77 research outputs found
Neurotransmitter Vesicle Release from Human Model Neurons (NT2) is Sensitive to Botulinum Toxin A
No full textBotulinum neurotoxins (BoNTs) internalize into nerve terminals and block the release of neurotransmitters into the synapse. BoNTs are widely used as a therapeutic agent for treatment of movement disorders and recently gained more attention as a biological weapon. Consequently, there is strong interest to develop a cell-based assay platform to screen the toxicity and bioactivity of the BoNTs. In this study, we present an in vitro screening assay for BoNT/A based on differentiated human embryonal carcinoma stem (NT2) cells. The human NT2 cells fully differentiated into mature neurons that display immunoreactivity to cytoskeletal markers (beta III-tubulin and MAP2) and presynaptic proteins (synapsin and synaptotagmin I). We showed that the human NT2 cells undergo a process of exo-endocytotic synaptic vesicle recycling upon depolarization with high K+ buffer. By employing an antibody directed against light chain of BoNT/A, we detected internalized toxin as a punctate staining along the neurites of the NT2 neurons. Using well-established methods of synaptic vesicle exocytosis assay (luminal synaptotagmin I and FM1-43 imaging) we show that pre-incubation with BoNT/A resulted in a blockade of vesicle release from human NT2 neurons in a dose-dependent manner. Moreover, this blocking effect of BoNT/A was abolished by pre-adsorbing the toxin with neutralizing antibody. In a proof of principle, we demonstrate that our cell culture assay for vesicle release is sensitive to BoNT/A and the activity of BoNT/A can be blocked by specific neutralizing antibodies. Overall our data suggest that human NT2 neurons are suitable for large scale screening of botulinum bioactivity.Federal Ministry for Education and Research (BMBF) [0313732
Looking at Developmental Neurotoxicity Testing from the Perspective of an Invertebrate Embryo
No full textDevelopmental neurotoxicity (DNT) of chemical compounds disrupts the formation of a normal brain. There is impressive progress in the development of alternative testing methods for DNT potential in chemicals, some of which also incorporate invertebrate animals. This review briefly touches upon studies on the genetically tractable model organisms of Caenorhabditis elegans and Drosophila melanogaster about the action of specific developmental neurotoxicants. The formation of a functional nervous system requires precisely timed axonal pathfinding to the correct cellular targets. To address this complex key event, our lab developed an alternative assay using a serum-free culture of intact locust embryos. The first neural pathways in the leg of embryonic locusts are established by a pair of afferent pioneer neurons which use guidance cues from membrane-bound and diffusible semaphorin proteins. In a systematic approach according to recommendations for alternative testing, the embryo assay quantifies defects in pioneer navigation after exposure to a panel of recognized test compounds for DNT. The outcome indicates a high predictability for test-compound classification. Since the pyramidal neurons of the mammalian cortex also use a semaphorin gradient for neurite guidance, the assay is based on evolutionary conserved cellular mechanisms, supporting its relevance for cortical development
Biologische Wirkungen von nanostrukturiertem Carbon Black auf pulmonale Zielzellen
No full textNanostrukturiertes Carbon Black gehört mit einer jährlichen Produktionsmenge von 8,1 Megatonnen (INTERNATIONAL CARBON BLACK ASSOCIATION 2006) zu den 50 meist produzierten Chemikalien weltweit (DATA NANOMATERIALS 2011). In eine Vielzahl von Alltagsgegenständen wird der Industrieruß zur Optimierung von Produkteigenschaften eingearbeitet. Obwohl bereits einige Untersuchungen über die Gefahren von Carbon Black angestellt worden sind, ist das toxische Potential dieses Materials für die menschliche Gesundheit nicht ausreichend bekannt. Dies zeigt auch die Einschätzung der International Agency for Research on Cancer, welche Industrieruß als potentiell kanzerogene Substanz in die Gruppe 2B eingestuft hat (INTERNATIONAL AGENCY FOR RESEARCH ON CANCER 2006). Die Zielsetzung dieser Dissertation lag in dem Vergleich von zwei Industrierußen mit unterschiedlichen Oberflächeneigenschaften. Während Printex®90 mit einem Anteil von 99 % Kohlenstoff einen sehr reinen Industrieruß darstellt, wurden auf der Oberfläche des getesteten Acetylenrußes verschiedene polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe nachgewiesen. In dieser Arbeit wurde darauf geachtet, dass nur monodisperse lungengängige Feinstaubpartikel in den Versuchen mit den humanen Lungenzellen eingesetzt wurden. So betrug der am Zetasizer ermittelte durchschnittliche hydrodynamische Partikeldurchmesser der Industrieruße im Zellkulturmedium bei Printex®90 im arithmetischen Mittelwert 161,83 (± 8,77) nm und bei dem Acetylenruß 167,36 (± 0,95) nm. Mit dem WST-8 Assay, dem Neutralrot-Test und der durchflusszytometrischen Messung des Propidiumiodids wurde keine Beeinflussung der Zellviabilität von A549, Calu-3 und 16HBE14o- Lungenzellen nach 24 und 48-stündiger Exposition weder durch Printex®90 noch durch den Acetylenruß in Konzentrationen von 0,1 ng/ml bis 10 µg/ml nachgewiesen. Höhere Konzentrationen, bei denen in vivo auch mit unspezifischen toxischen Effekten gerechnet werden muss, führten im WST-8 Assay bei beiden Rußen zur signifikanten Abnahme der Viabilität von humanen Lungenzellen. Es konnte nachgewiesen werden, dass sich Printex®90 und der Acetylenruß negativ auf die interzellulären Kontakte von Calu-3 Zellen auswirken. Bereits nach 24-stündiger Exposition mit 10 µg/ml Acetylenruß zeigte sich eine signifikante Verringerung des transepithelialen Widerstands. Dieser toxische Effekt wurde auch nach 48 und 120 Stunden Rußexposition gemessen. Printex®90 hingegen induzierte erst nach 120-stündiger Exposition in der höchsten eingesetzten Konzentration von 50 µg/ml einen signifikanten Abfall der Impedanz des Zellrasens. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass sowohl Printex®90 als auch der Acetylenruß in der Lage sind intrazelluläre reaktive Sauerstoffspezies (ROS) in humanen 16HBE14o- Bronchialepithelzellen und A549 Alveolarepithelzellen zu induzieren. Während Printex®90 nur in der Konzentration von 50 µg/ml signifikant oxidativen Stress in beiden Zelllinien induzierte, führte bereits eine Konzentration von 10 µg/ml Acetylenruß zu einem Anstieg von intrazellulären ROS in A549 und 16HBE14o- Zellen. Interessanterweise konnten weder bei Printex®90 noch beim Acetylenruß nach 24-stündiger Exposition in den Konzentrationen 10 µg/ml und 50 µg/ml genotoxische Effekte im Comet Assay beobachtet werden. In dieser Arbeit wurden Zytotoxizitätstests an die Untersuchungen von Rußen angepasst. Das zytotoxische Potential von zwei unterschiedlichen Industrierußen auf die Zellen des menschlichen Respirationstrakts wurde nachgewiesen. Weitere Untersuchungen zur Aufklärung der Wirkmechanismen von nanostrukturiertem Carbon Black sollten unternommen werden
NO als Regulator neuronaler Motilität und Regeneration in einfachen Nervensystemen
No full textZusammenfassung
Stickstoffmonoxid (NO) ist als gasförmiger Botenstoff im Nervensystem bekannt. Es spielt eine Rolle bei synaptischer Plastizität, aber auch bei neuronalen Entwicklungs- und Regenerationsvorgängen. Wir untersuchen die Funktion von NO und seiner Signalkaskade über zyklisches GMP am Heuschreckenembryo. Dessen sich entwickelndes Nervensystem ist sehr gut für pharmakologische Manipulationen in Gewebekultur geeignet. Wir analysieren die zellulären Mechanismen der NO-Wirkung an drei Beispielen: 1. im peripheren Nervensystem beim Auswachsen von Pionierneuronen in der Antenne, 2. im zentralen Nervensystem bei der axonalen Regeneration serotonerger Interneurone nach Axotomie und 3. im enterischen Nervensystem bei der Migration von Neuronen, die den Darm-Nervenplexus bilden. In allen Fällen dient intern freigesetztes Stickstoffmonoxid bzw. die Synthese von zyklischem GMP als ein permissives Signal für den jeweiligen Entwicklungsvorgang. Kohlenstoffmonoxid (CO) moduliert als ein weiterer gasförmiger Botenstoff antagonistisch zu NO die Wanderung der Darmneurone. Experimente mit humanen Modellneuronen in Zellkultur weisen darauf hin, dass NO auch bei der Bildung des menschlichen Nervensystems Aspekte der Zellmigration reguliert.</jats:p
Colocalization of NADPH-diaphorase and GABA-immunoreactivity in the olfactory and visual system of the locust
No full textCytochemical Evidence for Nitric Oxide/Cyclic GMP Signal Transmission in the Visual System of the Locust
No full textHistochemistry of acetylcholinesterase and immunocytochemistry of an acetylcholine receptor-like antigen in the brain of the honeybee
No full textA histochemical staining method for acetylcholinesterase (AChE) and an antiserum raised against nicotinic acetylcholine receptors (AChR) of locust nervous tissue were applied in order to reveal certain candidates of cholinergic pathways in the brain of the honeybee. The AChE staining marked layers in the optic lobes, fibers connecting the two brain hemispheres, and fiber tracts as well as soma clusters within the protocerebrum. The calycal input regions of the mushroom bodies were labelled, whereas the intrinsic Kenyon cells showed no staining. Although the antennal afferents projecting into the dorsal lobe showed strong AChE activity, projections into the antennal lobe showed rather weak staining.Application of the antiserum against the AChR showed immunoreactivity in neuropiles, tracts, somata, and the antennal nerve. The immunoreactivity of the optic lobes coincided with the banding pattern of the AChE staining. A particularly striking overlap of AChR immunoreactivity and AChE staining was found in the lip neuropile of the mushroom bodies, which would suggest a cholinergic input into this neuropile via fibers of the median antennoglomerular tract. Because the antiserum against locust AChR binds in neuropiles displaying AChE activity, we conclude that this antiserum also cross-reacts with the bee's receptor. This interpretation is supported by experiments showing α-bungarotoxin (α-BTX) binding sites in some areas of strong immunoreactivity.publishe
Dissociated neurons of the pupal honeybee brain in cell culture
No full textPrimary cell cultures were prepared from specific regions of the pupal honeybee brain which are involved in proboscis extension learning. Defined areas could be dissociated purely by mechanical treatment. We show that cultured neurons regenerate new neurites and remain viable for up to three weeks in a serum-free, chemically-defined medium. Several labelling techniques were employed to identify subpopulations of cultured neurons. For example, acetylcholinesterase staining; fluorescent beads to distinguish identified cell populations of co-cultured brain areas; various markers for surface antigens such as a monoclonal antibody to olfactory projection neurons of the antennoglomerular tracts and monopolar cells of the optic lobes, as well as anti-HRP immunoreactivity and agr-bungarotoxin binding; and various antisera for detecting transmitter phenotype. The appearance of transmitter-immunoreactive cells agreed closely with that expected from their known distributionin situ. Our results suggest that cultured cells retain surface properties and transmitter phenotype of theirin vivo counterparts, despite differences in basic morphology. Thus our culture system provides the important initial step for futurein vitro investigations of the cellular and electrophysiological properties of neurons mediating proboscis extension learning.publishe
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