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PRIN 2009 Coordinatore Nazionale del progetto Dott. Stefania Gessi- Caratterizzazione farmacologica e funzionale dei recettori adenosinici in cellule schiumose umane, un modello di aterosclerosi
No full textL’aterosclerosi rappresenta la principale causa di morbosità e mortalità in tutto il mondo. E’ una malattia progressiva e multifattoriale, che attraverso più meccanismi e più fasi contribuisce all’accumulo di lipidi ed elementi fibrosi nelle grandi arterie. L'aterosclerosi inizia con la disfunzione delle cellule endoteliali a livello dei siti di lesione nella parete delle arterie, con conseguente infiltrazione dei monociti nell'intima. Queste cellule si differenziano in macrofagi, i quali poi internalizzano grandi quantità di lipoproteine ossidate a bassa densità (oxLDL) formando macrofagi ricchi di colesterolo definiti “cellule schiumose” (FC), che a loro volta danno origine a striscie di grasso nella parete delle arterie. Quando si sviluppa la lesione aterosclerotica, lo spessore della parete delle arterie aumenta e la diffusione di ossigeno nell'intima è notevolmente ridotta. Queste regioni ipossiche contengono elevate quantità di FC sottolineando il coinvolgimento di queste cellule in ipossia durante lo sviluppo delle lesioni aterosclerotiche. La teoria anossemica dell'aterosclerosi suggerisce infatti che uno squilibrio tra la domanda e l’apporto di ossigeno nella parete delle arterie costituisca un fattore chiave per lo sviluppo delle lesioni aterosclerotiche.
Il Fattore indotto dall’ipossia (HIF-1), il più importante fattore coinvolto nella risposta cellulare all’ipossia, è un fattore di trascrizione eterodimerico costituito da una subunità inducibile HIF-1α e da una subunità costitutivamente espressa, HIF-1β. E' stato riportato che le oxLDL inducono l'accumulo di HIF-1α nei macrofagi umani suggerendo un possibile ruolo di HIF-1α nell'aterosclerosi. Inoltre, è stato dimostrato che HIF-1 gioca un ruolo fondamentale nell'espressione del fattore di crescita dell'endotelio vascolare (VEGF) e nell'angiogenesi, regolando importanti alterazioni associate all'aterogenesi e all'attività angiogenica dei macrofagi. Quindi, in condizioni aterogeniche, l'elevata espressione di HIF-1 nei macrofagi promuove la formazione delle FC e l'aterosclerosi. Recentemente è stato dimostrato che un'altra chemochina angiogenica, l'interleuchina-8 (IL-8), è incrementata dalle FC localizzate nelle aree ipossiche a livello delle placche aterosclerotiche umane e di coniglio. Il rilascio, indotto dall'ipossia, di IL-8 dalle FC potrebbe portare al reclutamento del muscolo liscio, dell'endotelio vascolare e delle cellule T nelle placche aterosclerotiche, e quindi favorire la progressione della placca stessa. E' stato inoltre dimostrato che nell'endotelio vascolare, in ipossia, HIF-1 aumenta l'espressione di IL-8.
L'adenosina è un nucleoside purinergico proangiogenico rilasciato dai tessuti ischemici ed ipossici. In queste condizioni viene rilasciato ad elevate concentrazioni nello spazio extracellulare. L'adenosina agisce attraverso lo stimolo di quattro diversi recettori accoppiati a proteine G denominati A1, A2A, A2B, e A3. Tutti questi quattro sottotipi sono stati recentemente associati alla modulazione dell'angiogenesi. In particolare, è stato dimostrato che nei mastociti umani e nelle cellule endoteliali microvascolari la secrezione di VEGF e di IL-8 è stimolata dall'attivazione dei recettori A2B. In diverse linee cellulari tumorali umane, in condizioni ipossiche, l'accumulo di HIF-1α e di VEGF è stimolato dai recettori A3. In condizioni di normossia, nei macrofagi murini l'accumulo di HIF-1α e VEGF è mediato dai recettori A2A. Infine, nei monociti umani il rilascio di VEGF è stimolato dai recettori A1.
Quindi, in base al legame tra adenosina, ipossia ed angiogenesi, e alla crescente evidenza di come questi fattori giochino un importante ruolo nell'aterogenesi, valuteremo in questo progetto:
1) se i recettori dell’ adenosina siano in grado di modulare HIF-1α, VEGF e IL-8 nei macrofagi umani, che come dimostrato diventano in ipossia cellule schiumose cariche di grassi, e in un modello di cellule schiumose umane; quale sottotipo recettoriale può influenzare la formazione delle foam cells.
2) il meccanismo alla base di questa modulazione, attraverso la caratterizzazione dello stato di fosforilazione delle chinasi regolate da segnali extracellulari 1/2 (ERK-1/2), della protein chinasi p38 (p38 MAPK), della chinasi Jun N-terminale (JNK-1/2) e della protein chinasi B (pAkt).
3) se gli effetti oggetto di studio possano essere ridotti dagli antagonisti dei recettori dell'adenosina e dal silenziamento dei recettori dell'adenosina e di HIF-1α.
Questo studio permetterà di chiarire il ruolo dell’adenosina nello sviluppo dell’aterosclerosi. Inoltre investigherà se gli antagonisti dei recettori dell'adenosina possano essere utili per bloccare importanti fasi nello sviluppo della placca aterosclerotica.
4) se gli antagonisti dei recettori adenosinici possono interessare la patologia vascolare in seguito a dieta ad alto contenuto di grassi e privazione dell’endotelio in un modello di coniglio
Pharmacological, biochemical and functional characterization of adenosine A2A receptors of human peripheral blood elements.
No full textProgetto Giovani Ricercatori- Recettori A3 dell'adenosina e infiammazione: uno studio farmacologico e biochimico in neutrofili umani.
No full textStudi funzionali hanno rivelato che il sottotipo A3 determina l’inibizione della degranulazione dei neutrofili, suggerendo un suo coinvolgimento nella modulazione degli effetti antiinfiammatori mediati dall’adenosina, in aggiunta a quelli già ben noti esplicati mediante il recettore A2A. Tuttavia la mancanza di ligandi potenti e selettivi ha impedito fino ad oggi di effettuare studi di “binding” che dimostrino la presenza di recettori A3 su queste cellule infiammatorie. Lo scopo di questo studio è la caratterizzazione farmacologica, biochimica e funzionale del sottotipo A3 dell’adenosina in neutrofili umani, usando il nuovo potente antagonista A3 selettivo [3H]MRE 3008F20, recentemente sintetizzato e caratterizzato dal nostro gruppo di ricerca (4,5). Considerata la scarsa selettività dei ligandi A3 agonisti, e la presenza di tutti i sottotipi adenosinici nei neutrofili umani, la disponibilità di un’ antagonista selettivo per questo sottotipo assume una grande rilevanza per varie ragioni:
i) permette una esatta stima dei parametri di affinità e densità relativi al recettore A3 in cellule esprimenti tutti i sottotipi adenosinici;
ii) consente una esatta valutazione dei meccanismi di trasmissione del segnale e delle funzioni fisiologiche modulate dal recettore A3 nei neutrofili umani;
iii) permette di stabilire il contributo di ciascun sottotipo adenosinico alle diverse risposte infiammatorie esercitate da queste cellule
PRIN 2005 Coordinatore Nazionale del progetto Prof. Francesco Caciagli- Responsabile dell'Unità di Ferrara Dott. Stefania Gessi. Deorfanizzazione di nuovi recettori purinici accoppiati a proteine G: caratterizzazione farmacologica e biochimica in sistemi di espressione eterologhi e in cellule native.
No full textGli obiettivi principali di questa unità sono:
1) caratterizzazione farmacologica e biochimica del nuovo recettore per la guanosina e l’adenina in sistemi di espressione eterologhi e in cellule native per mezzo di esperimenti di “binding” del GTPS e di misurazioni dei livelli del calcio e dell’IP3 intracellulari.
In dettaglio il progetto di ricerca sarà sudiviso nelle seguenti fasi:
A) Una parte del progetto sarà finalizzata a studiare l’interazione ligando/recettore del nuovo recettore della guanosina per mezzo di studi del “binding” della [3H]-guanosina. Questi esperimenti saranno utili per valutare l’espressione in termini di affinità e densità recettoriali del nuovo recettore della guanosina in sistemi ricombinanti forniti dall’Unità di Chieti. Durante il secondo anno di attività gli studi di “binding” saranno effettuati in tessuti nativi che esprimono i recettori della guanosina eventualmente eventualmente sia in assenza che in presenza di piccoli RNA interferenti per l’inattivazione genica specifica.
B) Un altra parte dello studio sarà rivolta a correlare i dati di “binding” con alcuni rilevanti eventi post-recettoriali. L’attivazione dei GPCR verrà determinata valutando la capacità di agonisti (nel nostro caso adenina e guanosina e altri interessanti potenziali ligandi) di stimolare il “binding” della [35S]-guanosina-5’-O-(3-tio)trifosfato ([35S]GTPS) in membrane ottenute da cellule sovraesprimenti i recettori. Eventualmente durante il secondo anno di attività, analoghi esperimenti saranno effettuati su tessuti nativi esprimenti i recettori endogeni come suggerito dagli studi di RT-PCR effettuati dalle unità di Chieti e Camerino, sia in assenza che in presenza di piccoli RNA interferenti per ottenere il silenziamento genico in vivo e ridurre in modo significativo l’espressione funzionale dei nuovi recettori clonati.
C) Per quanto riguarda i sistemi effettori, è molto probabile che tutti i recettori orfani utilizzino almeno uno di questi secondi messaggeri, l’adenilato ciclasi o il calcio intracellulare. Il primo sistema verrà investigato dall’Unità di Chieti, mentre per quanto riguarda la valutazione del calcio, misurazioni dirette di questo importante ione saranno effettuate dalla nostra unità in cellule trasfettate con i recettori della guanosina e dell’ adenina, usando l’indicatore fluorescente FURA 2/AM
Progetto Giovani Ricercatori- Caratterizzazione farmacologica, biochimica e funzionale del recettore A3 dell'adenosina in cellule Jurkat e in linfociti umani.
No full textGli agonisti del recettore A3, ad alte concentrazioni, provocano necrosi in varie linee cellulari umane che originano dal sistema immunitario. E’ stato dimostrato che l’apoptosi, con la caratteristica frammentazione del DNA, si verifica in cellule leucemiche umane HL60, in cellule di carcinoma mammario MCF-7 e in eosinofili umani in risposta ad alte concentrazioni (>10 M) di agonisti A3-selettivi suggerendo che, attraverso meccanismi di regolazione della morte cellulare programmata, i recettori A3 siano implicati in patologie umane quali il cancro e l’infiammazione (3). A causa della mancanza di ligandi potenti e selettivi, al momento non esistono studi di “binding” che dimostrino la presenza di recettori A3 su tessuti umani. Lo scopo di questo studio è la caratterizzazione farmacologica, biochimica e funzionale del recettore A3 dell’adenosina in linfociti umani e in cellule Jurkat, una linea cellulare leucemica di origine linfocitaria, usando il nuovo potente antagonista A3 selettivo [3H]MRE 3008F20, recentemente sintetizzato e caratterizzato dal nostro gruppo di ricerca (4,5)
Progetto Giovani Ricercatori-Caratterizzazione biochimica, farmacologica e funzionale dei recettori adenosinici A3 in linee tumorali umane.
No full textScopo del progetto è la caratterizzazione farmacologica e biochimica del recettore A3 in diverse linee tumorali umane. In particolare verranno effettuati esperimenti di binding di saturazione e cinetica utilizzando un radioligando selettivo per il recettore A3 in linee tumorali umane. Inoltre verranno svolti studi per valutare la funzionalità del recettore mediante valutazione dell'attività delle proteine G e dell'adenilato ciclasi. Infine verrà valutato l'effetto dei ligandi di questo recettore sulla proliferazione cellulare e la morte per apoptosi. Questo studio potrà portare 1) alla scoperta di un nuovo recettore implicato nella cancerogenesi 2)alla scoperta di ligandi antagonisti del recettore A3 come potenziali farmaci antineoplastici
PRIN 2007 Coordinatore Nazionale del progetto Dott. Stefania Gessi- Il recettore A3 dell’adenosina: un potenziale bersaglio per la diagnosi, prognosi e terapia del cancro colorettale
No full textE’ noto che l’adenosina è un importante regolatore fisiologico nel mantenere l’omeostasi dell’ossigeno. Questo nucleoside media i suoi effetti attraverso l’interazione con quattro recettori accoppiati a proteine G denominati A1, A2A, A2B e A3. Crescenti evidenze dal punto di vista sperimentale e clinico sottolineano il fondamentale ruolo patofisiologico dell’ipossia nei tumori solidi. In particolare, è stato dimostrato che nei fluidi extracellulari dei tumori solidi sono presenti concentrazioni significative di adenosina in grado di influenzare la vascolarizzazione, l’evasione dal sistema immunitario e la crescita della massa tumorale suggerendo un ruolo per questo autacoide nella crescita del tumore. In particolare il recettore A3 appare il sottotipo adenosinico maggiormente coinvolto nel processo di cancerogenesi. Studiando tessuti ottenuti da pazienti sottoposti a intervento chirurgico per l’asportazione del tumore colorettale è stata dimostrata una sovraespressione del recettore A3 nei tessuti tumorali di colon in confronto all’espressione della proteina nella mucosa sana. E’ interessante sottolineare che la sovraespressione nei tessuti di colon si riflette anche nelle cellule del sangue periferico di pazienti affetti da tumore colorettale. Inoltre in un piccolo numero di pazienti investigati i livelli di espressione del recettore A3 tornano ai valori di espressione basale dopo l’asportazione chirurgica del tumore, rendendo questo sottotipo recettoriale dell’adenosina un possibile marcatore per l’identificazione del tumore. E’ stato osservato un parallelismo tra tessuti ed elementi circolanti del sangue periferico da diversi autori che hanno confrontato con successo le proprietà dei recettori umani in circolo con quelli presenti in diversi tessuti fornendo un modello per studiare i recettori inaccessibili nell’uomo. Comunque la possibilità che non solo la proteina del recettore A3 ma anche l’mRNA possa essere sovraregolato nel tumore del colon deve ancora essere dimostrata e in questo progetto noi valuteremo: 1) se il recettore A3 possa essere un marcatore tumorale 2) se possa essere possibile ottenere attraverso esperimenti di real-time RT-PCR un test diagnostico per identificare i tumori colorettali 3) se l’aumento del recettore A3 sia limitato ai tumori colorettali o se coinvolga altri tipi di tumore o anche condizioni infiammatorie 4) il meccanismo alla base della sovraespressione del recettore A3 nelle cellule del sangue periferico dei pazienti con tumore e 5) se questa sovraregolazione nel tumore sia la conseguenza di un evento di compensazione o invece un importante meccanismo nella eziopatogenesi del tumore. In particolare per chiarire il ruolo del recettore A3 nei tumori valuteremo le sue relazioni con l’ipossia nelle cellule di tumore del colon. L’ipossia, tipica dei tumori solidi, crea condizioni che da una parte danno origine all’accumulo di adenosina extracellulare e, d’altra parte, stabilizzano i fattori di trascrizione indotti dall’ipossia, come ad esempio HIF-1, il più importante fattore coinvolto nelle risposte cellulari all’ipossia. HIF-1 è un eterodimero composto da due subunità HIF-1e HIF-1. Durante la normossia, HIF-1 è rapidamente degradato dal proteosoma, mentre l’ipossia previene la sua degradazione. HIF-1 è sovraregolato in diversi tipi di tumore ed è coinvolto in diversi aspetti chiave della biologia tumorale come ad esempio l’angiogenesi, l’invasione e un alterato metabolismo energetico. L’adenosina aumenta HIF-1 in risposta all’ipossia nei tumori umani di melanoma, glioblastoma e carcinoma del colon. E’ stato dimostrato che l’adenosina è in grado di aumentare l’espressione di HIF-1 e l’accumulo del fattore di crescita dell’endotelio vascolare (VEGF) attivando il recettore A3. Comunque non ci sono dati riguardo alla regolazione mediata dal recettore A3 dell’espressione di HIF-1 e dei fattori angiogenici nelle cellule di carcinoma del colon. Quindi in questo progetto valuteremo se l’attivazione del recettore A3 dell’adenosina modula HIF-1, e i meccanismi di trasduzione del segnale coinvolti in questo effetto utilizzando ligandi selettivi per i recettori dell’adenosina e un approccio attraverso l’interferenza dell’RNA per silenziare il recettore.
Questi studi 1) saranno in grado di dimostrare se il messaggero del recettore A3 possa essere considerato un nuovo marcatore per diagnosticare i tumori umani attraverso un metodo diagnostico come quello della real-time RT-PCR e 2) porteranno nuove informazioni per il potenziale utilizzo clinico degli antagonisti A3 dell’adenosina nello sviluppo di nuove terapie antitumorali
Farmacologia cellulare e molecolare, sistemi di trasmissione. Trasmissione purinergica.
No full text.L’adenosina è un nucleoside endogeno costituito da un anello purinico sostituito in N6 da un gruppo amminico primario e in N9 da un anello D-ribosidico; essa e le sue forme fosforilate ATP, ADP e AMP sono presenti in diversi tessuti dei mammiferi dove esplicano una grande varietà di effetti biologici (Figura 1). Questo nucleoside partecipa, come adenosina 5’-monofosfato (AMP), alla costituzione degli acidi nucleici, mentre nella forma 5’-trifosfato (ATP) rappresenta la fonte più rapida di energia cellulare. Oltre a queste ben note funzioni, l’ATP e l’adenosina esercitano potenti effetti extracellulari e influenzano diversi processi fisiologici; tali azioni furono definite, per la prima volta nel 1929 da Drury e Szent-Gyorgyi, come vasodilatanti e bradicardiche. Il gran numero di studi sperimentali che seguirono a queste prime evidenze dimostrarono le attività svolte dai derivati purinici nella regolazione di numerosi processi biologici quali la contrazione della muscolatura liscia, la neurotrasmissione, la secrezione esocrina ed endocrina, la risposta immunitaria, l’infiammazione, l’aggregazione piastrinica e la funzionalità cardiaca. Il riconoscimento dell’esistenza di recettori purinergici avvenne nel 1978, quando Burnstock ne propose la suddivisione in 2 classi, i recettori P1 che hanno come agonista principale l’adenosina, e i recettori P2 che sono attivati preferenzialmente da adenosina 5’-trifosfato (ATP) e adenosina 5’-difosfato (ADP). Questa classificazione in origine era basata su 4 criteri: 1) le potenze relative di ATP, ADP, AMP e adenosina; 2) le azioni selettive degli antagonisti, in particolare le metilxantine, caffeina e teofillina, che bloccano in modo competitivo le azioni esercitate dall’adenosina ma non quelle dell’ATP; 3) la modulazione dell’adenilato ciclasi e il conseguente cambiamento nei livelli di cAMP da parte dell’adenosina, ma non dell’ATP; 4) l’induzione della sintesi di prostaglandine da parte dell’ATP ma non dell’adenosina. Questa prima classificazione venne in seguito avvalorata dalla successiva caratterizzazione dei suddetti recettori in base alle diversità delle strutture molecolari, dei profili farmacologici e dei sistemi effettori
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