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Studio conformazionale di domini funzionali proteici
No full textIl progetto di questo dottorato di ricerca riguarda lo studio conformazionale in soluzione di domini funzionali proteici, mediante l’uso della spettroscopia NMR e di metodi computazionali. In particolare, l’attenzione è stata rivolta allo studio di alcuni fattori di crescita. I fattori di crescita sono proteine coinvolte nella crescita, differenziazione e proliferazione cellulare. Queste proteine possono suddividersi in tre grandi gruppi: IGF (Insulin Growth Factor), FGF (Fibroblast Growth Factor), superfamiglia dei TGF- (Trasforming Growth Factor-beta). La superfamiglia dei TGF- comprende un grande numero di ligandi collegati strutturalmente che giocano un ruolo chiave nella progressione del ciclo cellulare. Un TGF- inizia la trasmissione del segnale (signaling) legandosi a recettori serina/treonina chinasi di tipo I e di tipo II presenti sulla superficie cellulare. In seguito a tale binding, c’è un avvicinamento dei recettori che permette al recettore di tipo II di fosforilare il dominio intracellulare del recettore di tipo I, che poi propaga il segnale attraverso la fosforilazione delle proteine Smad intracellulari. Si forma, quindi, un complesso di proteine Smad che viene traslocato nel nucleo dove va a regolare la trascrizione dei geni target dei TGF-. Poiché la superfamiglia dei TGF- interviene nella crescita e proliferazione cellulare, molti dei suoi membri sono over-espressi, o il loro normale meccanismo è mal regolato, nei casi di crescite anomale di cellule quali i tumori. Proprio questo loro coinvolgimento nella genesi e sviluppo tumorale ha suscitato un grosso interesse scientifico verso lo studio funzionale e strutturale dei TGF-. Tra i numerosi fattori di crescita, una famiglia con caratteristiche particolari è quella chiamata EGF-CFC, di cui la proteina Cripto è il capostipite. I fattori di crescita extracellulari EGF-CFC sono composti da due domini adiacenti ricchi di cisteine: EGF-like (Epidermal Growth Factor-like) e CFC (CRIPTO/FRL-1/Cryptic) di circa 40 residui ciascuno. La proteina Cripto è un elemento fondamentale per il signaling di Nodal, una proteina appartenente ai TGF-. In particolare, Cripto è il co-recettore di Nodal. Infatti, Nodal si lega al complesso recettoriale dell’attivina, formato dai recettori di tipo I (ALK4) e di tipo II (ActRIIB), solo in presenza di Cripto. In questo processo Cripto lega Nodal con il dominio EGF e lega ALK4 con il dominio CFC. Entrambi questi domini di Cripto interferiscono con l’attività onco-soppressiva delle attivine, o bloccando il recettore ALK4 o attraverso il legame all’attivina solubile. Sebbene entrambi i domini siano coinvolti nell’attività tumorigenica di Cripto, il dominio CFC ha un ruolo primario. Data l’importanza che la formazione di questa complessa rete di interazioni riveste, non solo nello sviluppo embrionale, ma anche nella proliferazione di cellule tumorali, è estremamente interessante ottenere informazioni strutturali sui vari fattori proteici coinvolti. Purtroppo, ad oggi, non sono note le strutture tridimensionali né in soluzione né allo stato solido di Cripto, di Nodal e del recettore ALK4. Quindi, nel corso di questo progetto di ricerca è stata intrapresa tale indagine strutturale. In particolare, siamo partiti dallo studio strutturale attraverso NMR in tampone fosfato del dominio CFC da topo e umano. I modelli molecolari ottenuti esibiscono una forma complessivamente ellissoidale e il folding è globalmente esteso con tre strand collegati dai tre ponti disolfuro. E’ importante notare che i residui ritenuti responsabili del binding con il recettore ALK4 (His9 e Trp12) non sono localizzati nel core proteico, ma si ritrovano posizionati tra la fine del primo strand e l’inizio del primo loop, con le catene laterali esposte esternamente. Opposto al sito di binding, è localizzato un cluster di residui idrofobici che potrebbe svolgere una funzione stabilizzante dell’intera struttura proteica attraverso binding col dominio EGF-like, oppure potrebbe essere rilevante per la formazione d’interazioni intermolecolari. Per approfondire lo studio strutturale sull’interazione del dominio CFC con il recettore ALK4, è stato costruito il modello per omologia del dominio extra-cellulare (ECD) di ALK4, basandosi sulla struttura cristallografica del recettore umano ALK3 (identità di sequenza 27 %) ed è stata modellata la struttura tridimensionale del complesso CFC/ALK4-ECD, usando docking macromolecolare assistito da dati sperimentali. Le soluzioni del docking sono state selezionate considerando i risultati degli studi di mutagenesi che indicano i residui H9 e W12 di CFC cruciali per il binding con il recettore ALK4. In base alle analisi condotte è stato scelto un modello rappresentativo del complesso CFC/ALK4-ECD che presenta buona complementarità di superficie, contatti elettrostatici e idrofobici favorevoli, basso valore dell’energia totale. Questo modello, consistente con i dati precedenti di mutagenesi, fornisce una base strutturale per la progettazione di analoghi modificati, che potranno confermare le ipotesi di interazione molecolare tra CFC ed ALK4 ed eventualmente funzionare come antagonisti. Infine, abbiamo puntato la nostra attenzione su Nodal. La proteina Nodal è un omodimero di 220 amminoacidi con 14 cisteine, che formano 6 ponti disolfuro intra-catena e uno inter-catena che lega i due monomeri. E’ stato costruito un modello per omologia sia del monomero sia del dimero della variante umana, utilizzando cinque templati. Il modello di Nodal ottenuto per homology modelling, conserva il nodo di cisteina caratteristico della superfamiglia dei TGF- ed è formato da due -sheet antiparalleli e un -elica perpendicolare ai -sheet. I modelli ottenuti conservano le regioni caratteristiche di binding del recettore di tipo I (‘wrist epitope’) e del recettore di tipo II (‘knucle epitope’) Contemporaneamente, per avere informazioni strutturali in soluzione di Nodal sono stati sintetizzati e caratterizzati tre frammenti, che riproducono tratti di sequenza presumibilmente coinvolti nel legame con i suoi partner proteici. L’ analisi conformazionale NMR evidenzia, nelle condizioni sperimentali adoperate, una fedele riproduzione strutturale dei relativi tratti nella proteina parente. Dall’insieme dei risultati ottenuti, sia mediante NMR che mediante homology modelling, si possono evidenziare elementi strutturali potenzialmente rilevanti per il binding con i recettori o altri partner proteici. In conclusione, questo lavoro di ricerca ha consentito l’acquisizione di informazioni strutturali, finora sconosciute, sulle componenti del complesso proteico che è alla base del meccanismo di signaling di Nodal via Cripto e ha permesso di formulare ipotesi sugli elementi strutturali rilevanti ai fini delle mutue interazioni. Per confermare tali ipotesi è stato avviato uno studio di binding “Real Time Bia” con tecnica Surface Plasmon Resonance (SPR) utilizzando uno strumento BIACORE 3000. Sebbene diversi esperimenti siano stati già condotti, occorrono tuttavia ulteriori prove per arrivare a chiarire il quadro completo di questa complessa rete d’interazioni
Essential Dynamics captures the concerted motion of the integrin-binding site in jerdostatin, an RTS disintegrin
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Protein dynamic properties: essential dynamics method vs. NMR backbone dynamics
No full textProteins are dynamic systems whose internal motions and resulting conformational changes are essential for their functional skills. While the rigidity is required to maintain the structure, flexibility is needed to perform the function. The study of protein flexibility can be handled by both experimental, such as NMR backbone dynamics in solutions, and computational methods, such as molecular dynamics simulations. The major problem with molecular dynamics simulations is due to the conformational sampling efficiency that requires long times of calculation. In recent decades a new computational approach, based on the essential dynamics sampling (EDS) has been applied to the study of protein flexibility, folding etc. In essential dynamics sampling, an usual molecular dynamics simulation is performed, but only those steps, not increasing the distance from a target structure, are accepted. This method offers the possibility of representing protein dynamics in the essential subspace only, so reducing the complex protein dynamics to its essential degrees of freedom.
In this work we apply ED simulations to identify flexible regions in two protein systems previously studied by NMR backbone dynamics
Conformation and calcium-binding properties of a bicyclic nonpeptide
No full textThe conformation and calcium binding properties of the bicyclic nonapeptide BCP2, cyclo-(Glu(1)-Ala(2)-Pro(3)-Gly(4)-Lys(5)-Ala(6)-Pro(7)-Gly(8))-cyclo-(1 gamma --> 5 epsilon) Gly(9), have been investigated by means of NMR spectroscopy. Interproton distances, evaluated by, nuclear Overhauser effect (NOE) contacts, and phi angles, from (3)J(NH-alpha CH), have been used to obtain a feasible model for the BCP2-Ca2+ (BCP: bicyclic peptide) complex by means of restrained molecular dynamics (RMD). The NMR analysis of the free peptide, carried out in CD3CN, shows the presence in solution of at least four conformers in intermediate exchange rate. The addition of calcium ions caused the appearance of a new set of resonances, differing from those observed for the free BCP2. A comparison with published data about the conformational behavior of the closely analogous peptide BCP3, differing from BCP2 for two Leu residues instead of two Ala residues in positions 2 and 6, shows that this simple substitution dramatically increases the peptide flexibility. On the contrary, upon calcium ion addition, both BCP2 and BCP3 reach a strictly, close conformation, as strongly testified by the almost identical H-1-NMR spectra exhibited by both peptides. The RMD molecular model of the BCP2-Ca2+ complex, here reported, is a quite symmetric structure, presenting a three-dimensional cavity ideal for the binding of spherical cations. Four carbonyls from the main ring (Ala(2), Gly(4), Ala(6) and Gly(8)) point toward it, offering, together with the two carbonyls of the peptide bridge (Gly(9) and gamma Glu(1)), putative coordinations to the cation
PASTA sequence composition is a predictive tool for protein class identification
No full textAbstract
PASTA domains are small modules expressed in bacteria and found in one or multiple copies at the C-terminal end of
several penicillin binding proteins (PBPs) and Ser/Thr protein kinases (STPKs) and represent potential targets for a new
class of antibiotics. PASTA domains are currently annotated as sensor domains, as they are thought to activate their cognate
proteins in response to binding to opportune ligands. However, recent studies have shown that PASTA domains linked to
proteins of different classes, STPKs or PBPs, do not share the same binding abilities. Despite this, there is currently no way
to distinguish between PASTA domains from the two classes, since all of them share the same fold, independent of the class
they belong to. To identify a predictive tool of class identification, we here analyse a pool of parameters, including amino
acid compositions and total charges of PASTA domains either linked to PBPs or to STPKs. We screened sequences from
Actinobacteria, Firmicutes and Bacteroidetes. The first two phyla include some of the most dangerous micro-organisms for
human health such as Mycobacterium tuberculosis and Staphylococcus aureus. Based on this analysis, our study proposes
a predictive method to assign PASTA domains with unknown origin to their corresponding enzyme class, based solely on
sequence information
Effect of the addition of a non-ionic surfactant on the complex poly(asparagine)-cationic surfactant
No full textPoly(asparagine) (pAsn) at 0.1wt % in the presence of dodecyltrimethylammonium bromide (DTAB) and pentaoxyethylene octyl ether (C8E5) at 1:1 molar ratio leads to the formation of mixed DTAB/C8E5 micelle-like aggregates onto the polypeptide as a total surfactant critical association concentration (cac) is reached, as revealed by surface tension measurements and NMR chemical shifts. Two-dimensional nuclear Overhauser enhancement spectroscopy (NOESY) capable of revealing spatial relationships among proximal protons has been performed on the pAsn-DTAB-C8E5-water system to study structural details of the surfactant-polypeptide aggregates. NOESY cross-peaks at sample temperature of 298.15 K indicate that the polypeptide interacts with the DTAB/C8E5 micelle-like aggregates. The NOE intermolecular effects also show direct interactions between surfactant and polypeptide in the pAsn-DTAB-water system, whereas no interaction has been revealed in the pAsn-C8E5-water system. Furthermore, the experimental evidence suggest that the DTAB-polypeptide complex is mainly driven by the polar attraction between the two molecule
NMR structure ensembles of protein-protein complexes: analysis of the interface variability and selection of a representative conformer
No full textCalcium Binding model peptides : a spectrosopic study
No full textMetal ions play a variety of functions in proteins, spanning from the enhancement of structural stability in a conformation required for biological functions to the assistance in enzymatic processes.[1] An increasing attention has been paid to the study of mechanism of action of metallo-proteins as well as to the definition of their structural features. The use of low molecular weight 'model compounds' is a widely used approach to investigate metallo-protein properties, especially when structural details are not available or not yet unambiguous. In particular bicyclic peptides are known to be interesting models for the naturally occurring metal binding peptides and also to be able to mimic the three-dimensional structure of protein sites better than linear or monocyclic analogs. In our research group, bicyclic peptide models able to co-ordinate metal ions were designed and structurally characterized. In one of our studies we examined, by CD and NMR spectroscopy, a bicyclic undecapeptide designed to mimic structure and calcium binding properties of Calmodulin (CaM) site I.[2] The average model from RMD calculations exhibit good analogies with the natural site I. The model system, when compared with the reference system (Asp20-Glu31 segment in CaM), shows similar dimensions and an effective superimposition of the respective sequence segments. The remaining segments of the model peptide exhibit a bending that is intermediate between that of the free and Ca2+-coordinate site I. We also studied the conformation and calcium binding properties of a bicyclic peptide BCP2[3] which does not strictly reproduce any natural system. Indeed BCP2 belongs to a series of synthetic peptides designed to study, in a systematic way, the structure requirements for calcium binding ability. The spectroscopic characterization, via CD, NMR and RMD, shows that BCP2 is strikingly respondent to the design expectations. Here our results on these model peptide systems, which are able to co-ordinate calcium ion, will be discussed
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