1,721,069 research outputs found
In vivo RGB marking and multicolour cell tracking in the adult brain
No full textIn neuroscience it is a technical challenge to identify and follow the temporal and spatial distribution of cells as they differentiate. We hypothesised that RGB marking, the tagging of individual cells with unique hues resulting from simultaneous expression of the three basic colours red, green and blue, provides a convenient toolbox for the study of the CNS anatomy at the single-cell level. Using ?-retroviral and lentiviral vector sets we describe for the first time the in-vivo multicolour RGB marking of neurons in the adult brain. RGB marking also enabled us to track the spatial and temporal fate of neural stem cells in the adult brain. The application of different viral envelopes and promoters provided a useful approach to track the generation of neurons vs. glial cells at the neurogenic niche, allowing the identification of the prominent generation of new astrocytes to the striatum. Multicolour RGB marking could serve as a universal and reproducible method to study and manipulate the CNS at the single-cell level, in both health and disease
Die Rolle der Glykogen-Synthase-Kinase-3β (GSK-3β) bei der Transformation hämatopoetischer Zellen
No full textIn den letzten Jahrzehnten ist die personalisierte Tumortherapie ein wichtiges Instrument geworden, um Krebserkrankungen gezielter behandeln zu können. Hierfür ist ein detailliertes Verständnis der Pathophysiologie essentiell, um entsprechende Targets zu identifizieren und individualisierte Behandlungskonzepte zu etablieren. GSK-3 (GSK-3α und GSK-3β) ist eine ubiquitär vorkommende Kinase, deren Rolle im Hinblick auf die Entwicklung von Malignomen sowie ihr Wachstum seit Jahren kontrovers diskutiert wird. Ziel dieser Arbeit war es, die Funktion der GSK-3β hinsichtlich ihrer Rolle bei der malignen Transformation von hämatopoetischen Zellen näher zu untersuchen. Hierfür wurden parentale Ba/F3-Zellen sowie Ba/F3-Zellen, die eine konstitutiv aktivierte katalytische Untereinheit der PI3-Kinase α (PI3KCA-H1047R) exprimieren, verwendet. Die PI3-Kinase liegt upstream der GSK-3 und führt durch Aktivierung der Proteinkinase AKT zu einer enzymatischen Inaktivierung der GSK-3. Eine konstitutiv aktive PI3-Kinase ermöglicht Ba/F3-Zellen IL-3-unabhängig zu wachsen. Die GSK-3β-Aktivität wurde durch Anwendung von GSK-3-Hemmstoffen, einer GSK-3β-spezifischen shRNA sowie durch ektope Expression mutierter, aktiver und inaktiver GSK-3β-Varianten moduliert. Nach Hemmstoff-Applikation zeigten parentale Ba/F3-Zellen eine starke, Dosis-abhängige Abnahme der Zellproliferation. Unter Anwendung der GSK-3β-spezifischen shRNA konnte dieser Effekt jedoch weder in der parentalen Zelllinie noch in Ba/F3-PI3KCA-H1047R-Zellen reproduziert werden. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die proliferationshemmenden Effekte der GSK-3-Inhibitoren in Ba/F3-Zellen auf die gleichzeitige Hemmung beider GSK-3-Isoformen oder auf generalisierte, anti-mitogene Effekte, nicht jedoch auf eine singuläre und spezifische Hemmung der β-Isoform zurückzuführen sind. Die ektope Expression einer aktiven GSK-3β-Variante (WT oder S9A) verminderte jedoch signifikant die Transformationsfrequenz in der Ba/F3-PI3KCA-H1047R-Zelllinie um den Faktor zwei während die ektope Expression inaktiver GSK-3β-Mutanten keinen Einfluss auf die PI3K-vermittelte Zelltransformation hatte. Weitere Untersuchungen zeigten, dass die Proliferation sowohl in parentalen Ba/F3-Zellen als auch in der Ba/F3-PI3KCA-H1047R-Zelllinie verringert war, sobald eine aktive Kinase-Variante exprimiert wurde. Die Apoptoserate der Zellen blieb im Gegensatz dazu unbeeinflusst. In Übereinstimmung hiermit konnte in den Zellen mit ektoper Expression einer aktiven Kinase-Variante eine signifikant veränderte Zellzyklusverteilung zugunsten der G1-Phase sowie eine um eine Stunde verminderte Geschwindigkeit beim Durchlaufen der G1-Phase des Zellzyklus nachgewiesen werden. Allerdings konnte im Rahmen dieser Arbeit der genaue, molekulare Mechanismus, über welche Zielmoleküle der Zellzyklus durch GSK-3β beeinflusst wird, nicht entschlüsselt werden. Hier sind weitere Untersuchungen notwendig, um die Rolle der GSK-3β abschließend zu klären. Hierbei sollte ein besonderes Augenmerk auf die Zellzyklusregulatoren Cylin D1 und p27Kip1 gelegt werden.
Weiterhin wurde in dieser Arbeit untersucht, ob GSK-3β in Ba/F3-Zellen einen Einfluss auf die Wirkung von Kinaseinhibitoren hat. Hier zeigte sich, dass die Expression aktiver GSK-3β-Varianten die Chemosensitivät der Zellen gegenüber dem AKT-Hemmstoff MK-2206 nicht beeinflusste, die Sensitivität der Zellen gegenüber dem mTOR-Hemmstoff Everolimus jedoch signifikant erhöhte. Diese Daten weisen darauf hin, dass GSK-3β eine Rolle in der Chemosensitivität hämatopoetischer Zellen gegenüber bestimmten Kinasehemmstoffen spielen könnte.
Insgesamt konnte gezeigt werden, dass GSK-3β im Ba/F3-Zellmodell eine negativ-regulatorische Funktion in der Regulation der zellulären Proliferation und der Induktion der PI3K-vermittelten Transformation in vitro ausübt. Die inhibitorische Funktion ließ sich auf eine verlangsamte Progression durch die G1-Phase und in der Folge auf eine Verschiebung der Zellzyklusverteilung zugunsten der G1-Phase zurückführen. Eine Beeinflussung der Regulation der Apoptose durch GSK-3β oder die Funktion eines Tumorsuppressors konnte in diesem Zellsystem nicht nachgewiesen werden, letzteres möglicherweise aufgrund einer Kompensation durch die α-Isoform. Weil GSK-3β einen zumindest partiellen Schutz vor einem unkontrollierten Wachstum vermittelt und darüber hinaus die hemmende Wirkung von Everolimus und wahrscheinlich weiterer Inhibitoren verstärkt, könnten GSK-3β-Agonisten für eine Behandlung hämatologischer oder anderer, maligner Neoplasien zukünftig in Betracht kommen
Microglia regulate hippocampal neurogenesis during chronic neurodegeneration
No full textNeurogenesis is altered in neurodegenerative disorders, partly regulated by inflammatory factors. We have investigated whether microglia, the innate immune brain cells, regulate hippocampal neurogenesis in neurodegeneration. Using the ME7 model of prion disease we applied gain- or loss-of CSF1R function, as means to stimulate or inhibit microglial proliferation, respectively, to dissect the contribution of these cells to neurogenesis. We found that increased hippocampal neurogenesis correlates with the expansion of the microglia population. The selective inhibition of microglial proliferation caused a reduction in neurogenesis and a restoration of normal neuronal differentiation, supporting a pro-neurogenic role for microglia. Using a gene screening strategy, we identified TGF? as a molecule controlling the microglial pro-neurogenic response in chronic neurodegeneration, supported by loss-of-function mechanistic experiments.By the selective targeting of microglial proliferation we have been able to uncover a pro-neurogenic role for microglia in chronic neurodegeneration, suggesting promising therapeutic targets to normalise the neurogenic niche during neurodegeneration
Influence of the transcription factors Mef2c and Mef2d on hematopoiesis
No full textDie Hämatopoese ist ein fein abgestimmter Prozess, in dem die Differenzierung maßgeblich durch die Aktivität von Transkriptionsfaktoren reguliert wird. Die Wichtigkeit eines Transkriptionsfaktors für die Hämatopoese wird immer dann besonders deutlich, wenn dieser Faktor fehlreguliert ist und die Hämatopoese nicht mehr regelgerecht ablaufen kann. So können Translokationen oder die irreguläre Expression eines Transkriptionsfaktors zur malignen Entartung hämatopoetischer Zellen und damit zur Ausbildung einer Leukämie führen. Eine solche Fehlregulation konnte in Genen, die für Mitglieder der MEF2-Transkriptionsfaktor-Familie kodieren, gezeigt werden. Hohe Expressionslevel von MEF2C wurden in Formen akuter myeloischer Leukämien, ausgelöst durch eine MLL-Translokation, gefunden und sind mit einer schlechten Prognose assoziiert. Auch chromosomale Translokationen des MEF2D-Gens wurden in verschiedenen akuten B-lymphatischen Leukämien gefunden. Um die Rolle dieser zwei Transkriptionsfaktoren in der Hämatopoese besser verstehen zu können, wurden Mef2c- bzw. Mef2d-Einzel-Knockout-Mausmodelle untersucht, wobei jedoch nur ein geringer Effekt auf die Hämatopoese beobachtet werden konnte. Ein Grund hierfür könnten kompensatorische Mechanismen dieser zwei eng verwandten Faktoren sein, weswegen in der hier vorliegenden Arbeit ein Mef2c/d-Doppel-Knockout-Mausmodell (Mef2c/dΔ/Δ-VavCre), in dem Mef2c und Mef2d in allen hämatopoetischen Zellen deletiert sind, untersucht werden sollte. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen zum einen, dass Mef2c und Mef2d für die Entwicklung der B-Lymphozyten und der plasmazytoiden dendritischen Zellen (pDCs) essentiell sind. Zum anderen liefern sie neue Erkenntnisse über die Linienentscheidung einzelner Populationen der Hämatopoese sowie deren Differenzierungswege.
Die ersten Ergebnisse dieser Arbeit wurden bei der Untersuchung des B-Zell-Kompartiments in Mef2c/dΔ/Δ-VavCre-Mäusen erzielt. Alle B-Zell-Populationen des Knochenmarks (proB-, präB, unreife und reife B-Zellen) waren im Vergleich zu Kontroll-Mäusen um mehr als 95 % reduziert. Andere lymphatische Linien, wie die T-Lymphozyten und die NK-Zellen, wurden durch die Deletion von Mef2c und Mef2d hingegen nur wenig beeinträchtigt. Alle drei lymphatischen Linien haben ihren Ursprung in einer gemeinsamen lymphatischen Progenitor-Population, den common lymphoid progenitors (CLPs). Interessanterweise konnten jedoch keine CLPs im Knochenmark von Mef2c/d-Doppel-Knockout-Mäusen detektiert werden. Diese Ergebnisse zeigen einerseits, dass der B-lymphatische Differenzierungsblock bereits zu einem sehr frühen Zeitpunkt der lymphatischen Entwicklung auftritt und andererseits, dass die T-Lymphozyten und NK-Zellen auch noch einen anderen Ursprung als die CLPs besitzen müssen. Die CLPs differenzieren aus multipotenten Progenitoren (MPPs), die zusammen mit den hämatopoetischen Stammzellen (HSC) das so genannte LSK- (Lin-Sca+c-Kit+-) Kompartiment ausmachen. Obwohl die Gesamtzellzahl der LSK-Population durch die Deletion von Mef2c und Mef2d nicht beeinflusst wurde, war der Anteil lymphatisch geprägter Zellen (Vcam-) innerhalb der LSK-Population erhöht.
Zur Identifizierung potentieller Zielgene von Mef2c und Mef2d wurden RNA-Sequencing-Analysen durchgeführt, in denen genomweite Genexpressionsprofile der LSK-Population aus Mef2c/dΔ/Δ-VavCre-Mäusen mit denen aus Kontroll-Mäusen verglichen wurden. Dabei konnten vielversprechende Zielgene von Mef2c und Mef2d identifiziert werden. Viele dieser Zielgene kodieren für Transkriptionsfaktoren, die maßgeblich an der B-lymphatischen Linienentscheidung beteiligt sind. So waren Ebf1 und Pax5 in Mef2c/dΔ/Δ-VavCre-Mäusen beispielsweise um mehr als 90 % herunterreguliert, was mittels quantitativer Realtime-PCR bestätigt wurde.
Die Untersuchung des myeloischen Kompartiments zeigte, dass alle Progenitor-Populationen (granulozytär-monozytär, megakaryozytär und/oder erythrozytär) vergrößert waren. Dies lässt vermuten, dass Mef2c und Mef2d die myeloische Differenzierung entweder inhibieren oder die Expansion des myeloischen Kompartiments unterdrücken. Interessanterweise wurden die Gene Csf1r und Socs1 im LSK-Kompartiment von Mef2c/dΔ/Δ-VavCre-Mäusen heraufreguliert. Csf1r kodiert für einen wichtigen myeloischen Rezeptor und Socs1 für einen Inhibitor des JAK/STAT-Signalweges, was die Hypothese der Unterdrückung der myeloischen Expansion unterstützen könnte.
In dieser Arbeit konnte zudem erstmals gezeigt werden, dass Mef2c und Mef2d die dendritische Differenzierung regulieren. Während die Deletion von Mef2c und Mef2d zwar keinen Einfluss auf die klassischen (c)DCs hatte, waren die pDCs hingegen sehr stark reduziert bzw. nicht vorhanden, was auch in vitro bestätigt werden konnte. Bemerkenswerterweise war die gemeinsame Progenitor-Population (CDP) ebenfalls reduziert, was damit erklärt werden könnte, dass die cDCs noch eine unabhängige Progenitor-Population besitzen. Im klassischen Modell der dendritischen Differenzierung entstammen die cDCs und die pDCs der myeloischen Linie. Ein lymphatischer Ursprung der pDCs wird jedoch vielfach diskutiert. Der lymphatische Differenzierungsblock in Mef2c/dΔ/Δ-VavCre-Mäusen könnte die Hypothese eines gemeinsamen Ursprungs von B-Lymphozyten und pDCs unterstützen. Die Analysen von Mef2c/dΔ/Δ-Cd79aCre-Mäusen, in denen die Deletion von Mef2c und Mef2d erst in den späten CLPs erfolgt, zeigten jedoch eine normale pDC-Differenzierung. Diese Ergebnisse könnten allerdings durch einen gemeinsamen Progenitor der pDCs und B-Lymphozyten oberhalb der späten CLPs (zb. innerhalb der MPP-Population) erklärt werden. Interessanterweise waren Gene, die für den dendritischen Transkriptionsfaktor SpiB und die Interferon response factors (Irf) 7 und 8 kodieren, im LSK-Kompartiment von Mef2c/dΔ/Δ-VavCre-Mäusen herunterreguliert und kommen somit als potentielle Zielgene von Mef2c und Mef2d in Frage.
Zusammengefasst zeigt diese Arbeit, dass Mef2c und Mef2d zentrale Regulatoren der Hämatopoese sind. Die Deletion dieser beiden Transkriptionsfaktoren in einem Mausmodell führt zu einem Differenzierungsblock der B-Zell- und auch der pDC-Linie. Verschiedene Transkriptionsfaktoren, die die Differenzierung dieser beiden Linien regulieren, wurden als potentielle Zielgene von Mef2c und Mef2d identifiziert. Zusätzlich unterstützt diese Arbeit die Hypothese eines gemeinsamen lymphatischen Ursprungs der B-Lymphozyten und der pDCs und unterstreicht die Variabilität der Linienentscheidungen innerhalb des stark heterogenen MPP-Kompartiments.Hematopoiesis is a tightly coordinated process, in which differentiation is regulated by the activity of transcription factors. The importance of a transcription factor for hematopoiesis becomes obvious when the factor is dysregulated and hematopoiesis cannot proceed regularly. Thus, disruption or abnormal expression of a transcription factor might lead to malignant aberration of hematopoietic cells and consequently to development of leukemia. Such a dysregulation has been observed in genes encoding members of the MEF2 family of transcription factors. For one, high expression levels of MEF2C are found in acute myeloid leukemia carrying MLL-translocations and are associated with poor prognosis. Also chromosomal translocations involving the MEF2D gene have been identified in different types of B-lymphatic acute leukemia. To better understand the role of these two transcription factors in hematopoiesis, single Mef2c or Mef2d knockout mice have been investigated, but only a subtle effect on hematopoiesis was observed. As this may be attributable to compensatory mechanisms of these two closely related factors, the aim of this work was to investigate a Mef2c/d double knockout mouse model (Mef2c/dΔ/Δ-VavCre), in which Mef2c and Mef2d are deleted in all hematopoietic cells. The analysis reported here demonstrates that Mef2c and Mef2d are essential for the development of two important immune cell types, B-lymphocytes and plasmacytoid dendritic cells (pDCs), but also revealed novel insight into models of lineage commitment and differentiation.
The first clear result came from examination of the B-cell compartment in Mef2c/dΔ/Δ-VavCre mice. All B cell populations of the bone marrow (proB, preB, immature and mature lymphocytes) were reduced by more than 95% as compared to controls. In contrast, other lymphatic lineages, such as T lymphocytes and NK cells were only minimally impaired by deletion of Mef2c and Mef2d. All three lymphoid lineages are postulated to arise from a common lymphoid progenitor (CLP), but interestingly, no CLPs could be detected in the double knockout mice. This result demonstrates that the severe block to B-cell differentiation occurs at a very early stage of lymphoid commitment, but also shows that T and NK lymphocytes can arise from alternative progenitors. The CLPs differentiate from multipotent progenitors (MPP) that together with the hematopoietic stem cells (HSC) are found within a so-called “LSK” compartment. Although the number of cells within the LSK compartment was not impacted by loss of the Mef2 proteins, phenotypic characterization suggested a skewing toward lymphoid-primed cells (e.g. VCAMneg). To identify potential Mef2c/d target genes, RNA sequencing analysis was performed, in which genome-wide gene expression profiles of LSKs in Mef2c/dΔ/Δ-VavCre mice were compared with the profiles of control mice. Promising Mef2 candidates target genes encoding transcription factors necessary for commitment toward B-cell differentiation were identified. Ebf1 and Pax5 were down-regulated by more than 90 % in Mef2c/d knockout mice, which was confirmed by quantitative real-time analysis.
The second observation was made within the myeloid compartment, where an overall increase in progenitors committed to megakaryocytic, erythroid, monocytic, and/or granulocytic compartments was shown, suggesting the Mef2 factors are necessary to either inhibit myeloid differentiation or to suppress their expansion. Strikingly, evidence for the later hypothesis was obtained by the observation that the Csf1r and Socs2 genes, encoding a key myeloid receptor and an inhibitor of JAK/STAT signaling pathways, respectively, are upregulated in the LSK compartment.
Finally, for the first time, the regulation of dendritic differentiation by Mef2c and Mef2d was discovered. Mef2c/dΔ/Δ-VavCre mice contained normal levels of conventional (c)DCs, but no or greatly reduced levels of pDC – a finding verified with in vitro culture experiments. Interestingly, the absolute level of their proposed common progenitor (CDP) was also reduced, raising the possibility that the cDCs arose from an independent progenitor in these mice. In the classic model of dendritic differentiation, cDCs and pDCs derive from the myeloid line. However, a lymphatic origin of pDCs is widely debated. In view of the observed differential block in B-cell development in Mef2c/dΔ/Δ-VavCre mice, these data may support a common origin of B lymphocytes and pDCs. However, analysis of Mef2c/dΔ/Δ-Cd79aCre mice, in which deletion of Mef2c and Mef2d occurs in late CLPs, did not result in compromised pDC differentiation. Nevertheless, we cannot rule out that a common progenitor of pDCs and B lymphocyte is located above the late CLP, e.g. in a MPP. Interestingly, the genes encoding the dendritic transcription factors SpiB and the interferon response factors (Irf) 7 and 8 were both downregulated in the LSK compartment of the double knockout mouse, and thus are potential key Mef2 target genes that regulate pDC differentiation.
Taken together, this work reveals Mef2c and Mef2d as central regulators of hematopoiesis. Deletion of these two transcription factors in a mouse model leads to a differentiation block in both the B-cell and pDC lineages. Several key transcription factors that regulate differentiation of these lineages were identified as potential Mef2 target genes. Finally, these data support the theory of a common lymphatic origin of these two populations and underline the fluidity of lineage decisions within the highly heterogeneous MPP compartment
Hepatozelluläres Karzinom : Etablierung eines neuen Transplantationsmodells für die Untersuchung der benignen und malignen klonalen Renegeration der Mausleber in vivo
No full textOne major type of primary liver cancer is the hepatocellular carcinoma (HCC), which is the second most leading cause of cancer-related mortality worldwide. Though HCC development has been investigated extensively, the phenotypic and molecular heterogeneity driving HCC initiation still remain largely unknown.
The objective of this thesis was to induce HCC formation via lentiviral-mediated gene transduction and to take advantage of the red/green/blue (RGB) marking system to develop a small animal model to study both benign and malignant clonal regeneration of the liver in vivo. One of three different transgenes, CyclinA2, HRas-V12, and LargeT-antigen, each co-expressed with a Green fluorescent gene, together with “empty” vectors expressing either Cherry (Red), Venus (yellow-Green) or Cerulean (Blue) fluorescent genes, were introduced into primary adult wild-type hepatocytes using the LeGO vector system. Intrasplenic transplantation into urokinase-type plasminogen activator/SCID/Beige (USB) transgenic mice was then performed. Tumor growth was
monitored via repeated magnetic resonance imaging screenings. At the final stage, liver transaminases (ALT) and albumin (ALB) serum concentrations were determined and cryosections and molecular analyses of livers were performed.
Transplantation of primary murine hepatocytes resulted in efficient liver repopulation of all mice. A healthy liver phenotype was observed in the mock-treated group (n=6). RGB control mice (n=12, without oncogene expression) were repopulated by numerous clones with normal ALT and ALB levels. Explanted livers showed normal phenotype with single fibrotic areas. The three different transgenes mediated distinct kinetics of liver regeneration and HCC formation. CyclinA2-transduced hepatocytes were found in small repopulated areas (n=11). Mice had normal ALT and ALB values but minor liver damage was already observable macroscopically. Early signs of malignant transformation were only observed in mice transplanted with HRas-V12-transduced hepatocytes. MRI analyses showed formation of multiple tumor nodules within 3 weeks (n=12). In these mice, ALT was slightly elevated, whereas ALB was normal. LargeT-antigen-transduced hepatocytes caused severe liver damage in transplanted mice as indicated by 6.35-fold up-regulated ALT values but normal ALB and severe tumor formation (n=12). Molecular quantification of vector copy numbers by droplet-digital PCR in relation to a reference gene was in line with immunofluorescence data of GFP and oncoprotein levels: in LargeT-antigen- and RGB-transplanted livers maximum proviral vector copy numbers were found, followed by HRas-V12-modified hepatocytes and CyclinA2-transduced cells. The adapted Barcelona Clinic Liver Cancer (BCLC) staging classified HRas-V12 and LargeT induced hepatocellular carcinomas to an intermediate stage in this experimental setting. Based on these data, HRas-V12 is a promising candidate to study early and intermediate phases of liver carcinogenesis by lentiviral-mediated oncogene transduction and marking. The combination of sensitive cell-marking strategies and oncogene-mediated hepatocarcinogenesis in USB mice can provide new insights in the clonal evolution of HCC, and provides the necessary tools to establish a more realistic and patient-related in-vivo model for the investigation of liver cancer.Eine der häufigsten Formen von Leberkrebs ist das hepatozelluläre Karzinom (engl. hepatocellular carcinoma, kurz: HCC), welches außerdem weltweit als zweithäufigste Ursache krebsinduzierte Letalität bedingt. Auch wenn die Entstehung von HCCs bereits eingehend untersucht wurde, sind die phänotypische und molekulare Heterogenität, welche die Initiierung von HCC bedingen, weitgehend unbekannt. Das Ziel dieser Arbeit war die Induktion der HCC-Entstehung mittels Lentiviral-vermittelter Gentransduktion unter Verwendung des Rot/Grün/Blau (RGB) Markierungssystems, um ein Kleintiermodell für die in vivo Untersuchung der physiologischen aber auch der malignen klonalen Regeneration der Leber zu etablieren. Eins von drei verschiedenen Transgenen, CyclinA2, HRas-V12 und LargeT-Antigen, die jeweils ein grünes Fluoreszenzprotein ko-exprimierten, wurde zusammen mit „leeren“ Vektoren, welche das Cherry (Rot), Venus (Gelb-Grün) or Cerulean (Blau) Fluoreszenzgen exprimierten, mittels LeGO-Vektorsystem in primäre adulte Wildtyphepatozyten eingebracht. Die Hepatozyten wurden anschließend intrasplenal in vier Wochen alte transgene Urokinasetyp-Plasminogenaktivator/SCID/Beige (USB) Mäuse transplantiert. Das Tumorwachstum wurde anhand wiederholter MRT-Messungen beobachtet. Lebertransaminasen (ALT) und Albumin (ALB) Konzentrationen wurden bei der finalen Blutabnahme im Serum bestimmt, sowie Kryoschnitte angefertigt und molekulare Analysen der entnommenen Lebern durchgeführt. Die Transplantation primärer muriner Hepatozyten resultierte in effizienter Leberrepopulation in allen untersuchten Mäusen. Ein gesunder Leberphänotyp konnte in der Mock-behandelten Gruppe beobachtet werden (n=6). RGB-Kontrolltiere wiesen eine Vielzahl an transduzierten Klonen in der repopulierten Leber und außerdem normale ALT- und ALB-Werte auf (n=12, ohne Onkogenexpression). Die entnommenen Lebern waren phänotypisch gesund, jedoch mit einzelnen fibrotischen Arealen. Die drei verschiedenen Transgene zeigten jeweils reproduzierbare Kinetiken der Leberregeneration und HCC-Formation. CyclinA2-transduzierte Hepatozyten konnten in kleinen repopulierten Flächen wieder gefunden werden (n=11). Die Tiere zeigten normale ALT- und ALB-Werte und keine Tumorbildung trotz bereits makroskopisch sichtbaren geringen Leberschadens. Frühe Zeichen der malignen Transformation konnten ausschließlich in Tieren festgestellt werden, in die HRas-V12-transduzierte Leberzellen transplantiert wurden; MRT-Aufnahmen zeigten die Bildung multipler Tumore innerhalb von 3 Wochen nach Transplantation (n=12). In diesen Mäusen waren die ALT-Werte leicht erhöht, während Albumin auf normalem Level blieb. Mit LargeT-Antigen-transduzierte Hepatozyten verursachten massiven Leberschaden in transplantierten Mäusen, angezeigt durch exzessives Tumorwachstum und einen 6,35-fach hoch regulierten ALT-Wert bei normalem ALB (n=12). Molekulare Quantifizierung von Vektorkopiezahlen durch digitale PCR im Vergleich zu einem Referenzgen entsprach den mittels Immunfluoreszenz nachgewiesenen Levels von GFP und den Onkoproteinen: die maximale provirale Vektorkopiezahl wurde in LargeT-Antigen- und RGB-transplantierten Lebern gefunden, gefolgt von HRas-V12-modifizierten Hepatozyten und CyclinA2-transduzierten Zellen. Anhand des angepassten Barcelona Krankenhaus Leberkrebsbewertungssystems (BCLC system) wurden HRas-V12 und LargeT induzierte hepatozelluläre Karzinome als intermediäres Stadium eingestuft. Auf diesen Daten basierend ist HRas-V12 ein vielversprechender Kandidat für die Untersuchung früher und intermediärer Phasen der Leberkarzinogenese durch lentiviral-vermittelte Onkogentransduktion und -markierung. Die Kombination sensitiver Zellmarkierungsstrategien und Onkogen-induzierter Hepatokarzinogenese in USB-Mäusen kann zum Erkenntnisgewinn der klonalen Evolution von HCC führen und liefert die nötigen Hilfsmittel zur Etablierung eines realitätsnahen und Patientenbezogenen in vivo Models zur Erforschung von Leberkrebs
Insertional mutagenesis in retrovirally transduced murine hematopoetic stem cells after serial transduced bone marrow transplantation
No full textUsing a long-term serial bone marrow transplantation assay we have recently observed that retroviral gene marking may result in both benign clonal dominance as well as malignant transformation of single cell clones. The growth advantage of dominant clones has been attributed to insertional mutagenesis, i.e. transcriptional dys-regulation of key growth-regulatory genes due to near-by vector insertions. In order to investigate the physiological role of the CD34 antigen we have of recent performed an analogous serial bone marrow transplantation assay with retroviral vectors encoding murine full-length or truncated CD34 or, as control, eGFP followed by BM transplantation with long-term follow-up. Therefore, 6 animals were serially transplanted for each of the three transgene groups according to our previously published protocol. Similarly to our earlier results, in long-term repopulating bone marrow stem cells we found insertions into genes shown to be involved in cell cycle regulation and stem cell self-renewal such as a Core-binding factor Ą group member (CbfĄ2t3h), runt-related Runx3, Ras p21 protein activator 4 (RasA4), Hematopoietically expressed homeobox (Hhex) or FBJ Osteosarcoma Oncogene B (Fosb). We detected common insertion sites (CIS) within the three groups, but also within the much larger insertional dominance database (IDDb). However, despite the small group size some differences in insertion site patterns were noted for the different transgenes requiring further investigation. It is therefore tempting to speculate that common features as well as differences in insertion pattern of retroviral vectors expressing different transgenes may allow investigating the mutual influence of retroviral vector insertion sites (RVIS), transgenes and host factors during insertional mutagenesis
Optimization and characterization of a TALE nuclease for the production of HIV-resistant T cells for clinical application
No full textBei einer HIV-Infektion handelt es sich um eine behandelbare, aber chronische Erkrankung, die in der Regel eine lebenslange Therapie mit antiretroviralen Medikamenten erfordert. Das Auftreten von Resistenzen, Medikamentenwechselwirkungen und Komorbiditäten machen alternative Ansätze zur Behandlung von HIV-positiven Patienten dennoch notwendig. Aus Beobachtungen ist bekannt, dass ein Fehlen des HIV-Korezeptors CCR5 (C-C Chemokinrezeptor 5) auf humanen Zellen zu einer Resistenz gegenüber den häufigsten HIV-Stämmen führt. Der CCR5-Knockout in autologen Zellen gilt in der Gentherapie als wichtiger Ansatz bei der Entwicklung alternativer Therapiestrategien für HIV-positive Patienten.
Das Ziel der vorliegenden Dissertation bestand in der Optimierung der zuvor entwickelten Designernuklease CCR5-Uco-TALEN. Die optimierte TALEN sollte darüber hinaus mit dem Ziel der Translation in die klinische Anwendung umfassend charakterisiert werden. Zudem sollte ein GMP-kompatibles Protokoll zur Herstellung CCR5-editierter CD4+-T-Zellen entwickelt werden.
Die Untersuchungen im ersten Teil dieser Dissertation zur CCR5-Uco-TALEN Aktivität in humanen T-Zellen, bestätigten eine dosisabhängige Geneditierung am On-Target CCR5 und am Off-Target CCR2. Es konnte erstmals gezeigt werden, dass die CCR5-Uco-TALEN Aktivität in den meisten editierten Zellen (72 %) zu einer biallelischen Geneditierung im CCR5-Lokus führt. Die Analyse weiterer Off-Targets der CCR5-Uco-TALEN identifizierte mehrheitlich homodimere TALEN-Paare als Ursache für die CCR5-Uco-TALEN Aktivität an jenen Loci. Um diese Off-Targets zu eliminieren, wurde die bisher verwendete homodimere Fok1-Schneidedomäne in der CCR5-Uco-TALEN gegen eine obligat heterodimere Variante ausgetauscht. Die neue CCR5-Uco-hetTALEN erlaubt ebenfalls eine sehr effiziente Editierung des CCR5-Lokus und gleichzeitig eine höhere Spezifität, da außer CCR2 keine weiteren Off-Targets detektiert wurden. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die optimierte CCR5-Uco-hetTALEN in Hinblick auf ihre klinische Anwendung charakterisiert. Untersuchungen zur Kinetik am CCR5- und CCR2-Lokus wiesen auf eine Aktivität der CCR5-Uco-hetTALEN nur innerhalb der ersten 72 h nach Elektroporation hin. Gleichzeitige Schnitte an den benachbarten Loci CCR5 und CCR2 können in seltenen Fällen zu Aberrationen des dazwischen liegenden 15-kb-Fragments führen. Im finalen Zellprodukt wurden kleinste Mengen (<1 Kopie/2000 Zellen) der CCR5-Uco-hetTALEN mRNA gefunden. Im dritten Teil der Arbeit konnte mit Hilfe des CliniMACS Prodigy die erfolgreiche GMP-kompatible Produktion von bis zu 5x10^9 humanen CD4+-T-Zellen mit bis zu 40 % biallelisch CCR5-editierten Zellen gezeigt werden. Zusammenfassend wurde in dieser Arbeit, die bereits in Vorarbeiten entwickelte CCR5-Uco-TALEN zur Herstellung HIV-resistenter T-Zellen für eine klinische Anwendung optimiert und ein GMP-kompatibles Protokoll zur automatisierten Produktion von autologen CCR5-editierten CD4+-T-Zellen im großen Maßstab etabliert.HIV infections are a treatable but chronic disease that almost always requires lifelong therapy with antiretroviral drugs. The appearance of drug resistance, drug interactions and comorbidities necessitate nevertheless alternative approaches for treating HIV-positive patients. Observations have revealed that knockout of the HIV coreceptor CCR5 (C-C chemokine receptor 5) in HIV target cells leads to resistance to the most abundant HIV strains. The knockout of CCR5 in patients’ own (autologous) cells has therefore been considered a promising gene-therapy approach for HIV-positive patients.
The aim of this work was to improve the previously developed designer nuclease CCR5-Uco-TALEN. In the next step, the new, optimized TALEN had to be thoroughly characterized for translation towards clinical application. The final task was the development of a GMP-compatible protocol for large-scale production of CCR5-edited CD4+ T cells.
The experiments in the first part of this work on CCR5-Uco-TALEN activity in human T cells confirmed dose-dependent gene editing at the on-target CCR5 and the off-target CCR2. It was also shown that the CCR5-Uco-TALEN activity in most edited cells (76 %) lead to biallelic gene editing in the CCR5 locus. Characterization of other than CCR2 off-targets identified homodimeric TALEN pairs as the main cause for CCR5-Uco-TALEN off-target activity. To eliminate those potential off-targets, the previously used homodimeric Fok1 cleavage domain in the CCR5-Uco-TALEN was exchanged for an obligatory heterodimeric variant. For the novel and highly active CCR5-Uco-hetTALEN no off-targets (except CCR2) could be empirically detected anymore. In the second part of this work, the optimized CCR5-Uco-hetTALEN was characterized in accord with future clinical application. Kinetics studies at the CCR5 and CCR2 locus indicated nuclease activity of CCR5-Uco-hetTALEN only within the first 72 h after electroporation. Simultaneous activity of the CCR5-Uco-hetTALEN at both neighboring loci CCR5 and CCR2 could lead to chromosomal rearrangements of the interjacent 15-kb-fragment. In the final cell product very small residual amounts of CCR5-Uco-hetTALEN mRNA (<1 copy per 2000 cells) were detectable. In the third part of this work, a protocol for the GMP-compatible production of up to 5x10^9 human CD4+ T cells with up to 40 % biallelic CCR5-edited cells was successfully established at the CliniMACS Prodigy
LeGO-Switch, new versatile, inducible lentiviral All-In-One vectors for exact and reliable doxycycline dependent gene expression
No full text
Neue Lentivirale Vektoren für die HIV-Gentherapie
No full textTrotz enormer Verbesserungen der Lebensqualität und -erwartung ist eine Heilung der HIV-Infektion durch die kombinierte antiretrovirale Therapie (cART) nicht möglich. Die dauer-hafte Einnahme der Wirkstoffe führt zwar zu einem Wiederanstieg der CD4+-T-Zellzahl und zu einer Reduktion der Viruslast, eine vollständige Eradikation der Reservoirs wird aber nicht erreicht. Zusätzlich ist cART mit Nebenwirkungen und Langzeittoxizitäten verbunden.
Die Gentherapie stellt eine vielversprechende, potentiell kurative Behandlungsoption für die HIV-Infektion dar. Lentivirale Vektoren (LVV) gelten als interessante Option für die effiziente und stabile genetische Modifikation mit therapeutischen Genen.
Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung lentiviraler Vektoren für die HIV-Gentherapie.
Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob humane primäre B-Zellen sich als körpereigene „Fabriken“ für antivirale Wirkstoffe eignen. Hierfür wurde ein Protokoll für die effiziente Transduktion von B-Lymphozyten mit lentiviralen Partikeln etabliert, die mit den Glykoproteinen des Gibbon ape leukemia virus (GALV) pseudotypisiert waren. Dieses zeichnet sich im Vergleich zu existierenden Protokollen durch eine schonende Prozedur und deutlich höhere Ausbeuten transduzierter Zellen aus. Der Einbau einer B-Zell-spezifischen enhancer-Kassette vor dem hier verwendeten Promotor des Spleen Focus Forming Virus konnte zudem zu signifikanten Expressionssteigerungen in den Zielzellen führen. Zugleich konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass der potentielle Therapiekandidat sC46 (ein HIV-Eintrittsinhibitor) von primären Zellen nicht effizient sezerniert wird.
Im zweiten Teil der Arbeit wurde ein lentivirales System für den Transport von Designer-Nukleasen entwickelt. Diese sequenzspezifischen Nukleasen können resistenzvermittelnde Mutationen (z.B. der Knock-out des HIV-Korezeptors CCR5) induzieren. Der Transport der hier verwendeten TAL-Effektor-Nukleasen (TALEN) war aber aufgrund ihrer Struktur bislang problematisch. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass angesichts repetitiver Sequenzen der Transport über revers transkribierende lentivirale Systeme nicht möglich ist. Die Herstellung einer enzymatisch inaktiven reversen Transkriptase gestattete jedoch die direkte Tanslation der viralen RNA in der Zielzelle. Die Einführung einer internen ribosomalen Eintrittsstelle und eines starken Polyadenylierungssignals in die hier entwickelten nicht-revers transkribierenden lentiviralen Vektoren (NRTLV) resultierte zusätzlich in einer deutlich verstärkten Expression. In Kombination mit optimierten Kulturbedingungen war es so erstmals möglich, TALEN über Lentiviren zu transportieren. Im Gegensatz zu DNA-basierten Vektoren ist durch das hier entwickelte System zusätzlich das Risiko der Insertionsmutagenese minimiert.
Zusammenfassend wurden in dieser Arbeit zwei Vektorsysteme entwickelt, deren Anwen-dung nicht auf die HIV-Gentherapie beschränkt ist. Sie könnten unter anderem bei der Expression anderer therapeutischer Proteine in B-Zellen bzw. bei der transienten Expression problematischer (repetitiver, toxischer etc.) Transgene eingesetzt werden.Although the combined antiretroviral therapy (cART) has markedly improved prognosis and quality of life of HIV-patients, it does not constitute a cure. Moreover, the lifelong application of antiviral drugs has been associated with adverse effects due to drug-related toxicities. Therefore, gene therapy has been considered as a promising alternative.
Lentiviral vectors (LVV) have been established as high-efficiency gene transfer vehicles for a large number of target cells, namely primary cells. Moreover, their relatively well established safety profile makes LVV an attractive choice for gene therapy applications.
The goal of the first part of this work was to develop a strategy to use B lymphocytes for the delivery of antiviral proteins or peptides. It was shown that pseudotyping of LVV with glycoproteins of the Gibbon ape leukaemia virus (GALV) resulted in high titres and efficient transduction. Furthermore, when compared to the currently favoured glycoproteins of measles virus (MV) it revealed a significantly improved total yield of transduced cells for the protocol established here. Additionally, the combination of a B-cell specific enhancer with the spleen focus forming virus promoter (SFFV) resulted in a considerably higher transgene expression in primary human B cells. The present work also showed that secretion of the potential therapeutic gene sC46 by various primary cells is highly inefficient.
The goal of the second part of this study was to develop a lentiviral system for the efficient delivery of designer nucleases. Transient expression of sequence-specific designer nucleases (e.g., TAL effector nucleases (TALENs)) is an attractive option to induce knock-outs in vitro and in future gene therapy applications. In fact, knock-out of the receptor CCR5 can lead to a resistance towards HIV. However, to date lentiviral delivery of TALENs has not been feasible. The present work revealed that this was due to multiple recombination events during reverse transcription induced by the repetitive structure of TALEN-genes. To overcome this problem, novel non-reverse transcribable lentiviral vectors (NRTLV) with an enzymatically inactive reverse transcriptase were developed. Thus a novel lentiviral system based on RNA-delivery was established that circumvents the problem of recombination of repetitive sequences. Inclusion of RNA elements (internal ribosome entry site and polyadenylation signals) resulted in significantly improved expression levels. After optimising the culture conditions, it could for the first time be shown that TALEN delivery by lentiviral vectors is indeed possible. Importantly, this is a purely RNA-based system avoiding the risk of insertional mutagenesis.
In conclusion, two lentiviral vector systems were successfully established, the potential applications of which are not solely limited to HIV gene therapy. In fact, B cells represent interesting vehicles for the expression of various therapeutic genes, while NRTLV should be useful for the transient expression of a variety of “problematic” (repetitive, toxic etc.) transgenes
- …
