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Electrophysiological characterization and interplay of TRPC1 channels and voltage-gated Ca2+ channels
Full text linkIn many non-excitable cells, which do not generate action potentials by themselves, extracellular chemical signals, like hormones and neurotransmitters, are transduced into membrane depolarizations, which in turn activate voltage-gated Ca2+ (CaV) channels. Hormones and their GPCRs activate transient receptor potential TRPC channels, which allow Na+ and Ca2+ influx, initiating Ca2+-dependent signalling pathways and, in addition, depolarize the plasma membrane and thereby activate CaV channels. To be able to investigate the interplay of TRPC and CaV channels the present study focused on the electrophysiological characterization of L- and T-type CaVs, their β subunits and TRPC ion channels, especially TRPC1, TRPC4, TRPC5, TRPC4/TRPC1 and TRPC5/TRPC1.
Expression of TRPC1 wild-type or TRPC1 with mutations at the putative lower gate in HEK-cells did not reveal any detectable current. However, TRPC1 coexpressed with TRPC4 reveals functional heteromeric TRPC4/TRPC1 channels with altered biophysical properties as compared to monomeric TRPC4. While most of the TRPC1 mutations had no effect, TRPC1 V741A significantly increased TRPC4/TRPC1 currents. In addition, chimeras of TRPC4 backbone with TRPC1 pore revealed constitutive activity, sensitive to the TRPC blocker SKF 96365. The results suggest that TRPC1 contributes to the pore in TRPC4/TRPC1 heteromers and can form a permeable constitutive active channel pore itself.
A subset of pituitary cells functionally expresses heteromeric TRPC5/TRPC1 channels. Pituitary cells isolated from TRPC1-deficient mice revealed homomeric TRPC5 currents with altered current-voltage relationship, lower amplitudes and higher Ca2+ permeability as compared to TRPC5/TRPC1 heteromeric channels in wild-type. Thus, TRPC1 modulates activity and Ca2+ permeability of TRPC5 in vivo and thereby the Ca2+ influx in pituitary cells.
Auxiliary subunits, the CaVβ proteins, are required for the function of CaV channels. To study the impact of CaVβ subunits on the function of L- and T-type CaV channels, different β subunits were coexpressed with the CaVs in HEK-cells. CaVβ2 splice variants increased the L-type CaV1.2 current, but did not significantly affect T-type CaV3.2 currents, whereas CaVβ3 significantly inhibit CaV3.2 currents. In addition, CaVβ3 serves Ca2+ channel independent functions in fibroblasts, where I could not detect CaV currents and where CaVβ3 changes the sensitivity of the inositol trisphosphate (IP3) receptor for low concentrations of IP3.
CaV3.2 currents are also inhibited by Englerin A (EA; EC50 222 nM), which had so far assumed to be a specific agonist of TRPC4, TRPC5, TRPC4/TRPC1 and TRPC5/TRPC1 channels. An electrophysiological characterization of a CaV3.2 mutant, identified in a Spanish family and linked to hyper-aldosteronism and hypertension is ongoing.In vielen nicht erregbaren Zellen, die selbst keine Aktionspotentiale erzeugen, werden extrazelluläre chemische Signale wie beispielsweise Hormone und Neurotransmitter in Membrandepolarisationen umgewandelt, die wiederum spannungsabhängige Calcium Kanäle aktivieren. Die Hormone beziehungsweise die durch sie stimulierten GPCRs können transiente Rezeptorpotential TRPC Kanäle aktivieren, was einen Na+- und Ca2+-Einstrom ermöglicht. Der Ca2+-Einstrom initiiert Ca2+-abhängige Signalwege, und der Na+-Einstrom führt zur Depolarisation der Plasmamembran wodurch spannungsgesteuerte Ca2+ (CaV) Kanäle aktiviert werden. Um das Zusammenspiel von TRPC und CaV Kanälen untersuchen zu können, konzentrierte sich die vorliegende Studie auf die elektrophysiologische Charakterisierung von CaVs vom L- und T-Typ, ihren β-Untereinheiten und von TRPC Ionenkanälen, insbesondere TRPC1, TRPC4, TRPC5, TRPC4/TRPC1 und TRPC5/TRPC1.
Die Expression von TRPC1 Wildtyp oder TRPC1 mit Mutationen am mutmaßlichen unteren Gate ergab in HEK-Zellen keinen nachweisbaren Strom. Mit TRPC4 coexprimiert führt TRPC1 jedoch zu funktionellen heteromeren TRPC4/TRPC1 Kanälen, die veränderte biophysikalische Eigenschaften im Vergleich zu monomerem TRPC4 aufweisen. Während die meisten TRPC1 Mutationen keine Wirkung auf TRPC4/TRPC1 Ströme hatten, erhöhte TRPC1 V741A die TRPC4/TRPC1 Ströme signifikant. Zusätzlich zeigten Chimären des TRPC4-Rückgrats mit TRPC1-Poren eine konstitutive Aktivität, die mit dem TRPC-Blocker SKF 96365 inhibiert werden konnte. Die Ergebnisse legen nahe, dass TRPC1 zur Pore in TRPC4/TRPC1-heteromeren Kanälen beiträgt und selbst eine Ionenpermeable konstitutiv aktive Kanalpore bilden kann.
Ein Teil von Hypophysenzellen exprimiert funktionell heteromere TRPC5/TRPC1 Kanäle. Aus TRPC1-defizienten Mäusen isolierte Hypophysenzellen zeigten homomere TRPC5 Ströme mit veränderter Strom-Spannungs-Beziehung, niedrigeren Amplituden und höherer Ca2+-Permeabilität im Vergleich zu heteromeren TRPC5/TRPC1 Kanälen in Wildtyp Hypophysenzellen. Somit moduliert TRPC1 die Aktivität und Ca2+-Permeabilität von TRPC5 in vivo und damit den Ca2+-Einstrom in die Hypophysenzellen.
Die CaVβ-Proteine werden für die Funktion von CaV Kanälen benötigt. Um den Einfluss von CaVβ-Untereinheiten auf die Funktion von CaV Kanälen vom L- und T-Typ zu untersuchen, wurden verschiedene β-Untereinheiten mit den CaVs in HEK-Zellen coexprimiert. CaVβ2-Spleißvarianten erhöhten den CaV1.2 Strom vom L-Typ, beeinflussten jedoch die CaV3.2 Ströme vom T-Typ nicht signifikant, während CaVβ3 die CaV3.2 Ströme signifikant inhibierte. Darüber hinaus erfüllt CaVβ3 CaV-unabhängige Funktionen in Fibroblasten, bei denen ich keinen CaV Strom nachweisen
Zusammenfassung
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konnte und bei denen CaVβ3 die Empfindlichkeit des Inositoltrisphosphat (IP3) Rezeptors für niedrige IP3-Konzentrationen verändert. CaV3.2 Ströme werden auch durch Englerin A (EA, EC50 222 nM) gehemmt. Für EA wurde bisher angenommen, dass es ein spezifischer Agonist von TRPC4, TRPC5, TRPC4/TRPC1 und TRPC5/TRPC1 Kanälen ist.
Die elektrophysiologische Charakterisierung einer CaV3.2 Mutante, die in einer spanischen Familie identifiziert und mit Hyperaldosteronismus und Hypertonie in Verbindung gebracht wurde, ist noch nicht abgeschlossen.
Der Anhang enthält zusätzliche Experimente zu den im Ergebnissteil beschriebenen Daten
Targeted disruption of genes of the TRP channel family
No full textZiel dieser Arbeit ist die Charakterisierung und Inaktivierung des TRPV6 Gens von Maus. Parallel dazu habe ich an den gleichzeitig durchgeführten Experimenten zur Inaktivierung der Gene TRPM4 und TRPM7 mitgearbeitet. Aus dem Vergleich dieser Maus-Tiermodelle mit den entsprechenden Wildtyp-Tieren soll auf die Funktion des ausgeschalteten Gens geschlossen und das TRPV6-Protein als mögliches Zielmolekül für neue Medikamente definiert werden. Zunächst wurde die cDNS von TRPV6 aus polyA+-RNS kloniert, die aus Plazenta von Maus präpariert worden war. Die cDNS umfasst 2184 Basenpaare und kodiert ein Protein von 727 Aminosäureresten. Dieses Protein, das TRPV6-Protein, lässt sich in drei etwa gleich große Bereiche unterteilen. Der Aminoterminus ist hydrophil und im Zytosol lokalisiert; er enthält mehrere Ankyrin-Repeats, Proteinmodule, die für die Dimerisierung von TRPV6-Proteinen essentiell sind. Der mittlere Teil des Proteins ist hydrophob und umfasst sechs Proteinsegmente die wahrscheinlich als alpha-Helizes die Zellmembran durchqueren. Zwischen der fünften und der sechsten Helix liegt eine ca. 30 Aminosäurereste lange Sequenz die zur Pore des TRPV6-Ionenkanals beiträgt. Der C-Terminus ist wiederum hydrophil und im Zytosol lokalisiert. Er enthält mindestens eine Bindungsstelle, die das Protein Calmodulin kalziumabhängig bindet. Nach Expression der TRPV6 cDNS in Zellkulturzellen werden Kationenkanäle exprimiert, die in erster Linie für Ca2+-Ionen permeabel sind und einen Ca2+-Einstrom in die Zelle ermöglichen. TRPV6-Transkripte werden in Zellen der Bauchspeicheldrüse, Niere und Plazenta exprimiert. Allerdings konnte bisher weder von unserer Arbeitsgruppe noch von einer anderen Arbeitsgruppe in diesen Zellen die Ströme durch TRPV6-Kanäle gemessen werden. Die gleichen Protokolle, mit denen nach Expression der cDNS in Kulturzellen kalziumselektive Ströme relativ einfach charakterisiert werden können, führen nicht zur Detektion entsprechender Ströme in Primärzellen aus Pankreas und Plazenta, die TRPV6 'von Natur aus'; exprimieren. Durch Inaktivierung des Gens von TRPV6 in Maus soll diese Diskrepanz aufgelöst werden. Hierzu wurde zunächst das TRPV6-Gen von Maus charakterisiert. Es erstreckt sich über 15 660 Basenpaare, enthält 15 Exonabschnitte und ist auf Chromosom 6 lokalisiert. Im nächsten Schritt wurden verschiedene Strategien zum Targeting des Gens in Erwägung gezogen. Begonnen wurde mit einer Strategie, die es erlaubt, das Gen mit Hilfe des Cre/loxP-Systems zu inaktivieren, aber gleichzeitig auch über das Tetrazyklin-Regulationssystem zu überexprimieren bzw. seine Expression zu hemmen. Diese Strategie, die sich in parallelen Arbeiten in der Arbeitsgruppe, an denen ich ebenfalls beteiligt war, zum Targeting des TRPM7-Gens auf Anhieb bewährt hat, führte bei TRPV6 zu keinem Ergebnis. Insgesamt 1279 selektionierte ES-Zellklone wurden isoliert, zeigten aber keine Rekombination. Im nächsten Schritt wurde deshalb die verwendete Strategie durch zusätzliche Negativselektion modifiziert. Es wurden 289 selektionierte ES-Zellklone isoliert; allerdings kam es auch bei dieser Strategie zu keiner Rekombination. Es wurde deshalb eine grundlegend andere Targeting-Strategie entwickelt, wobei auch die Zielsequenz des Targetings innerhalb des TRPV6-Gens geändert wurde; statt dem ersten translatierten Exon sollten die Exons 13, 14 und 15 das TRPV6 Gens deletiert werden. Weiterhin wurden jetzt prinzipiell zwei Ziele angestrebt: Erstens sollte das Gen inaktiviert werden, so dass kein Protein translatiert wird. Zweitens sollte das Gen mutiert werden, so dass zwar das Protein synthetisiert wird, es aber nicht die typische Kanalaktivität aufweist. Beide Ziele wurden bei der angewendeten Strategie kombiniert und es konnten aus 1140 selektionierten ES-Zellklonen ein rekombinanter Klon, Klon 6F11, für die Inaktivierung des Gens, und zwei rekombinante Klone, die Klone 8E11 und 16F8, für die Synthese eines inaktiven Proteins isoliert werden. Nach Injektion der ES-Zellen 6F11, 8E11 und 16F8 in Blastozysten und Austragen der resultierenden Embryonen durch Ammenmütter wurden chimäre Tiere für beide Targeting-Ereignisse geboren. Ein Teil dieser Tiere hat die Mutation an die F1-Generation weitergegeben, so dass Tiere enstanden, die heterozygot für die in das TRPV6-Gen eingeführten Mutationen sind. Anschließend wurden diese Tiere untereinander verpaart um so Tiere zu züchten, die homozygot für die eingeführten Mutationen sind. Inzwischen sind vier TRPV6 knock-out Mäuse geboren worden. Aus den Defiziten dieser Tiere im Vergleich zu Wildtyp-Tieren mit unverändertem TRPV6-Gen sollte sich die Funktion des TRPV6-Proteins ergeben sowie neue Perspektiven im Hinblick auf TRPV6 als mögliches Zielmolekül neuer Pharmaka. Parallel zu den Arbeiten zu TRPV6, die den Hauptteil meiner Untersuchungen ausgemacht haben, war ich am Targeting von TRPM7 und insbesondere von TRPM4 beteiligt. Tiere, die homozygot sind für Mutationen in beiden Genen existieren bereits.The major aim of this study was the characterization and inactivation of the mouse TRPV6 gene. First, cDNA of mouse TRPV6 was cloned from polyA+-RNA derived from murine placenta. This cDNA comprises 2184 base pairs, encoding a 727 amino acid protein. TRPV6 is a member of the TRPV subfamily of the TRP superfamily of cation channels, which compromises 28 genes in the mouse genome. Upon heterologous over-expression of TRPV6-cDNA in a mammalian cell line, cation channels are formed which are highly calcium-selective and allow calcium influx into the cell. Within the TRP family, TRPV6, and the highly related TRPV5, are the most calcium selective ion channels. The TRPV6 protein sequence can be subdivided in three segments of approximately the same length. The amino-terminal is hydrophilic and localized in the cytoplasm. It contains several ankyrin-repeats, which are protein modules essential for multimerisation of TRPV6-proteins. The middle part of the protein is hydrophobic and contains six protein segments, presumably spanning the cell membrane as alpha-helices. Between the fifth and the sixth helix a 30 amino acid sequence contributing to the selectivity filter of the TRPV6 ion channel is located. Finally, the carboxy-end is hydrophilic and is again localized in the cytoplasm. It contains at least one binding site for calciumdependent binding of calmodulin. TRPV6 transcripts are found in pancreas, kidney and placenta. Notably, at the time of writing no reports were made concerning the measurement of native TRPV6- channels in these cells, despite the extensive characterization of TRPV6 in a heterologous overexpression system. It is to be expected that the inactivation of the TRPV6 gene in mouse, and subsequent comparison of channel activity in wild-type and KO tissue, is the most promising strategy to overcome this discrepancy. Second, I characterized the mouse TRPV6 gene. It covers 15 660 base pairs, consisting of 15 exons and is localized on mouse chromosome 6. Next, several gene-targeting strategies were considered, and the corresponding targeting vector was constructed. In the initial strategy, the first exon of the TRPV6 gene, containing the start ATG, was targeted. The targeting vector was constructed as such that conditional gene inactivation using the Cre/loxP system, simultaneously with overexpression or inactivation by the tetracycline regulatory system could be achieved. This strategy was successfully applied for targeting of the TRPM7 gene, a project also conducted in our group. However, in case of the TRPV6 gene this strategy did not lead to positive results: a total of 1279 ES-cell clones were isolated but did not show homologous recombination. Therefore, in the next step we modified this targeting strategy by including a negative selection cassette in the targeting vector. 289 ES-cell clones were isolated, but again no clone showed homologous recombination. Thus finally, a totally different targeting strategy was developed using a different part of the TRPV6 gene as target sequence. Instead of the first translated exon, now exons 13, 14 and 15 should be deleted. These exons contain the sequence contributing to the selectivity filter of the TRPV6 channel. Upon removal of these exons a protein consisting of the N-terminus and 5 transmembrane domains will be formed, lacking the ion conducting pore of the TRPV6 channel and the complete C-terminus. Furthermore, in a parallel strategy we aimed at mutating the TRPV6 gene, by introducing a point mutation which would functionally impair channel function, without compromising protein expression. Suitable targeting vectors were constructed and 1140 ES-cell clones were analyzed using southern blot. Among these, one recombinant clone for inactivation of TRPV6 and two recombinant clones for generation of a functionally inactive, but structurally intact protein were identified. Third, these positive clones were injected into blastocysts to generate transgenic animals. After blastocyst injection of the ES-cell clones implantation into surrogate mothers, chimeric mice for both targeting events were born. For each of these groups, some of the mice passed the mutation to the F1-generation, thus establishing germ-line transmission was successful. Heterozygote mice for the introduced mutation were born and are viable. Subsequently, those mice were bread to generate homozygote TRPV6 knock-out mice and at the time of writing four knock-out mice have been obtained. In parallel to the above described work, I simultaneously contributed to experiments leading to the inactivation of the mouse TRPM4 and TRPM7 genes. Mice with homozygote mutations in those genes exist by now, and phenotypes are being analyzed
Verordnungshäufigkeit potentiell inadäquater Medikamente bei älteren Menschen in einer neurologischen Akutklinik : Möglichkeiten der Verbesserung der Arzneimittelsicherheit in der Pharmakotherapie
Full text linkIdentifizierung und Charakterisierung von Spleißverhalten der CaV-beta-2-Untereinheit des spannungsabhängigen L-Typ Ca2+-Kanals CaV1.2 in Mausherz
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Die physiologische Variante von TRPC1 und der Einfluss von Punktmutationen auf die TRP-Kanalfunktion
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Analysis of TRPM3 cation channels using knock down and knock out methods
No full textEinen wesentlichen Anteil an der Regulation der intrazellulären Ca2+-Konzentration haben Kationenkanäle aus der Familie der TRP-Proteine. Vermutlich 4 TRP-Proteine bilden homo- und heterooligomere Kanalkomplexe. TRPM3 ist das zuletzt identifizierte Mitglied der TRPM-Subfamilie mit größter Homologie zu TRPM1. Das TRPM3-Gen codiert eine Vielzahl von Spleissvarianten, welche Unterschiede hinsichtlich ihrer Permeabilität für divalente Kationen und ihrer Aktivierbarkeit durch das Steroid Pregnenolonsulfat aufweisen.
Ich habe gezeigt, dass TRPM3 vor allem im Plexus choroideus, in ß-Zellen und in der Hypophyse exprimiert wird. Aus Ins-1- und GH3-Zellen sowie aus dem Hirn der Ratte habe ich neben bekannten TRPM3-Varianten 9 bislang unbekannte kloniert.
FURA-2 Messungen zeigten, dass Pregnenolonsulfat in Ins-1- und GH3-Zellen einen Ca2+-Einstrom auslöst. Eine Hemmung von TRPM3 mit Hilfe von RNA-Interferenz ebenso wie eine Überexpression von TRPM1 und TRPM31 führte in diesen Zellen zu einer deutlichen Abnahme des Steroid-induzierten Ca2+-Einstroms, was stark darauf hindeutet, dass TRPM3-Kanäle für den Ca2+-Einstrom verantwortlich sind.
Um die biologische Funktion von TRPM3 zu untersuchen, habe ich eine TRPM3-defiziente Mauslinie hergestellt. Dabei wurde Exon 24 deletiert, da es die ionenleitende Pore des Kanals codiert. Die angewandte Strategie erlaubt zudem eine zeit- oder gewebespezifische Inaktivierung des TRPM3-Gens sowie die Identifizierung TRPM3-exprimierender Zellen anhand ihrer grünen Fluoreszenz.Cation channels of the TRP family play a substantial role in the regulation of the cytosolic Ca2+ homeostasis. Presumably, TRP channel subunits assemble into homo- or heterotetrameric channel complexes. TRPM3 is the most recent identified member of the TRPM subfamily and shows highest homology to TRPM1. The TRPM3 gene encodes a variaty of splice variants. These variants differ in their permeability for divalent cations and their activation by the steroid pregnenolonesulfate.
In this work I showed that TRPM3 is strongly expressed in the choroid plexus, in pancreatic ß-cells and in the pituitary gland. I cloned several variants of TRPM3 from Ins-1 cells, GH3 cells and rat brain. Nine new splice variants were identified.
Pregnenolonesulfate induces Ca2+ entry in GH3 and Ins-1 cells as measured with the calciumindicatordye FURA-2. Inhibition of TRPM3 using a RNA interference approach and overexpression of TRPM1 and TRPM31 led to a significant reduction of the steroid induced Ca2+ influx in these cells. These data strongly suggest that TRPM3 channels are responsible for the steroid induced Ca2+ entry in endocrine cells.
To analyze the biological functions of TRPM3 channels, I generated a TRPM3 deficient mouse line. Thereby exon 24 was deleted since it encodes the ion conducting pore of the channel. Furthermore, the applied strategy allows a time- or tissue-specific inactivation of the TRPM3 gene and in addition the identification of TRPM3 expressing cells by their green fluorescenc
TRPV6 and TRPM8: Analysis of protein-protein-interactions
No full textDie Proteine der TRP-Familie bilden Kationenkanäle, die an verschiedenen sensorischen und zellbiologischen Prozessen beteiligt sind. Strukturell zeigen sie eine Ähnlichkeit zu den Kaliumkanälen, die eine tetramere Struktur aufweisen. Man nimmt deshalb an, dass sich jeweils vier monomere TRP-Proteine zu einem funktionellen tetrameren Ionenkanal zusammenlagern. Ein tetramerer Aufbau war zu Beginn dieser Arbeit nur für TRPV1 angedeutet worden. Durch welche Interaktionsdomänen eine Multimerisierung vermittelt wird, und ob es phylogenetisch konservierte Signale und Mechanismen dafür gibt, war unbekannt. Da sich aber verschiedene Mitglieder der TRP-Familie hinsichtlich ihrer zytoplasmatischen Proteinmotive stark unterscheiden, liegt die Vermutung nahe, dass ihre Tetramerisierungssignale unterschiedlich sind. In dieser Arbeit wurden Homomultimerisierungsdomänen der beiden Proteine TRPV6 und TRPM8 identifiziert und untersucht und es wurde gezeigt, dass beide Proteine Tetramere bilden können. TRPV6 ist vermutlich an der intestinalen und transplazentalen Resorption von Kalzium beteiligt, TRPM8 spielt wahrscheinlich eine Rolle bei der Kälteperzeption durch das somatosensorische System. Beide Kanäle zeigen außerdem eine verstärkte Expression in malignen Formen des Prostatakarzinoms, und zumindest für TRPV6 scheint die verstärkte Kanalexpression mit einer verstärkten Proliferation zu korrelieren. Das Verständnis der jeweiligen Strukturen und Signale, die den funktionellen Kanal-Zusammenbau vermitteln, würde nicht nur erlauben das Zusammenlagern der TRP-Proteine zu Kanälen zu verstehen, sondern könnte zukünftig auch eine Bedeutung für die Entwicklung neuer Pharmaka haben. Zur Identifizierung und Analyse der Proteindomänen wurden verschiedene Methoden eingesetzt: Die mit dem Hefe-Zwei-Hybrid-System verwandten Systeme Bacteriomatch® und Bacteriomatch®II wurden etabliert, weiterentwickelt und zur Analyse von homo- und heterotypischen Proteininteraktionen angewendet. Außerdem wurden markierte Ionenkanal-Fusionsproteine mit TRPV6 bzw. TRPM8 ko-immunpräzipitiert. Identifizierte Proteindomänen wurden anschließend gezielt mutiert und die mutierten Proteine auf ihre Fähigkeit untersucht, Proteinkomplexe und funktionelle Ionenkanäle zu bilden. Weiter wurden in dieser Arbeit Heteromultimerisierungen von TRPV6 mit anderen Mitgliedern der TRPV-Unterfamilie untersucht. In verschiedenen Experimenten konnte TRPV6 nicht mit TRPV2, TRPV3 und TRPV4 ko-immunpräzipitiert werden. Mit TRPV1 wurde dagegen eine schwache Interaktion beobachtet; TRPV5 wurde in dieser Arbeit nicht untersucht. Ein weiterer Schwerpunkt der Arbeit war die Suche nach unbekannten Interaktionspartnern von TRPV6. Da zu Beginn dieser Arbeit außer Calmodulin keine mit TRPV6 interagierenden Proteine bekannt waren, sollten neue Proteine, die mit dem TRPV6-Carboxyterminus interagieren, mit einem Bakterien-Zwei-Hybrid-System identifiziert werden. Zu diesem Zweck wurde zuerst eine cDNS-Bibliothek aus humaner Plazenta hergestellt und mit dem Bacteriomatch®-System durchsucht; danach wurde eine cDNS-Bibliothek aus humanem Pankreas von Mensch mit dem Bacteriomatch®II-System durchsucht. Mit beiden Bibliotheken konnten jedoch keine spezifisch interagierenden Proteine gefunden werden.Proteins of the TRP family form cation channels involved in many different sensory and cellular processes. Regarding their structure, they display some similarities to voltage gated potassium channels, which exhibit a tetrameric structure. It is thus assumed that four monomeric TRP proteins assemble to form a functional tetrameric ion channel. At the beginning of this work, a tetrameric structure was postulated only for TRPV1. It was unknown which interaction domains mediate a multimerisation and whether there are conserved signals and mechanisms for TRP channel assembly. The fact that cytoplasmatic protein motifs differ especially between members of different TRP family subgroups leads to the assumption that their tetramerisation signals are different. In the framework of this thesis, homomultimerisation domains of the two TRP proteins TRPV6 and TRPM8 were identified and it was shown that both proteins can form tetramers. TRPV6 is most likely involved in intestinal and placental absorption of calcium, TRPM8 presumably plays a role in cold perception via the somatosensoric system. Both ion channels are overexpressed in malignant forms of prostata cancer, and at least in case of TRPV6, expression of TRPV6 transcripts seems to correlate with enhanced proliferation. Knowledge of structures and signals responsible for the assembly of functional channels would not only permit the understanding of the formation of TRP ion channels, but could also be of interest for the development of new pharmaceuticals. Several methods were used to identify and analyse interacting protein domains: the two systems Bacteriomatch® and Bacteriomatch®II, which are conceptually similar to yeast two hybrid systems were established, refined and applied to analyse homo- and heterotypical protein interactions. Furthermore, tagged ion channel fusion proteins were co-immunoprecipitated with TRPV6 and TRPM8 respectively. After identification, protein interaction domains were mutated by directed point mutagenesis and tested for their ability to form protein complexes and functional ion channels. Moreover, heteromultimerisations of TRPV6 with other members of the TRPV-subfamily were investigated in the course of this thesis. In repeated experiments, TRPV6 could not be co-precipitated with TRPV2, TRPV3 and TRPV4, whereas there was a weak interaction with TRPV1; TRPV5 was not tested. Another aim of this thesis was the identification of unknown proteins interacting with TRPV6. Since there were no known proteins interacting with TRPV6 other than calmodulin when this thesis was started, a screen for new interaction partners with the carboxyterminal region of TRPV6 was performed using a bacterial two hybrid system. For this purpose, a cDNA library was synthesized from human placenta and screened by using the Bacteriomatch®-System; moreover, a cDNA library from human pancreas was screened by using Bacteriomatch®II-System. However, no real interacting partners for TRPV6 could be identified in either screen
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