich der Bindungskapazitäten und die Erforschung potenzieller neuer interagierender Rezeptoren spezifischer PfEMP1-Varianten.
Des Weiteren wurde die Möglichkeit das HA-markierten PfEMP1 in der Zelle zu lokalisieren genutzt, um den Transport von PfEMP1 in die Wirtszelle bei 3D7-Parasiten zu untersuchen. Zu diesem Zweck wurde der Proteinexport durch das PTEX-Translocon, welches exportierte Proteine in die Wirtszelle transloziert, induzierbar blockiert. Bei einer Blockierung von PTEX, wurde PfEMP1 nicht mehr in die Wirtszelle exportiert. Der Zeitpunkt der Blockierung wurde im asexuellen Zyklus so induziert, dass früh exportierte Proteine, die potenziell für den PfEMP1-Transport benötigt werden, nicht beeinflusst wurden, da diese indirekt den Export von PfEMP1 beeinflussen könnten. Insgesamt deuten die Ergebnisse dieser Experimente darauf hin, dass PfEMP1 durch PTEX in die Wirtszelle transloziert wird.
Außerdem wurden BioID-Experimente durchgeführt, um Proteine in der Umgebung (Proxiom) von PfEMP1 in lebenden Parasiten zu identifizieren. Dafür wurde die Biotin-Ligase BirA* an drei unterschiedliche Positionen von PfEMP1 fusioniert, wodurch drei verschiedenen Zelllinien hergestellt wurden. Für diese Zelllinien wurde gezeigt, dass die PfEMP1-Varianten mit dem fusionierten BirA* prädominant in der Parasitenkulturen exprimiert und auf der Oberfläche der Wirtszellen präsentiert wurden. Des Weiteren wurden die Bindung der modifizierten PfEMP1 gegen die erwarteten Rezeptoren zeigten. BioID-Experimente im großen Maßstab mit anschließender Massenspektrometrie-Analyse der biotinylierten Proteine identifizierten Proteine, die für den Transport und die Funktion von PfEMP1 relevant sind. Darüber hinaus wurden zuvor charakterisierte und nicht charakterisierte Proteine der Maurer´schen Spalten, der Erythrozytenmembran und anderer Strukturen der Wirtszelle detektiert. Das Proxiom der drei Positionen zeigte nur kleine Unterschiede zueinander, was darauf hinweist, dass PfEMP1 nicht als integrales Membranprotein transportiert wird. Darüber hinaus deutete eine nur teilweise Überlappung mit einem Proxiom der Maurer´schen Spalten darauf hin, dass die detektierten Proteine PfEMP1-spezifisch waren. Dadurch wurden sechs exportierte Proteine mit unbekannter Funktion, die zuvor nicht mit Zytoadhärenz in Verbindung gebracht wurden, identifiziert und als PfEMP1-Interacting Candidate 1-6 (EMPIC1-6) benannt.
Des Weiteren wurde eine modifizierte Version von SLI, SLI2, angewandt, um eine zweite endogene Modifikation in den Zelllinien einzubringen, die bereits ein SLI-aktiviertes var-Gene beherbergten. Dies wurde verwendet, um die Funktion von Kandidatenproteine, die im Proxiom identifiziert wurden, zu trunkieren und deren Rolle im Transport und Oberflächenpräsentation von PfEMP1 zu ermitteln. Dies führte zur Identifizierung von zwei neuen Proteinen, die in Oberfächenproteinverdau- und Bindungsexperimenten zeigten, dass diese Kandidaten relevant für die effiziente Zytoadhärenz von P. falciparum-Parasiten sind. Jedoch wurde der Transport von PfEMP1 an die Oberfläche durch die Disruption der Kandidatenproteine nicht beeinflusst.
Zusammenfassend hat diese Dissertation - durch die Nutzung von SLI-Techniken - erfolgreich Zelllinien generiert und validiert, die spezifische PfEMP1-Varianten exprimieren Es ist zu erwarten, dass dies die Studien über die Interaktion dieser Proteine mit Wirtszellrezeptoren, var-Gen-Expressionsmechanismen und den Transport von PfEMP1 erheblich vereinfachen wird. Diese Arbeit erweitert nicht nur unser Verständnis des Hauptvirulenzfaktors von P. falciparum, sondern eröffnet auch neue Wege, um die zellulären Mechanismen der Zytoadhärenz zu beleuchten, was dabei helfen wird, die Parasiten-Wirt-Interaktion besser zu verstehen
Functional characterisation of essential, nuclear Plasmodium falciparum proteins reveals conserved and unique roles in mitosis during blood-stage schizogony of malaria parasites
No full textCharakterisierung der Funktion von Proteinen, die eine Rolle bei der Mitose im Blutstadium des Malariaparasiten Plasmodium falciparum spielen. Dies zeigte auf, dass die Mitose des Parasiten teils konservierte, aber auch spezielle und angepasste Prozesse beinhaltet
Sequenzspezifische Rekrutierung von Proteinen zum "Inneren Membrankomplex" des Malariaparasiten (Welch, 1897)
No full textEin neues genetisches System zur Analyse essenzieller Proteine des humanen Malaria Erregers Plasmodium falciparum
No full textRole of the C-type lectin receptor MINCLE in recognition of Strongyloides ratti and initiation of anti-helminth immune responses
No full textStrongyloides ratti is a parasitic nematode with tissue migrating and intestinal life stages. Recognition of pathogens and initiation of immune responses is promoted by interaction between pattern-recognition-receptors (PRRs) on immune cells and pathogen-associated-molecular-patterns (PAMPs) present on the parasite. Screening a crude S. ratti-derived protein lysate against a library of C-type lectin receptors (CLR), an ancient family of PRR, we found that Macrophage-inducible-C-type lectin receptor (MINCLE) binds immobilized S. ratti lysate and activates a MINCLE expressing reporter cell line. As this suggests presence of agonistic MINCLE-ligands in the S. ratti lysate, we analysed a putative function for MINCLE in vivo. Strikingly, MINCLE-deficient (KO) mice displayed reduced intestinal S. ratti parasite burden compared to their wildtype (WT) mice, suggesting an improved and not the expected impaired host defence in the absence of a stimulating PRR. To elucidate, which effector cell expressing MINCLE might be responsible for this protective immunity, we show that eosinophils and neutrophils represent the dominant MINCLE expressing cell population in vivo. Comparing their function in vitro, WT and MINCLE KO granulocytes inhibited motility of S. ratti third stage larvae (L3), indicating potential killing of L3. However, MINCLE-deficient eosinophils showed significantly increased capacity to impair S. ratti motility. These cells also produced more reactive oxygen species (ROS) compared to the WT. Therefore, indicating that, MINCLE-mediated signalling changes the function of eosinophils during S. ratti infection. Thus, expression of MINCLE on eosinophils protect S. ratti from immune response by host and as a result, contributing to high parasite adults in the intestine
Identifizierung und funktionelle Analyse von Proteinen, die an der Aufnahme des menschlichen Malariaparasiten Plasmodium falciparum in das Zytosol der Wirtszelle beteiligt sind
No full textIdentifizierung und funktionelle Analyse von Proteinen, die an der Aufnahme des menschlichen Malariaparasiten Plasmodium falciparum in das Zytosol der Wirtszelle beteiligt sin
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