16 research outputs found
Redifferentiation of dedifferentiated primary chondrocytes in silk-based hydrogels assisted by shockwave treatment
No full textCartilage is an avascular and aneural tissue, therefore the regeneration potential is limited and neochondrogenesis time-consuming and difficult to achieve. Acute injuries and chronic disorders such as arthritis lead to the degeneration of cartilage, which results in limited mobility accompanied with pain and diminished healing without surgical intervention. Since clinical outcomes for patients have mostly been unsatisfactory in the past, transplantation of tissue engineered cartilage has been introduced as a promising alternative treatment strategy. In this respect, silk-based hydrogels are an interesting biomaterial candidate for cartilage tissue engineering due to their biocompatibility and outstanding mechanical properties. Previously, one of the major bottlenecks of cellular therapies aiming to restore cartilage function through autologous cell/tissue transplantation has been the need for high cell numbers. In particular, reliable culture formats preventing the dedifferentiation of primary cartilage cells (chondrocytes) in response to prolonged culture for in vitro cell expansion have been hardly addressed so far. In this study, we established a protocol for the three-dimensional cultivation and redifferentiation of dedifferentiated chondrocytes over 14 days. This included testing two different strategies to uniformly seed the cells into polymerizing silk hydrogels, a layer-by-layer approach and a direct encapsulation approach. Dedifferentiated chondrocytes were encapsulated in silk-based hydrogels and subjected to extracorporeal shockwave treatment (ESWT) after passage 6 in cell suspension (representing the dedifferentiated state) and/or 24 hours after encapsulation within the hydrogels (marking the begin of redifferentiation). Reverse transcription quantitative polymerase chain reaction (RT qPCR) analysis of collagen type I and II expression levels demonstrated that dedifferentiation of primary chondrocytes in standard monolayer (two-dimensional) culture conditions occurred already after 5 passages. ESWT-treated chondrocytes encapsulated in silk hydrogels showed significantly elevated collagen type II and reduced collagen type I expression levels compared to untreated controls. This is of significance as articular cartilage is defined by a high collagen II/collagen I ratio. Furthermore, western blot analysis demonstrated that, over a culture period of 14 days, chondrogenic redifferentiation occurred, however, no significant difference in protein levels of collagen type I and II was observed between the control and the ESWT-treated groups. Interestingly, the GAG/DNA ratio increased significantly after 14 days when ESWT was applied compared to untreated controls, which correlated with RT-qPCR results. These results were further confirmed by Alcian blue stainings which demonstrated a greater extent of glycosaminoglycan (GAG) secretion after ESWT treatment compared to untreated controls. Additionally, histological stainings showed that, after 14 days of redifferentiation, the secretion of collagen type II was higher in the ESWT group compared to controls, while collagen type I could not be detected. Summarizing, the established method allows homogenous cell distribution within the hydrogels and ESWT promotes chondrogenic redifferentiation without the need for growth factors and/or defined differentiation media. Therefore, this culture system opens the door for a simple method to engineer cartilage-like tissue constructs for use as in vitro tissue models and/or as regenerative tissue transplants.Knorpelgewebe ist avaskulär und aneural, daher besitzt es sehr eingeschränkte Fähigkeiten zur Selbstheilung. Aus diesem Grund kann meist nach einer Verletzung ohne chirurgischen Eingriff keine Besserung erzielt werden, wodurch auf dem Gebiet der Rekonstruktionschirurgie ein sehr hoher Bedarf an Knorpelgewebe besteht. In dieser Hinsicht ist das Transplantieren von knorpelähnlichem Gewebe mit der Hilfe von diversen Biomaterialien als Alternativbehandlung im Bereich Tissue Engineering entstanden. Aufgrund der Biokompatibilität und der einzigartigen mechanischen Eigenschaften haben sich auf Seide basierende Hydrogele als sehr vielversprechend für Knorpelrekonstruktion erwiesen. Ziel dieser Arbeit ist es, eine neue Methode, zur Herstellung von dreidimensionalen auf Seide basierende Hydrogele zu etablieren. Dazu wurden zwei verschiedene Ansätze zur Herstellung entwickelt. Ein System mit drei Schichten und ein weiteres indem das Hydrogel mit demselben Volumen direkt hergestellt wurde. Zusätzlich wurde durch eine Stoßwellentherapie die chondrogene Differenzierung unterstützt. Des Weiteren wird gezeigt, dass primäre Chondrozyten unter Standard 2D-Zellkulturbedingungen spontan dedifferenzieren und nach Einbettung in einer 3D Seidenfibroin-Matrix mit Hilfe der Stoßwellentherapie innerhalb 14 Tagen wieder redifferenzieren. Mittels RT-qPCR Analyse können wir bestätigen, dass die transkriptionelle Aktivität von Kollagen II vor allem in der Stoßwellen Gruppe, verglichen mit der Kontrollgruppe, im innerhalb 14 Tage beträchtlich ansteigt. Dabei war kein signifikanter Unterschied zur Genexpression von Kollagen I zwischen den beiden Gruppen ersichtlich. Dies ist insofern von Bedeutung, da im nativen atikulären Knorpel das Verhältnis von Kollagen II zu Kollagen I sehr hoch ist. Darüber hinaus konnten sowohl mittels GAG-Assay als auch einer histochemischen Färbung die Resultate der RT-qPCR bestätigt werden. Dabei remodellieren die eingebetteten Zellen innerhalb von 14 Tagen die umgebene Matrix zum Teil und Kollagen II, sowie Glykosaminoglykane sekretieren. Hervorzuheben ist, dass bei der Western-Blot Analyse die chondrogene (Re)Differenzierung im Zeitraum von 14 Tagen stattfand, aber, im Vergleich zu den anderen Analyseverfahren, kein signifikanter Unterschied zwischen den beiden Gruppen detektiert werden konnte. Die vorgestellte Methode in dieser Arbeit erlaubt eine homogene Zellverteilung in den Hydrogelen und der Einfluss der Stoßwelle unterstützt die chondrogene Redifferenzierung ohne der Zugabe von differenzierungsstimulierenden Faktoren wie Wachstumsfaktoren oder Ähnlichem. Auch wenn die vorliegende Arbeit das Verständnis von chondrogener Redifferenzierung in tissue-engineertem Knorpel konstrukten erweitert hat, sind weitere Untersuchungen nötig. Dennoch sehen wir dieses Konzept als eine vielversprechende Strategie für Transplantate oder als in vitro Modell von knorpelähnlichem Gewebe.Masterarbeit Wien, FH Technikum Wien 201
Secretome products derived from human induced pluripotent stem cells for cell-free bone tissue engineering
No full textDie Materialwissenschaft profitiert erheblich von den rasanten Entwicklungen im Bereich des maschinellen Lernens und der breiten Verfügbarkeit von Grafikprozessoren. Insbesondere werden maschinell erlernte Kraftfelder (MLFFs) zunehmend in einer Vielzahl von Anwendungen,wie beispielsweise Molekulardynamik-Simulationen oder evolutionären Algorithmen,anstelle von Dichtefunktionaltheorie-(DFT)-Codes eingesetzt. Dadurch werden Rechenzeitenum Größenordnungen reduziert und es können wesentlich größere Systeme simuliert werden.Das archetypische Perowskitoxid Strontiumtitanat (SrTiO3) und insbesondere seine Oberflächenspielen eine zentrale Rolle in zahlreichen technologischen Anwendungen, wie etwa Photovoltaik und Katalyse. SrTiO3-Oberflächen rekonstruieren, was bedeutet, dass sich die Periodizität und Stöchiometrie der äußeren Schichten vom Festkörperkristall unterscheiden.Die Charakterisierung und Modellierung solcher Rekonstruktionen in atomarer Auflösung ist wesentlich für technologischen Fortschritt.Im Mittelpunkt dieser Arbeit steht die Untersuchung atomarer Modelle der polaren, (110)-orientierten SrTiO3-Oberflächen mit (n × 1)-Periodizität relativ zur (1 × 1)-Einheitszelle des Festkörperkristalls. Ein Ziel ist es, die verschiedenen experimentell beobachtbaren Motive zu modellieren. Diese Motive reichen von (n × 1)-Rekonstruktionen mit vergleichsweise geringerem Ti-Gehalt in den äußeren Schichten, bis hin zu (2 × m)-Rekonstruktionen mit entsprechend höherem Ti-Anteil.Für die Analyse der zugehörigen Potentialhyperflächen wurden MLFFs auf limitierten DFT-Daten trainiert und zusammen mit der Covariance Matrix Adaptation Evolution Strategy (CMA-ES) eingesetzt. In der ersten Studie wurde diese Methode erfolgreich zur Untersuchung von SrTiO3(110)-(n × 1) Rekonstruktionen angewendet und die Eignung der gewählten Methode bestätigt. Für die Studie von größeren und komplexeren Systemen wurde ein Active Learning-Ansatz (AL) zur iterativen Verbesserung der MLFFs implementiert. Sowohl ein schnell trainierbares, invariantes deskriptor-basiertes MLFF als auch ein hochpräzises,äquivariantes message passing MLFF wurden genutzt. Das AL wurde durch Methoden zur Unsicherheitsabschätzung basierend auf interatomaren Kräften ermöglicht, die sowohl auf ganze Strukturen als auch auf lokale Umgebungen angewendet wurden.Zudem wurde in der zweiten Veröffentlichung das Python-Framework Clinamen2 Kurzfassung entwickelt, das die benötigten Funktionen für das AL und die CMA-ES basierte Suche bereitstellt.In der abschließenden Veröffentlichung wurden vier neue atomare Modelle zu SrTiO3(110)-(2 × m) Motiven mit hohem Ti-Anteil identifiziert. Diese Motive finden sich alle auf einer einzigen inhomogenen Oberflächenprobe wieder. Zu den Ergebnissen dieser Arbeit gehören eine Datenbank mit verschiedenen SrTiO3(110)-(n × m) Strukturen und darauf trainierte MLFFs, sowie ein Workflow, der auch auf andere komplexe Materialien anwendbar ist
Extracellular matrix from hiPSC-mesenchymal progenitors modulates the three-lineage differentiation of human bone marrow stromal cells
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Effect of Diphenyleneiodonium Chloride on Intracellular Reactive Oxygen Species Metabolism with Emphasis on NADPH Oxidase and Mitochondria in Two Therapeutically Relevant Human Cell Types
No full textReactive oxygen species (ROS) have recently been recognized as important signal transducers, particularly regulating proliferation and differentiation of cells. Diphenyleneiodonium (DPI) is known as an inhibitor of the nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase (NOX) and is also affecting mitochondrial function. The aim of this study was to investigate the effect of DPI on ROS metabolism and mitochondrial function in human amniotic membrane mesenchymal stromal cells (hAMSCs), human bone marrow mesenchymal stromal cells (hBMSCs), hBMSCs induced into osteoblast-like cells, and osteosarcoma cell line MG-63. Our data suggested a combination of a membrane potential sensitive fluorescent dye, tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM), and a ROS-sensitive dye, CM-H2DCFDA, combined with a pretreatment with mitochondria-targeted ROS scavenger MitoTEMPO as a good tool to examine effects of DPI. We observed critical differences in ROS metabolism between hAMSCs, hBMSCs, osteoblast-like cells, and MG-63 cells, which were linked to energy metabolism. In cell types using predominantly glycolysis as the energy source, such as hAMSCs, DPI predominantly interacted with NOX, and it was not toxic for the cells. In hBMSCs, the ROS turnover was influenced by NOX activity rather than by the mitochondria. In cells with aerobic metabolism, such as MG 63, the mitochondria became an additional target for DPI, and these cells were prone to the toxic effects of DPI. In summary, our data suggest that undifferentiated cells rather than differentiated parenchymal cells should be considered as potential targets for DPI
Front Bioeng Biotechnol / Engineering of extracellular matrix from human iPSC-mesenchymal progenitors to enhance osteogenic capacity of human bone marrow stromal cells independent of their age
No full textRegeneration of bone defects is often limited due to compromised bone tissue physiology. Previous studies suggest that engineered extracellular matrices enhance the regenerative capacity of mesenchymal stromal cells. In this study, we used human-induced pluripotent stem cells, a scalable source of young mesenchymal progenitors (hiPSC-MPs), to generate extracellular matrix (iECM) and test its effects on the osteogenic capacity of human bone-marrow mesenchymal stromal cells (BMSCs). iECM was deposited as a layer on cell culture dishes and into three-dimensional (3D) silk-based spongy scaffolds. After decellularization, iECM maintained inherent structural proteins including collagens, fibronectin and laminin, and contained minimal residual DNA. Young adult and aged BMSCs cultured on the iECM layer in osteogenic medium exhibited a significant increase in proliferation, osteogenic marker expression, and mineralization as compared to tissue culture plastic. With BMSCs from aged donors, matrix mineralization was only detected when cultured on iECM, but not on tissue culture plastic. When cultured in 3D iECM/silk scaffolds, BMSCs exhibited significantly increased osteogenic gene expression levels and bone matrix deposition. iECM layer showed a similar enhancement of aged BMSC proliferation, osteogenic gene expression, and mineralization compared with extracellular matrix layers derived from young adult or aged BMSCs. However, iECM increased osteogenic differentiation and decreased adipocyte formation compared with single protein substrates including collagen and fibronectin. Together, our data suggest that the microenvironment comprised of iECM can enhance the osteogenic activity of BMSCs, providing a bioactive and scalable biomaterial strategy for enhancing bone regeneration in patients with delayed or failed bone healing
DataSheet1_Engineering of extracellular matrix from human iPSC-mesenchymal progenitors to enhance osteogenic capacity of human bone marrow stromal cells independent of their age.docx
No full textRegeneration of bone defects is often limited due to compromised bone tissue physiology. Previous studies suggest that engineered extracellular matrices enhance the regenerative capacity of mesenchymal stromal cells. In this study, we used human-induced pluripotent stem cells, a scalable source of young mesenchymal progenitors (hiPSC-MPs), to generate extracellular matrix (iECM) and test its effects on the osteogenic capacity of human bone-marrow mesenchymal stromal cells (BMSCs). iECM was deposited as a layer on cell culture dishes and into three-dimensional (3D) silk-based spongy scaffolds. After decellularization, iECM maintained inherent structural proteins including collagens, fibronectin and laminin, and contained minimal residual DNA. Young adult and aged BMSCs cultured on the iECM layer in osteogenic medium exhibited a significant increase in proliferation, osteogenic marker expression, and mineralization as compared to tissue culture plastic. With BMSCs from aged donors, matrix mineralization was only detected when cultured on iECM, but not on tissue culture plastic. When cultured in 3D iECM/silk scaffolds, BMSCs exhibited significantly increased osteogenic gene expression levels and bone matrix deposition. iECM layer showed a similar enhancement of aged BMSC proliferation, osteogenic gene expression, and mineralization compared with extracellular matrix layers derived from young adult or aged BMSCs. However, iECM increased osteogenic differentiation and decreased adipocyte formation compared with single protein substrates including collagen and fibronectin. Together, our data suggest that the microenvironment comprised of iECM can enhance the osteogenic activity of BMSCs, providing a bioactive and scalable biomaterial strategy for enhancing bone regeneration in patients with delayed or failed bone healing.</p
Prolonged cultivation enhances the stimulatory activity of hiPSC mesenchymal progenitor-derived conditioned medium
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