1,721,064 research outputs found
Analisi dell'attività del Sirolimus in combinazione con biomolecole utilizzabili in medicina di precisione e terapia personalizzata su precursori eritroidi isolati da soggetti beta-talassemici.
No full textL'obiettivo del progetto è quello di verificare l’attività del Sirolimus in combinazione con biomolecole utilizzabili in medicina di precisione e terapia personalizzata su precursori eritroidi isolati da soggetti con beta-talassemia, anche studiando il rapporto tra polimorfirmi del DNA (ad esempio LYAR) e la risposta in termini di incremento di HbF. Il progetto prevede di isolare i precursori eritroidi da almeno 10 pazienti con beta-talassemia, indurli all’espressione di HbF con idrossiurea o Sirolimus, in presenza di ulteriori modificatori della risposta biologica (ad esempio PNA in grado di colpire l’mRNA per BCL11A) e valutare la produzione di HbF attraverso HPLC e l’espressione degli mRNA attraverso RT-qPCR. Al tempo stesso sarà sviluppata la tecnologie della “digital-PCR” per quantificare gli mRNA espressi nelle cellule indotte
Verificare l’attività del Sirolimus in combinazione con biomolecole utilizzabili in medicina di precisione e terapia personalizzata su precursori eritroidi isolati da soggetti con beta-talassemia, anche studiando il rapporto tra polimorfirmi del DNA (ad esempio LYAR) e la risposta in termini di incremento di HbF
No full textL'obiettivo principale di questo studio sarà quello di: verificare l'attività di Sirolimus in combinazione con biomolecole utilizzabili in medicina di precisione e terapia personalizzata su precursori eritroidi isolati da soggetti con beta-talasemia, anche studiando il rapporto tra polimorfismi del DNA (ad esempio LYAR) e la risposta in termini di incremento di HbF. Il Progetto prevede di isolare i precursori eritroidi da almeno 10 pazienti con beta-talassemia, indurli all'espressione di HbF con idrossiurea o Sirolimus, in presenza di ulteriori modificatori della risposta biologica (ad esempio PNA in grado di colpire l'mRNA per BCL11A) e valutare la produzione di HbF attraverso HPLC e l'espressione degli mRNA attraverso RT-qPCR. Al tempo stesso sarà sviluppata la tecnologia della "digital-PCR" per quantificare gli mRNA espressi nelle cellule indotte
MicroRNA profiling in biopsie liquide di pazienti con Sindrome di ShwachmanDiamond: identificazione delle basi molecolari della patologia e di nuovi markers prognostici.
No full textShwachmanDiamond (SDS) è una malattia rara ereditaria autosomica recessiva caratterizzata da mutazioni del gene SDBS e da insufficienze d’organo multiple. Il 15-20% dei pazienti sviluppa sindrome mielodisplastica, con rischio di leucemia mieloide
acuta. La terapia attuale consiste in trapianto di midollo e supplementazione con enzimi pancreatici. Lo scopo del progetto è valutare, mediante microarrays e droplet digital PCR quantitativa (ddPCR), il contenuto dei microRNA presenti (a) nel plasma di pazienti SDS, (b) in linee cellulari linfoblastoidi da essi derivate, (c) secreti nel terreno di coltura (microvescicole/esosomi). Il materiale biologico (da circa 10 pazienti SDS ed altrettanti soggetti sani) è già stato ottenuto dal Centro Regionale Specializzato per la Sindrome di ShwachmanDiamon, Az. Osp. Univ. Integrata di Verona (Dott. Cipolli,Bezzerri, Sorio) (1). L’identificazione di microRNA differenzialmente espressi in pazienti SDS rispetto a soggetti sani permetterà di identificare possibili meccanismi molecolari utili per nuovi approcci terapeutici. L’integrazione dei risultati con dati clinici (includendo età, sesso, stadio della patologia e risposta alla terapia) consentirà di identificare microRNA con valore prognostico rispetto all’evolversi della patologia verso quadri clinici più severi (es leucemia) e alla risposta a specifici trattamenti terapeutici
Biosensori e nuove piattaforme tecnologiche per la biopsia liquida e l'indagine di miRNA circolanti
No full textBiosensori e nuove piattaforme tecnologiche per la biopsia liquida e l'indagine di miRNA circolant
Studio di microRNA come molecole utilizzabili in approcci di teranostica
No full textIl progetto prevede lo studio di microRNA come molecole utilizzabili in approcci di teranostica. In particolare l’identificazione di molecole a microRNA a) utili per identificare procedure di autoemotrasfusione negli atleti; b) utili per poter diagnosticare la presenza di patologie tumorali mediante analisi di biopsie liquide e nuove piattaforme tecnologiche; c) come molecole target in nuove strategie terapeutiche per malattie genetiche rare quali la fibrosi cistica, la beta-talassemia e la sindrome Shwachman Diamond
Combined approaches for Shwachman-Diamond Syndrome: microRNA targeting, gene editing and read-through correction (miRCOMBO-SDS)
No full textThe overall aim of the project is the identification of microRNAs to be used as molecular targets for personalized combined therapeutic approaches for Shwachman-Diamond Syndrome (SDS), including CRISPR/Cas9 genome editing and read-through strategy. MicroRNAs (miRNAs) are small noncoding RNAs regulating gene expression by sequence-selective targeting of mRNAs, leading to translational repression or mRNA degradation. In almost all disorders, including myelodisplastic and oncologic diseases, microRNAs were found dysregulated, and often these alterations are associated with the phenotype of the disease and/or tumor onset and progression. Accordingly, the pharmacological modulation of microRNA activity appears to be a very interesting approach in the development of new types of drugs (miRNA therapeutics) and one important research area is the possible development of miRNA therapeutics in the field of rare diseases.
Recently, in order to verify possible involvement of microRNAs in the SDS phenotype, we have analyzed the microRNA pattern which differentiate Lymphoblastoid Cell Lines (LCLs) cultures derived from SDS patients from LCLs from control healthy subjects. Of relevance, in consideration of the fact that cells from SDS patients are characterized by up-regulated mTOR phosphorylation, possibly associated with down-regulation of PTEN, the relative expression of PTEN targeting microRNAs was found variable among the cells from the different SDS patients. Our data suggest that miR-34a-3p and miR-744-3p might be considered as possible targets of antimiRNA molecules, for increasing PTEN expression in SDS patients. Altogether, these data support the concept the microRNAs might participate to the phenotype of lymphoblastoid cells of SDS patients.
In the miRCOMBO-SDS project we will collect plasma samples and CD34+ progenitor cells obtained from SDS patients and healthy donors in order to compare the levels of microRNAs using Next Generation Sequencing (NGS), droplet digital PCR, quantitative PCR and Western Blotting. In parallel, we will study putative binding sites on 3’UTR of SBDS transcripts, in order to identify novel microRNAs involved in SBDS gene expression regulation. This part of the study could be of interest for the development of premiRNA and antimiRNA molecules (including molecules based on Peptide Nucleic Acids, PNA) used in combination with CRISPR/Cas9-based genome editing approaches or in association with read-through correctors. For the editing of SBDS gene, we will develop a CRISPR/Cas9 based system, by designing a short guide RNA (sgRNA) and a DNA donor templates, and by using the recombinant Cas9 endonuclease. Those molecules will be transfected to LCLs and CD34+ patients derived cells. The in-vitro editing will be assessed by quantification of the levels of corrected gene and mRNAs, and the increase of SBDS protein expression.
Combined treatments with CRISPR/Cas9 system and/or read-through molecules, including PTC124 (Ataluren) and Amlexanox, will be employed in the presence of the best anti-miRNA therapeutic molecules transfected to SDS cells. The combination of these strategy is the long-term objective of the miRCOMBO-SDS project and could be very interesting in order to replace/increase the expression of SBDS in cells from Shwachman-Diamond Syndrome patients, allowing personalized therapeutic protocols to be assessed in this disease
Acidi peptido-nucleici (PNA) per il Genome Editing in β-talassemia: correzione sito-specifica della mutazione β°39
No full textGli acidi peptido-nucleici (PNA), sono analoghi sintetici del DNA nei quali lo scheletro fostodiesterico è stato sostituito con unità ripetute di N-(2-aminoetil)-glicina. Essendo a carica neutra, ibridizzano al DNA con affinità molto maggiore rispetto a oligo-DNA o -RNA. I PNA sono stabili e resistenti a nucleasi e proteasi. Poiché i PNA ibridizzano al DNA genomico in modo sito-specifico, sono possibili candidati per lo sviluppo di strategie innovative di “genome editing”, ad esempio basate sull’utilizzo di tail-clamp PNA (tcPNA) disegnati in modo da legare contemporaneamente sia un tratto omopurinici/omopirimidinico del DNA formando triple eliche (triplex), sia una regione contigua producendo un duplex DNA/PNA attraverso “strand-invasion”. La formazione di questi legami vicino ad una mutazione genica, crea distorsione nell’elica riconosciuta dai meccanismi cellulari di riparo del DNA, i quali utilizzando un DNA templato donatore contenente la sequenza non mutata, possono correggere in modo permanente il genoma attraverso ricombinazione omologa.
Lo scopo del progetto è disegnare e utilizzare tcPNA per correggere mediante genome editing la mutazione talassemica β°39, che essendo una mutazione di stop, causa la completa assenza di catene β-globiniche. Per la validazione, verrà creato un modello cellulare GFP-β°39mut, costituito da cellule K562 trasfettate con un lentivirus mutagenizzato in modo da contenere la mutazione β°39 nella sequenza codificante GFP, causando l’abolizione della produzione della proteina e relativa fluorescenza intracellulare (Fig.1). Per il delivery cellulare delle molecole tcPNA verranno utilizzate nuove molecole a struttura callixarenica che consentono un’elevata efficienza di delivery dei PNA. Disegneremo tcPNA in grado di legare regioni del gene GFP limitrofe alla mutazione talassemica β°39. Questi PNA verranno veicolati nelle cellule insieme ad una sequenza di DNA donatore contenente la sequenza non-mutata (Fig.2). Andando a verificare i livelli di produzione di GFP mediante analisi della fluorescenza cellulare potremo determinare la capacità di correzione genica confrontando la tecnica basata sui PNA con approcci classici di gene editing, come il metodo CRISPR/Cas9. I risultati ottenuti potranno essere ulteriormente validati utilizzando altri modelli cellulari già a nostra disposizione, quali cellule K562-β°39 contenenti il transgene β-globinico mutato, progenitori eritroidi CD34+ isolati da pazienti talassemici β°39 omozigoti e linee murine transgeniche per la mutazione β°39. L’impiego di tcPNA potrebbe essere utilizzato per la correzione di mutazioni puntiformi anche in altre patologie genetiche, offrendo il vantaggio di una maggior sicurezza e di livelli molto più ridotti di effetti off-target rispetto agli approcci di gene editing basati sulle nucleasi, offrendo la possibilità di effettuare trattamenti multipli per raggiungere effetti terapeutici più significativi
Impiego di strategie di microRNA targeting combinate a trattamenti con composti di origine naturale ad attività antiproliferativa e pro-apoptotica: studio dell’effetto antitumorale in-vitro su modelli cellulari di carcinoma del colon-retto, di glioblastoma e di carcinoma mammario (NaturalMiR-Combo)”
No full textLo scopo del progetto è di sviluppare molecole in grado di colpire microRNA coinvolti nello sviluppo e progressione tumorale ed utilizzarle in trattamenti combinati con composti di origine naturale, per indurre apoptosi e morte delle cellulare. I microRNA (miRNA) sono piccoli RNA non codificanti importanti per la regolazione dell’espressione genica, che attraverso un legame selettivo con l’mRNA bersaglio, downregolano la traduzione proteica. Anche nelle patologie oncologiche è noto il coinvolgimento di microRNA (oncomiRNA e tumor suppressor miRNA), la cui espressione è spesso disregolata e associata allo stadio e alla progressione tumorale. In questo contesto, l’approccio chiamato “miRNA therapeutics” (1) si propone di effettuare la modulazione farmacologica dell’attività dei miRNA disregolati mimandone o contrastandone l’attività (miRNA replacement e antimiRNA therapy) e potrebbe essere una strategia molto promettente per lo sviluppo di una nuova tipologia di farmaci da utilizzare come antitumorali. Ad esempio, tra le molecole in grado di colpire i miRNA, sono molto interessanti gli acidi peptido-nucleici (PNA), analoghi sintetici del DNA nei quali lo scheletro fostodiesterico è stato sostituito con unità ripetute di N-(2-aminoetil)-glicina, che sono in grado di ibridizzarsi con gli acidi nucleici con un affinità e una specificità di legame elevate e sono molecole molto stabili e resistenti alla degradazione nucleasica e proteasica. Inoltre, per aumentare il delivery cellulare dei PNA, è possibile funzionalizzarli con opportune modifiche (es. inserimento di una coda di arginine), in grado di conferire la capacità di attraversamento delle membrane cellulari, o incapsularli in nanoparticelle. Numerosi studi hanno dimostrato l’efficienza di PNA, disegnati per legare uno specifico miRNA, nel ridurne l’attività e ottenere un effetto farmacologico (2).
In parallelo all’approccio miRNA targeting, numerosi composti di origine naturale sono stati proposti come agenti pro-apoptotici o citotossici in ambito oncologico, da utilizzare in associazione o alternativa agli attuali farmaci antitumorali, per ridurne gli effetti collaterali e per aumentare la selettività nei confronti delle sole cellule tumorali.
Tra questi il sulforafano, composto del gruppo degli isotiocianati, presente in natura in diverse specie vegetali (come nelle piante della famiglia delle crucifere), che possiede diverse proprietà tra le quali quella antiinfiammatoria, è stato recentemente proposto anche come molecola a potenziale attività antitumorale.
Attualmente, numerosissime sono le molecole di origine naturale (derivate da specie vegetali terrestri e marine) che sono studiate a questo scopo: ed esempio, oltre al sulforafano, anche la corilagina (gallotannina presente in estratti di diverse piante), il resveratrolo (composto fenolico ottenuto dalla buccia dell'uva rossa) e la quercetina (flavonoide isolabile da numerose specie vegetali tra le quali l’ippocastano). In aggiunta, queste molecole di derivazione naturale potrebbero essere utilizzate, anche in associazione tra loro, per potenziare l’effetto citotossico. Ad esempio, recentemente è stata proposta la combinazione sulforafano e resveratrolo, per indurre apoptosi in cellule di glioma (3).
Il progetto prevede di impiegare molecole di derivazione naturale in trattamenti combinati con molecole premiRNA e antimiRNA da noi opportunamente disegnate, allo scopo di valutarne l’eventuale effetto antiproliferativo in cellule modello di carcinoma del colon retto, di glioblastoma, e di carcinoma mammario.
Verranno quindi identificati miRNA disregolati nelle diverse tipologie tumorali, e disegnate e sintetizzate molecole per il miRNA targeting, tra le quali i PNA, che verranno somministrate in-vitro alle cellule, valutandone la capacità di indurre apoptosi mediante citofluorimetro MUSE Cell Analyzer.
In parallelo, verranno saggiate diverse concentrazioni di molecole di derivazione naturale, allo scopo di identificare la concentrazione migliore per indurre apoptosi nello specifico modello cellulare tumorale.
Infine, i premiRNA, antimiRNA e i composti naturali, verranno utilizzati in trattamento combinato, a concentrazioni subottimali, per verificare un possibile effetto additivo/sinergico. Risultati recenti in cellule di cancro del colon-retto HT-29, hanno mostrato un effetto sinergico del composto sulforafano con un PNA contro il miR-15-b (4).
Ci attendiamo di poter identificare una combinazione ottimale, da poter testare anche in modelli tumorali in-vitro più complessi, come colture 3D.
Inoltre, i risultati ottenuti possono essere utili per poter proporre lo sviluppo di nuove formulazioni (es. nanoparticelle) utili per la veicolazione delle combinazioni terapeutiche precedentemente identificate
Identification of dysregulated miRNAs in liquid biopsies from colorectal cancer (CRC) patients: impact in personalized miRNA therapeutics
No full textTackling the COVID-19 “cytokine storm” with microRNA mimics directly targeting the 3’UTR of pro-inflammatory mRNAs
No full textCOVID-19 is characterized by two major clinical phases, the SARS-CoV-2 infection of target cells and tissues, and a deep inflammatory state, known as “cytokine storm”, caused by activation of pro-inflammatory genes, such as NF-kB, STAT-3, IL-6, IL-8, IL-1ß. Among possible anti-inflammatory agents, the “microRNA targeting” should be carefully considered, since it is well known that microRNAs are deeply involved in the expression of cytokines, chemokines and growth factors. The working general hypothesis is that targeting the microRNA network might be important for the development of therapeutic approaches to counteract the COVID-19 induction of inflammatory response. This hypothesis is based on several publications demonstrating the use of miRNA mimics for inhibitory effects on the production of proteins characterizing the COVID-19 “cytokine storm”
- …
