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PROGETTO PUBBLICATO: Riqualificazione del Piazzale Europa con riordino dell’area mercatale e Sistemazione spondale del fiume Po con realizzazione di piste ciclabili. [Testo: I. Ostellino]
No full textProgetto per il nuovo waterfront di San Mauro Torinese (TO)
PROGETTO PUBBLICATO: Riqualificazione del Piazzale Europa con riordino dell’area mercatale e Sistemazione spondale del fiume Po con realizzazione di piste ciclabili. [Testo: A. Costa]
No full textProgetto per il nuovo waterfront di San Mauro Torinese (TO)
Il medico di medicina generale tra etilometro e fonendoscopio : qQuale ruolo del medico di famiglia nell’attuale quadro normativo?
No full textPer comprendere quale sia il ruolo del medico di famiglia all’interno dell’attuale quadro normativo inerente all’idoneità alla guida si è ritenuto indispensabile eseguire una disamina dello stesso, non solo per individuarne gli eventuali compiti, ma anche per cercare di fornire, attraverso una sintesi dei punti principali, gli elementi utili per una informazione del paziente: base di ogni attività medica.
1. Patente di guida ed idoneità: normativa vigente
Un fattore fondamentale che contribuisce ad aumentare la sicurezza stradale e a prevenire, pertanto, le conseguenze disastrose degli incidenti del traffico, consiste nella valutazione della piena idoneità psico-fisica e psicotecnica degli utenti della strada.
Coloro i quali si mettono alla guida di veicoli devono essere in possesso di requisiti fisici e psichici minimi, diversi a seconda delle tipologie e/o categorie dei mezzi; requisiti che costituiscono garanzia della propria e dell’altrui incolumità, unitamente alla capacità tecnica alla guida e alla buona conoscenza delle norme che regolano la circolazione stradale.
A tal fine la Legge prevede, per tutti coloro che intendono ottenere il certificato di idoneità alla guida, una serie di accertamenti che attestino il possesso di tali requisiti minimi e l’assenza di malattie invalidanti che potrebbero limitare la capacità di guida, nonché l’esistenza di vari organismi accertatori, sia di primo che di secondo grado.
1.1 Accertamento dell’idoneità psico-fisica
L’art. 115 del Codice della Strada così afferma: “Chi guida veicoli o conduce animali deve essere idoneo per requisiti fisici e psichici “.
L’art. 119 del suddetto Codice (D.Lgs. n. 285/92 e successive modifiche) così ribadisce: “Non può ottenere la patente di guida o l’autorizzazione ad esercitarsi alla guida [...], chi sia affetto da malattia fisica o psichica, deficienza organica o minorazione psichica, anatomica o funzionale tale da impedire di condurre con sicurezza veicoli a motore”.
Il suddetto articolo, al comma 2, stabilisce, inoltre, che il cittadino (con l’eccezione dei soggetti diabetici, per i quali esiste una specifica disciplina: si veda di seguito), per l’accertamento del possesso dei requisiti psico-fisici necessari per il rilascio, la revisione o la conferma della patente di guida, attualmente può rivolgersi ad uno dei seguenti medici accertatori:
• Medici dell’Ufficio della ASL, territorialmente competente, cui sono attribuite funzioni in materia medico-legale;
• Medico responsabile dei servizi di base del distretto sanitario;
• Medico appartenente al ruolo del Ministero della Salute;
• Medico ispettore delle Ferrovie dello Stato;
• Medico militare in servizio permanente effettivo;
• Medico del ruolo professionale dei sanitari della Polizia di Stato;
• Medico del ruolo sanitario del Corpo Nazionale dei Vigili del Fuoco;
• Medico ispettore del Ministero del Lavoro.
Lo stesso comma stabilisce che le visite mediche per il rilascio del certificato di idoneità alla guida devono essere effettuate in gabinetti medici, dotati delle attrezzature necessarie allo scopo.
In alcuni casi, il rilascio del certificato di idoneità alla guida è rilasciato dalle Commissioni Mediche Locali (CML), organismi costituiti di norma presso le Unità Sanitarie Locali del capoluogo di ciascuna provincia. Tali Commissioni, così come contemplato dal comma 4, effettuano l’accertamento dei requisiti fisici e psichici nei riguardi di:
• Soggetti diabetici con patenti C, D, CE, DE e sottocategorie (si veda anche oltre);
• Coloro per cui è fatta richiesta dal Prefetto o dall’Ufficio competente del Dipartimento per i Trasporti Terrestri;
• Coloro che abbiano superato i 65 anni di età ed abbiano titolo a guidare autocarri, autotreni ed autoarticolati;
• Coloro nei confronti dei quali gli accertamenti clinici, strumentali e di laboratorio facciano sorgere dubbi circa l’idoneità al medico accertatore;
• Mutilati e minorati fisici.
Avverso il giudizio delle CML (comma 5) è ammesso il ricorso, entro trenta giorni, al Ministro delle Infrastrutture e dei Trasporti.
Le CML sono composte dal responsabile dell’ufficio medico-legale della ASL relativa, che svolge le funzioni di presidente, e da due medici scelti fra quelli autorizzati a certificare l’idoneità di guida.
Quando l’accertamento medico riguarda mutilati o minorati fisici, le commissioni sono integrate da un ingegnere del Dipartimento dei Trasporti Terrestri e da un medico in servizio nei centri territoriali di riabilitazione. Qualora siano sottoposti a visita aspiranti conducenti che manifestano comportamenti o sintomi associabili a patologie alcool-correlate, le Commissioni Mediche sono integrate dalla presenza d un medico dei servizi per lo svolgimento delle attività di prevenzione, cura, riabilitazione e reinserimento sociale dei soggetti con problemi e patologie alcool-correlati. Può intervenire, ove richiesto dall’interessato, un medico di sua fiducia.
Sia i medici di cui al comma 2, che le commissioni mediche di cui al comma 4, possono richiedere, qualora lo ritengano opportuno, che l’accertamento dei requisiti fisici e psichici sia integrato da specifica valutazione psico-diagnostica, effettuata da psicologi abilitati all’esercizio della professione ed iscritti all’albo professionale.
1.2 Accertamento nei diabetici
Per ottenere il rilascio, il rinnovo e la conferma delle patenti di guida, un soggetto diabetico segue, in sintesi, il seguente iter procedurale.
Per il conseguimento, revisione o la conferma delle patenti di categoria A, B, BE e sottocategorie i richiedenti affetti da diabete anche in trattamento insulinico, si recano a visita di idoneità alla guida da uno specialista nell’area diabetologica e delle malattie del ricambio dell’Ufficio dell’Unità Sanitaria Locale cui sono attribuite funzioni in materia medico-legale. Per ottenere l’idoneità il richiedente si potrà presentare alla visita medica con un’attestazione rilasciata dal proprio medico di base o dal centro diabetologico pubblico o privato che lo ha in cura. Tale attestazione conterrà notizie sullo stato di compenso metabolico, sulla terapia praticata e sulle eventuali complicanze d’organo presenti, nonché l’indicazione relativa al fatto che il paziente si sottoponga a regolari controlli medici.
Lo specialista suindicato, valutata l’idoneità del richiedente, indicherà l’eventuale scadenza entro la quale effettuare il successivo controllo medico per la conferma o la revisione della patente di guida. Se lo riterrà opportuno, inoltre, anche in considerazione di riscontro nel richiedente di complicanze del diabete, potrà decidere di inviare lo stesso in Commissione Medica Locale per la valutazione finale di idoneità alla guida.
Per il conseguimento, la revisione o la conferma delle patenti C, D, CE, DE e sottocategorie i richiedenti affetti da diabete anche in trattamento insulinico devono recarsi per la visita medica di idoneità alla guida presso la CML.
I richiedenti saranno sottoposti agli accertamenti sanitari relativi alla specifica patologia dai medici della CML di cui farà parte anche una specialista diabetologo.
I richiedenti in terapia insulinica dovranno sottoporsi a visite di controllo dell’idoneità alla guida presso la CML ogni anno, salvo singole disposizioni specifiche.
1.3 Malattie invalidanti
Le malattie e le affezioni riportate nell’Appendice II al Titolo IV del Codice della Strada, con le specificazioni per ognuna di esse indicate nell’appendice medesima, escludono la possibilità di rilascio del certificato di idoneità alla guida.
Si tratta di:
a. Affezioni cardiovascolari
La patente di guida non deve essere rilasciata né confermata ai candidati o conducenti colpiti da un’affezione cardiovascolare ritenuta incompatibile con la sicurezza della guida. Nei casi dubbi, o quando trattasi di affezioni cardiovascolari corrette da apposite protesi, il giudizio di idoneità verrà espresso dalla CML che può avvalersi della consulenza di uno specialista appartenente alle strutture pubbliche.
b. Diabete
Si veda quanto già precedentemente esposto.
c. Malattie endocrine
In caso di disturbi endocrini gravi, diversi dal diabete, in forme di entità tale da compromettere la sicurezza della guida, la patente di guida non potrà essere rilasciata o confermata, salvo diverse disposizioni della CML.
d. Malattie del SNC
La patente non deve essere rilasciata a soggetti affetti da:
• Encefalite, SM, Miastenia Gravis o malattie associate ad atrofia muscolare progressiva e/o disturbi miotonici;
• Malattie del SNP;
• Postumi invalidanti di traumatismi del SNC o SNP.
A giudizio della CML e con sua espressa certificazione, nei casi sopraccitati, a seguito dell’esito della visita specialistica presso strutture pubbliche, ove ritenuta necessaria, la patente può essere rilasciata o confermata a condizione che dette malattie non siano in stato avanzato e che la funzione degli arti sia buona, per cui non sia compromessa la sicurezza della guida. In tali casi gli interessati devono mostrare di essere capaci di usare i comandi del veicolo appartenente alla categoria per la quale si richiede il rilascio della patente.
Per quanto riguarda l’epilessia, la concessione della patente delle sole categorie A e B è consentita ai soggetti che non presentano crisi comiziali da almeno due anni, indipendentemente dall’assunzione di terapie di mantenimento e controllo. Tale condizione dovrà esser verificata dalla CML sulla base di certificazione, di data non anteriore a tenta giorni, redatta dal medico di fiducia o da uno specialista appartenete alle strutture pubbliche.
La patente di guida delle categorie C, D ed E non deve essere rilasciata né confermata ai candidati o conducenti in atto affetti o che abbiano sofferto in passato di epilessia.
e. Malattie psichiche
La patente di guida non deve essere rilasciata né confermata a candidati o conducenti che siano affetti da turbe o psichiche in atto o dovute a malattie, traumatismi, postumi di interventi chirurgici sul SNC o sul SNP o colpiti da ritardo mentale grave o che soffrono di psicosi o di turbe della personalità, quando tali condizioni pregiudichino la sicurezza della guida, salvo disposizioni della CML, che potrà valutare in modo diverso, avvalendosi eventualmente della consulenza specialistica presso le strutture pubbliche.
f. Sostanze psicoattive
La patente di guida no deve essere rilasciata o confermata ai candidati o conducenti che si trovino in stato di dipendenza attuale da alcool, stupefacenti o sostanze psicotrope, né a persone che consumino abitualmente sostanze capaci di compromettere la loro idoneità a guidare in sicurezza. Nel caso in cui tale dipendenza sia passata e non più attuale la CML, dopo aver valutato con estrema cautela il rischio di recidiva dl candidato o conducente, sulla base di idonei accertamenti clinici e di laboratorio, e dopo essersi eventualmente avvalsa della consulenza di uno specialista appartenente ad una struttura pubblica, può esprimere parere favorevole al rilascio o alla conferma.
g. Malattie del sangue
La patente di guida non deve essere rilasciata né confermata ai candidati o conducenti colpiti da gravi malattie del sangue, salvo il caso in cui la possibilità di rilascio o di conferma sia espressamente certificata dalla CML, la quale potrà avvalersi della consulenza di specialisti appartenenti a strutture pubbliche.
h. Malattie dell’apparato urogenitale
La patente di guida non deve essere rilasciata né confermata ai candidati o conducenti che soffrono di insufficienza renale grave.
Limitatamente alle categorie A e B, la patente può essere rilasciata o confermata quando la patologia risulta positivamente corretta dal trattamento dialitico o a seguito di trapianto. La certificazione deve essere rilasciata dalla CML.
Di seguito si riportano i dati, trasmessi al Ministero della Salute da 30 CML nel corso del 2001, relativi a: numero di visite effettuate con le relative percentuali di soggetti ritenuti idonei e non idonei (Tab. 1), cause di non idoneità (Tab. 2) e percentuali di soggetti idonei/non idonei in funzione del tipo di patologia esaminata (Tab. 3):
Tabella 1
TOTALE VISITE
IDONEI
NON IDONEI
95.231
91.999 (96.49%)
3.231 (3.51%)
Tabella 2
PATOLOGIE CAUSA DI INVIO ALLA CML
VISUS 20.461 22.20%
CARDIOVASCOLARI 16.789 18.20%
SOST. PSICOTROPE 12.670 13.77%
SNC 8.819 9.58%
DIABETE 6.758 7.34%
DEFICIT ARTI 6.500 7.06%
UDITO 4.595 4.99%
MAL. PSICHICHE 4.420 4.80%
MAL. APP. UROGENITALE 1.436 1.56%
MAL. SANGUE 1.177 1.27%
MAL. ENDOCRINE 760 0.82%
Tabella 3
% di idonei/non idonei per tipologia di patologia
Visus 97.20 2.80
Udito 99.43 0.57
Sost. psicotrope 92.49 7.51
Sangue 99.11 0.89
Mal. SNC 94.99 5.01
Mal. psichiche 92.46 7.54
Diabete 97.87 2.13
Deficit arti 99.17 0.83
App. urogenitale 99.07 0.93
App. endocrino 98.71 1.29
App. cardiovascolare 98.84 1.16
Idonei Non idonei
2. Ruolo del Medico di Medicina Generale nell’attuale normativa
Alla luce di quanto sopra riportato appare chiaro come, in base alla normativa vigente, spetti principalmente ad una delle figure elencate dal comma 2 dell’art.119 del C.d.S., e, solo in situazioni previste dal comma 4 del suddetto articolo, alle CML, l’attestazione delle condizioni di salute necessarie alla guida dei veicoli a motore. Al richiedente spetta il compito di autocertificare il proprio stato di salute di fronte al medico esaminatore. Non è più richiesto, quindi, fatte salve specifiche situazioni, il certificato anamnestico compilato dal medico curante e recante l’esclusione di infermità o malattie pregiudizievoli per l’idoneità alla guida, come accadeva negli anni passati.
I casi in cui, invece. un simile certificato risulta necessario sono costituiti da:
1. diabete;
2. epilessia.
L’intervento del medico di Medicina Generale viene richiesto nel primo caso, per attestare lo stato di compenso metabolico, il tipo di terapia praticata, l’eventuale presenza di complicanze d’organo e l’esistenza di un efficace follow-up del paziente diabetico, nel secondo caso, per attestare l’assenza di crisi comiziali nel paziente epilettico da un periodo di tempo pari ad almeno due anni consecutivi.
Ne deriva che, salvo questi casi, il ruolo del medico di famiglia nella procedura di valutazione dell’idoneità psico-fisica alla guida appare estremamente marginale e secondario.
La valutazione dell’idoneità viene affidata completamente a figure sanitarie specialistiche “esterne” e ciò garantisce sì un giudizio particolareggiato ed imparziale, ma, d’altro canto: chi se non il medico di famiglia sarebbe in grado di esprimere al meglio un giudizio sui requisiti psico-fisici del proprio paziente?
Sarebbe pertanto auspicabile se non ripristinare il già esistente certificato anamnestico, redatto dal curante, all’atto del rilascio o del rinnovo della patente di guida, quanto meno imporre la presentazione, da parte del soggetto della “scheda sanitaria individuale” redatta obbligatoriamente redatta ed aggiornata dal MMG (art. 31 del D.P.R. 28 luglio 2000, n. 270), tenendo inoltre conto che obbligo di quest’ultimo risulta sia “lo sviluppo e la diffusione della cultura sanitaria”, sia “l'osservazione di comportamenti e stili di vita positivi per la salute” (art. 31 del D.P.R. 28 luglio 2000, n. 270)
Emilia 2012: l'intervento e le attività della Protezione Civile durante la fase di emergenza sismica
No full textNel maggio 2012, una severa sequenza sismica ha colpito la parte centrale della Pianura Padana, con due scosse principali di magnitudo locale 5.9 (20 maggio) e 5.8 (29 maggio) e con un???intensità massima pari al VII-VIII grado della scala MCS. Le attività emergenziali, come di consueto, si sono svolte sotto il coordinamento del Dipartimento della Protezione Civile, nel quadro generale dato dalle componenti e dalle strutture operative del Servizio Nazionale della Protezione Civile. Numerose attività tecniche si sono affiancate al soccorso e all???assistenza alla popolazione, e hanno visto il diretto coinvolgimento del DPC. Tra queste si ricordano: l???acquisizione e la disseminazione dei dati della Rete Accelerometrica Nazionale e dell???Osservatorio Sismico delle Strutture del DPC; l???approccio di protezione civile ai fenomeni di liquefazione; l???analisi del danno e le verifiche di agibilità; la regolamentazione delle verifiche delle strutture industriali per il rapido ripristino delle attività produttive in condizioni di sicurezza; le azioni intraprese a seguito di valutazioni fornite dalla Commissione Grandi Rischi sulla possibile evoluzione della sequenza sismica
Metodologie di previsione della manovrabilit? delle navi. Parte I: Il meccanismo del moto piano.
No full textThe present paper is the first one od a series of articles devoted to the predicting methodologies of ship manoeuvrability. Particularly, in the next numbers it will be published further three papers concerning the following themes: - the manoeuvring simulators - the sea trials - the free running model tests In the present work the Planar Motion Mechanism (PMM) will be introduced: it allows, carrying out suitable tests in linear towing tank, the determination of the necessary hydrodynamic coefficients to effect prediction on the ship manoeuvrability. After a brief excursus on the PMM principle, the main captive model test will be introduced to the scope to predict the ship manoeuvrability. In the following, the main characteristics of the PMM recently installed at the INSEAN in Rome will be illustrated. Finally, the guidelines dictated by the "Manoeuvring Captive Model Test Procedure" introduced during the 23rd ITTC (International Towing Tank Conference) held in Venice will be discussed. Such a procedure foresees, in the preliminary test phase, the choice of a series of parameters, for the execution of the harmonic captive model tests, through the application of some empirical-theoretical formulas. The different achievable formulations will be critically introduced, keeping in mind the indications given by the different researchers devoted to the manoeuvrability and mathematical modelling studies.Il presente lavoro vuole costituire il primo di una serie di articoli dedicati alle metodologie di previsione dellamanovrabilit? delle navi. In particolare, nei prossimi numeri si cercher? di pubblicare ulteriori tre lavori riguardanti le seguenti tematiche: - i simulatori di manovra - le prove in mare - le prove con modello libero Nel presente lavoro viene presentato il meccanismo del moto piano PMM (Planar Motion Mechanism) che consente mediante lo svolgimento di adeguate prove in vasca navale rettilinea, la determinazione dei coefficienti idrodinamici necessari per effettuare previsioni sulla manovrabilit? di una nave. Dopo un breve excursus sul principio di funzionamento del PMM, verranno presentate le principali tecniche sperimentali realizzate con modello vincolato, finalizzate alla previsione delle capacit? di governo di una nave. Di seguito, sar? illustrato il PMM da poco installato prello l\u27INSEAN - IStituto Nazionale per Studi ed Esperienze di Architettura Navale di Roma. Infine verranno riportate le linee guida dettate dalla procedura per lo svolgimento delle prove di manovrabilit? con modello vincolato "Manoeuvring - Captive Model Tests Procedure", presentata durante la 23rd ITTC (International Towing Tank Conference) tenutasi a Venezia nel settembre 2002. Tale procedura prevede, nella fase preliminare delle prove, la scelta di una serie di grandezze pre l\u27effettuazione delle prove in vasca, da realizzarsi mediante l\u27applicazione di alcune formule teorico-empiriche. Le differenti formulazioni possibili saranno presentate e discusse in maniera critica, tenendo presente le indicazioni emerse dai diversi studiosi che si sono dedicati alle problematiche di manovrabilit? e modellazione matematica di fenomeni fisici
Trattamento con ormone della crescita in età pediatrica. Importanza dell’aderenza alla terapia nelle varie indicazioni, con particolare riferimento alla sindrome di Turner
No full textRiassunto
L’ormone della crescita ricombinante (recombinant human Growth Hormone - rhGH) viene utilizzato da 30 anni per il trattamento
di varie forme di bassa statura. Tuttavia, ancora oggi vi è un’ampia variabilità di risposta alla terapia con GH, tanto che un cospicuo
numero di pazienti mostra una insoddisfacente risposta alla terapia, non raggiungendo una statura adulta normale. Da qui
la necessità di un’ottimizzazione della terapia con GH e, soprattutto, di un’analisi dei vari fattori che intervengono nella risposta
alla terapia stessa. Uno di questi fattori può essere la scarsa aderenza al trattamento. È stata infatti dimostrata una correlazione
diretta tra il grado di aderenza e la velocità di crescita. Diversi studi hanno cercato di valutare la prevalenza della non-aderenza
alla terapia con GH in età pediatrica, che risulta essere molto variabile (dal 5 all’82%), a seconda dei metodi e delle definizioni
utilizzate. L’elevata frequenza, talvolta riscontrata, di scarsa aderenza alla terapia può essere dovuta al fatto che il trattamento con
GH è cronico e deve essere somministrato durante differenti stadi di sviluppo del bambino, fino all’adolescenza. Numerosi fattori
possono ostacolare l’aderenza alla terapia con GH nei pazienti pediatrici, come difficoltà legate al farmaco o problemi cognitivi/
emozionali. Da qui la necessità di ottimizzare la compliance, individuando degli interventi efficaci per migliorare l’aderenza alla
terapia. Discutendo dell’aderenza al trattamento con ormone della crescita, una menzione particolare deve essere fatta alla sindrome
di Turner, in cui la dimensione psico-sociale, considerata in tutta la sua complessità, ha un ruolo fondamentale e l’aspetto
della compliance deve essere particolarmente monitorato da parte del pediatra endocrinologo. Concludendo, affrontare il problema
della scarsa aderenza alla terapia con ormone della crescita in età pediatrica è fondamentale al fine di migliorare il risultato
del trattamento. La valutazione dell’aderenza dovrebbe essere effettuata impiegando misure oggettive e dovrebbero essere individuati
interventi efficaci per migliorare i risultati in termini di efficacia e contenimento dei costi
Mauro Tesi. Progetto di prospettiva per il cortile di Palazzo Banzi a Bologna
No full textLa scheda presenta un progetto di Mauro Tesi, già in collezione Franceschi, per il fondale dipinto nel cortile di palazzo Banzi a Bologna, ancora oggi visibile. Il disegno si colloca in un periodo in cui la grande tradizione scenografica bolognese fingeva in pittura imponenti fondali di cortili, creando inaspettati spazi illusori. Tesi, in particolare, imposta una grandiosa prospettiva inquadrata da un arco a tre fornici ancora di gusto classicista
Applicazione della genomica funzionale allo studio di specie di interesse in acquacoltura
No full textIn the last 10-15 years, the production of farmed marine fish species has increased rapidly, mainly as a consequence of improved breeding and husbandry methods and technologies. However, severe production bottlenecks, such as high larval mortality, skeletal malformations, susceptibility to stress and disease, remain to be solved. The application of genomic technologies offers much promise to rapidly increase our knowledge on molecular mechanisms underlying key productive traits in farmed species.
In the present study, many efforts were invested in order to provide genomic tools for the study of two fish species of great importance for the European aquaculture; the gilthead seabream (Sparus aurata) and the European sea bass (Dicentrarchus labrax¬). To this end, we report here on the development of two oligo DNA microarray for both S. aurata and D. labrax.
All the available ESTs from the gilthead sea bream were used to design two longer (60mer) probes for each transcript using Agilent SurePrintTM technology. This microarray platform was then validated to assess its reproducibility and accuracy on two early stages of gilthead sea bream development, respectively one-day and four days old larvae. Correlation between technical replicates was always > 0.99, with strong positive correlation between paired probes. Cross-validation of microarray data was then carried out using quantitative (q)RT-PCR; a statistically significant positive correlation was obtained comparing expression levels for each target gene across all biological replicates.
For the European sea bass, probe design was positively completed for 19,035 target transcripts; high levels of reliability, and reproducibility of the microarray platform were confirmed by qPCR validation and biological replicates analysis. The oligo microarray was then applied to profile gene expression in mandibles and whole-heads of fish affected by prognathism, a skeletal malformation that strongly affect sea bass production. Statistical analysis identified 242 transcripts that are significantly down-regulated in deformed individuals compared to normal fish. Functional annotation of significant genes gives new insights on putative mechanisms involved on mandibular prognathism development.
In this study we describe also the identification and characterisation of a NITR gene complex D. labrax, encoded in a single genomic region spanning 270 kilo bases (kb). In total, 27 NITR genes and 3 pseudogenes, organized in a tandemly arrayed cluster, were identified. Comparison of the predicted peptide structure across D. labrax NITRs shows considerable variations; these genes maintain the three major genomic organizations that appear to be essentially conserved among fish species along with new features presumably involving processes of intron loss, exon deletion, and acquisition on new exons. Comparative analyses of all published NITR genes suggest that these receptors follow birth-and-death model of gene evolution in which duplication events together with lineage-specific gain and loss of individual members contributed to the rapid diversification of individual gene familiesNegli ultimi 10-15 anni, la produzione di specie marine in acquacoltura è cresciuta molto rapidamente; diverse limitazioni, tuttavia, non sono ancora state superate (per es. elevata mortalità larvale, suscettibilità a stress e patologie, sviluppo di malformazioni scheletriche). La genomica funzionale può fornire gli strumenti per una migliore conoscenza dei meccanismi molecolari responsabili di tratti produttivi di forte interesse economico nelle specie allevate.
Nel presente studio, numerosi sforzi sono stati investiti allo scopo di sviluppare e sfruttare strumenti di genomica funzionale per lo studio di due specie di primaria importanza per l’acquacoltura europea, l'orata (Sparus aurata) e il branzino (Dicentrarchus labrax¬); di seguito viene riportato lo sviluppo di due piattaforme microarray a oligonucleotidi per entrambe le specie.
Tutti i trascritti disponibili di orata sono stati utilizzati per la sintesi di due sonde a oligonucleotidi (60meri) per ciascun trascritto utilizzando la tecnologia Agilent SurePrintTM. La riproducibilità e l’accuratezza della piattaforma microarray sono state quindi testate in due stadi precoci di sviluppo di orata: due e quattro giorni dalla schiusa. La correlazione tra le repliche tecniche si è sempre rivelata elevata (r >0,99) e forte correlazione è stata osservata anche tra le coppie di sonde per ciascun trascritto. La Real-time RT-PCR è stata quindi utilizzata per cross-validare i dati di espressione del microarray; anche in questo caso è stata ottenuta una correlazione statisticamente significativa per ciascun gene target in tutte le repliche biologiche.
Per il branzino, il disegno delle sonde è stato effettuato per 19.035 trascritti target; l’elevata affidabilità e riproducibilità della piattaforma è stata confermata tramite Real-time RT-PCR e analisi delle repliche biologiche. Il microarray è stato quindi impiegato per analizzare i profili di espressione genica in mandibole e teste di esemplari di branzino affetti da prognatismo, una malformazione scheletrica che ne compromette pesantemente la produzione e la commerciabilità. Analisi statistiche hanno permesso di identificare 242 trascritti sottoespressi negli esemplari prognati rispetto ai controlli; una annotazione funzionale di questi fornisce nuove informazioni sui potenziali meccanismi coinvolti nello sviluppo di questa malformazione.
Nel presente studio viene anche descritta l’identificazione e la caratterizzazione, in branzino, dei recettori Novel Immune-type Receptor (NITR). In totale sono stati identificati 27 geni e 3 pseudogeni, organizzati in cluster in una regione genomica di circa 270 kb. I membri di questo cluster sono caratterizzati da una elevata variabilità; i NITR, infatti, mantengono tre organizzazioni genomiche principali, che appaiono conservate in diverse specie di teleostei, oltre a forme nuove che coinvolgono processi di perdita di introni, delezioni di esoni o loro nuova acquisizione. Analisi comparative tra tutti i geni NITR finora noti sembrano suggerire che questi seguano il modello evolutivo noto col nome di “birth-and-death”, nel quale eventi di duplicazione, assieme alle perdite/acquisizioni di singoli membri, contribuiscono alla rapida evoluzione di diverse famiglie geniche
Enzimi farmaco-metabolizzanti epatici in specie di interesse veterinario
No full textIn veterinary medicine, the characterisation of the P450 isoenzymes is still incomplete and moreover, the substrates used were selected on the basis of the available knowledge from experiments in human or laboratory species without any kinetic or inhibition study (Fink-Gremmels, 2008). Defining the contribution of a P450 isoform in the metabolism of a specific drug is of great interest not only for veterinary pharmacology and toxicology but also for human health, for the potential presence of toxic residues in food animal products.
During the PhD course, projects dealing with the evaluation of cytochrome P450 activities in veterinary species have been developed. The aim was to increase knowledge about drug metabolizing enzymes in veterinary species and about the modulation of their activity. The modulation may be due to factors as breed but also exposure to environmental contaminants or somministration of illicit drugs used to enhance growth and consequently increase profit (Johnson, 2007). Data collected from these in vitro studies can be actually used to evaluate the effects of drug-drug interactions and for the plan of experimental projects aiming to identify in vivo markers of exposure or treatment.
I) Determination of CYP1A and CYP2C activities in bovine liver. In this study, accuracy, precision, LOD and LOQ of High Performance Liquid Chromatography (HPLC) methods previously developed in the lab for the evaluation of ethoxyresorufin-O-deethylase (EROD) e tolbutamide methyl-hydroxylase (TMOH) activities, have been determined. The aim was to calculate the enzyme kinetic parameters: respectively 0.23 ± 0.051 and 1010 ± 155.7 μM for Km and 0.488 ± 0.035 and 0.089 ± 0.006 nmol/min/mg protein for Vmax. The methods were proved to be so sensitive to determine also very low levels of enzyme activity as those of veal calves fed with milk replacers and low iron content diet. Finally, to verify the presence of intra-specific differences in enzyme activity, EROD and TMOH were determined with liver microsomes from Charolais (CH), Blonde D’Aquitaine (BD) and Piedmontese (PM). The results of EROD evidenced higher activity in CH vs PM (p<0.05). So, for the first time, the presence of breed differences in this enzyme activity was established, confirming also what reported by other authors for CYP3A-dependent activities (Dacasto et al., 2005). These differences may influence bioavailability and clinical efficacy of xenobiotics (Sallovitz et al., 2002) and may be of particular interest in veterinary species for the potential presence of toxic residues in food animal products.
II) Testosterone hydroxylation in bovine liver: enzyme kinetic and inhibition study. This study evaluated, by HPLC analysis, the kinetic of testosterone (TST) hydroxylase activities in vitro, with liver microsomes from cattle. Kinetic parameters for 6b–, 16b– and 2b –TST hydroxylase activities (OHT) were 93.4±13.8, 36.4±6.1 and 110.8±15.2 ±M respectively for Km and 0.558±0.03, 0.280±0.013 and 0.338±0.017 nmol/min/mg protein for Vmax.. Moreover, chemical inhibition studies with a CYP3A inhibitor (ketoconazole) and CYP2B inhibitors (orphenadrine and 9-ethynylphenanthrene) were performed to establish the involvement of CYP3A and potentially of CYP2B in these enzyme reactions. To further confirm the results obtained, an anti-peptide antibody against bovine CYP3A4 was also used. The antibody specificity with bovine liver microsomes was evaluated and then immunoinhibition studies were conducted, evidencing > 90% inhibition for 16b– and 2b –OHT activities and > 80% for 6b–OHT. These results seemed to suggest the predominant involvement of CYP3A in the production of the three main TST-hydroxylated metabolites in bovine liver while CYP2B seemed to be not involved.
III) Effects of illicit treatments on CYP3A in bovine liver and in primary cultures of bovine hepatocytes. These experiments intended to prove the applicability of the HPLC method and TST substrate for evaluating CYP3A activity, aiming to actually verify illicit treatments effect and collect more data respect to previous studies in veal calf and beef cattle.
In the first experiment, 6b-, 16b- and 2b-OHT were determined in bovine treated with dexamethasone (D) and dexamethasone+estradiol (DE). The results obtained evidenced a significant induction for 6b- and 16b-OHT in D and DE vs control (K, p<0.05) and for 2b–OHT in D and DE vs K (p<0.05 and p<0.01, respectively), confirming what reported for human (McCune et al., 2000). These results were confirmed by Immunoblotting which evidenced increasing in CYP3A protein expression in D and D+E vs K (p<0.01 and p<0.05, respectively).
In the second experiment, 6b-, 16b- and 2b-OHT were determined in bovine hepatocytes after 24 h incubation with boldenone (B), androsta-1,4-diene-3,17-dione (A) and B + A. The results showed an inhibitory trend in hepatocytes incubated with growth promoters vs controls (K). In particular, 6b and 16b OHT were inhibited in A and B vs K while 2b-OHT in A vs K (p<0.05). At the protein level instead, no significant difference was found in CYP3A expression (Immunoblotting). The inhibitory effect observed may be due to the high doses used; inhibitory/toxic effects of high doses of inducing agents were evidenced for instance by Kostrubsky et al. (1999) who used human hepatocytes to study induction of cytochrome P450, stressing the importance of large dose-response studies as well as the need to assess toxicity in these investigations.
The results obtained in these experiments confirmed the modulation of expression and regulation of cytochrome P450 enzymes by estrogens, corticosteroids and anabolic steroids. There is the need however, to explain deeply for bovine the mechanism through that these compounds act at pre- and post-transcriptional level.
IV) Determination of CYP1A activity in the liver of Zosterisessor ophiocephalus as biomarker of pollution in the Venice Lagoon. Recently, it was proved that biomarkers (BM) are very useful to evidence early biological changes in environmental pollution. One of the most common BM used in fishes is the induction of the P450 system and in particolar ethoxyresorufin O-deethylase activity (EROD) is a marker of fish exposure to potentially toxic compounds, i.e. poli-chlorinated biphenils and polycyclic aromatic hydrocarbons (Burgeot et al., 1994). The aim of this study was to evaluate by HPLC EROD activity in Zosterisessor ophiocephalus, a benthic fish that may represent an useful bioindicator of environmental stress in the Venice Lagoon. Fishes were collected in spring and autumn in three different areas of the Venice Lagoon: Porto Marghera (PM), Valle di Brenta (VB) and Porto Canale (PC); the samples were then classified in females, males and sneakers (small males, < 1 years-old).
Factorial analysis of EROD activity results evidenced that site, fish category and season were significant (p12), intermediate in the area of Valle di Brenta (EF=5-12) and low around Porto Canale (EF=1-5; Guerzoni et al., 2004). However, site effect depended on the fish category and in particular differences were found between males and females, due more probably to the analyzed samples than to real differences in induction. From these results, EROD activity may be considered an useful biomarker even if, considering the multifactorial response of individuals, it is important to use several significant biomarkers to accurately evaluate the effects of environmental pollution in the aquatic ecosystem.
V) Luminescence high-throughput methods for determining CYP3A and CYP2C activities in horse liver. In the last part of the thesis, results of kinetic and inhibition studies to evaluate CYP2C and CYP3A activities in horse liver through Glo assays were reported. The aim was to evaluate the performances of this technique for drug metabolism or drug-drug interaction studies. Enzyme kinetic parameters for CYP3A and CYP2C activities were respectively 14.5 ± 7.3 and 175.9 ± 16.2 μM for Km and 0.022 ± 0.0004 and 0.025 ± 0.0009 nmol/min/mg protein for Vmax. Ketoconazole (CYP3A inhibitor) evidenced IC50 values of 0.035 μM, confirming good specificity of the luciferin (L)-derivative substrate used for CYP3A (L-IPA). Sulfaphenazole (CYP2C inhibitor) evidenced IC50 values of 47.2 μM, suggesting the need to conduct further studies to verify substrate specificity (L-H), for instance using other selective inhibitors for the CYP2C subfamily as ibuprofen or diclofenac. Luminescence methods allowed to analyse many samples in short time, to monitor more than one isoform simultaneously in the same plate and showed good sensitivity confirmed by LOD values: 0.2 and 0.11 nM for L-H and L-IPA, respectively. So, these results may represent a good starting point to apply this technique in drug metabolism and drug-drug interaction studies in veterinary speciesNel corso dei tre anni di dottorato sono stati sviluppati progetti relativi alla valutazione dell’attività epatica di isoforme di citocromo P450 in specie di interesse veterinario. In medicina veterinaria, la caratterizzazione del sistema P450 è ancora incompleta; inoltre, i substrati utilizzati sono stati selezionati sulla base delle conoscenze disponibili a partire da esperimenti condotti nell’uomo o nelle specie di laboratorio senza studi di cinetica enzimatica o di inibizione (Fink-Gremmels, 2008). Definire il contributo di un’isoforma di citocromo P450 nel metabolismo di un farmaco specifico è importante non solo per la farmacologia e la tossicologia veterinarie ma anche per la salute dell’uomo, per la possibile presenza di residui nei prodotti di origine animale.
L’obiettivo della presente tesi di dottorato è stato dunque quello di aumentare le conoscenze sugli enzimi che metabolizzano i farmaci in specie di interesse veterinario e sulla modulazione della loro attività. Tale modulazione può essere dovuta a fattori come la razza ma anche all’esposizione ad inquinanti ambientali oppure alla somministrazione di sostanze illecite utilizzate allo scopo di determinare incremento ponderale, riduzione degli indici di conversione alimentare e quindi aumento complessivo del reddito (Johnson, 2007). Le informazioni ottenute con tali studi in vitro dunque possono essere utili per valutare l’effetto di interazioni tra farmaci e per il disegno sperimentale di progetti volti all’identificazione di marker in vivo di esposizione o trattamento.
I) Valutazione dell’attività di CYP1A e CYP2C nel fegato di bovino. Nel presente lavoro, sono stati verificati accuratezza, precisione, LOD e LOQ di metodi in High Performance Liquid Chromatography (HPLC) precedentemente messi a punto nel laboratorio per la valutazione dell’attività di etossiresorufina-O-deetilasi (EROD) e tolbutamide metil-idrossilasi (TMOH) in microsomi epatici di bovino allo scopo di determinare i parametri di cinetica enzimatica: rispettivamente 0,23 ± 0,051 e 1010 ± 155,7 μM per la Km e 0,488 ± 0,035 e 0,089 ± 0,006 nmol/min/mg proteina per laVmax. La sensibilità dei metodi messi a punto ha permesso di valutare anche livelli di attività enzimatica molto bassi come quelli dei vitelli a carne bianca che vengono alimentati con una dieta a base di sostitutivi del latte e basso contenuto di ferro. Infine, per verificare l’esistenza di differenze intra-specifiche nell’attività enzimatica, le attività di EROD e TMOH sono state determinate utilizzando microsomi epatici di bovini di razza Charolais (CH), Blonde D’Aquitaine (BD) e Piemontese (PM). I risultati ottenuti per l’attività di EROD hanno evidenziato una maggiore attività nei bovini di razza CH vs PM (p<0,05). E’ stata dunque dimostrata, per la prima volta, l’esistenza di differenze intra-specifiche dovute alla razza relative a questa attività enzimatica, confermando quanto evidenziato da altri autori in relazione ad attività CYP3A-dipendenti (Dacasto et al., 2003). Tali differenze potrebbero influenzare la biodisponibilità e l’efficacia clinica di xenobiotici (Sallovitz et al., 2002) e potrebbero essere di particolare interesse nelle specie di interesse veterinario per l’ipotetica presenza di residui potenzialmente tossici negli alimenti di origine animale. Per quanto riguarda invece l’attività di TMOH non sono state evidenziate differenze statisticamente significative.
II) Valutazione dell’attività di idrossilazione del testosterone nel fegato di bovino: studio di cinetica enzimatica e di inibizione. In questo studio è stata valutata, tramite analisi in HPLC, la cinetica delle reazioni di idrossilazione del testosterone (TST) in vitro, con microsomi epatici di bovino. I parametri di cinetica enzimatica per le attività di 6b–, 16b– e 2b –TST idrossilasi (OHT) sono risultati 93,4±13,8, 36,4±6,1 e 110,8±15,2 ±M rispettivamente, per la Km e 0,558±0,03, 0,280±0,013 e 0,338±0,017 nmol/min/mg proteina per la Vmax.. Inoltre sono stati effettuati degli studi di inibizione chimica con inibitori di CYP3A (chetoconazolo) e di CYP2B (orfenadrina e 9-etinilfenantrene) per definire il coinvolgimento di CYP3A e potenzialmente di CYP2B in queste reazioni enzimatiche. I risultati ottenuti sono stati ulteriormente confermati con l’impiego di un anticorpo anti-peptide contro CYP3A4 di bovino. Dopo aver valutato la sua specificità con microsomi epatici di bovino, sono stati effettuati degli studi di immunoinibizione, che hanno evidenziato un’inibizione > 90% per le attività di 16b– e 2b –OHT e > 80% per 6b–OHT. Nel complesso, questi risultati sembrerebbero suggerire il coinvolgimento predominante di CYP3A nella produzione dei tre principali metaboliti del TST nel fegato di bovino mentre CYP2B non sembrerebbe essere coinvolto.
III) Effetti di trattamenti illeciti su CYP3A nel fegato del bovino da carne e in colture primarie di epatociti di bovino. L’obiettivo principale di entrambe le prove sperimentali descritte è stato quello di dimostrare l’applicabilità del metodo HPLC e del substrato TST per la valutazione dell’attività enzimatica CYP3A-dipendente, allo scopo di verificare l’effetto del trattamento e di acquisire ulteriori evidenze sperimentali rispetto ai risultati di studi precedentemente coinvolti dal nostro gruppo di ricerca sul vitello a carne bianca e sul vitellone.
In un primo esperimento, sono state determinate le attività di 6b-, 16b- e 2b-OHT in microsomi epatici di bovini trattati con desametazone (D) e desametazone + estradiolo (DE). I risultati ottenuti hanno evidenziato un’induzione statisticamente significativa nelle attività di 6b- e 16b-OHT in D e DE vs controlli (K, p<0,05) e nell’attività di 2b–OHT in D e DE vs K (p<0,05 e p<0,01, rispettivamente), confermando quanto riportato in letteratura per l’uomo (McCune et al., 2000). Tali risultati sono stati convalidati ulteriormente dall’analisi in Immunoblotting che ha evidenziato un aumento dell’espressione di CYP3A in D e D+E vs K (p<0,01 e p<0,05, rispettivamente).
In un secondo esperimento, sono state determinate le attività di 6b-, 16b- e 2b-OHT in epatociti di bovino dopo 24 h di incubazione con boldenone (B), androsta-1,4-diene-3,17-dione (A) e B + A. I risultati ottenuti hanno evidenziato un trend inibitorio negli epatociti incubati con promotori di crescita rispetto a K. In particolare, le attività di 6b e 16b OHT sono state inibite in A e B vs K mentre l’attività di 2b-OHT in A vs K (p<0,05). A livello di proteina invece, non è stata riscontrata alcuna differenza statisticamente significativa nell’espressione di CYP3A (Immunoblotting). L’effetto inibitorio osservato potrebbe essere dovuto alle dosi utilizzate; un caso di effetto inibitorio/tossico di alte dosi di sostanze inducenti è riportato da Kostrubsky et al. (1999) che hanno utilizzato epatociti di uomo per studiare l’induzione del sistema citocromo P450 evidenziando la necessità di effettuare degli studi dose-risposta in un ampio range di concentrazioni delle sostanze utilizzate e di valutarne la tossicità.
Nel complesso, i risultati ottenuti in questi due esperimenti hanno confermato la modulazione da parte di estrogeni, corticosteroidi ed anabolizzanti dell’espressione e la regolazione degli enzimi citocromo P450-dipendenti. Chiaramente, rimane comunque la necessità di spiegare più approfonditamente per quanto riguarda il bovino i meccanismi tramite i quali queste sostanze agiscono sia a livello pre-trascrizionale che post-trascrizionale.
IV) Valutazione dell’attività di CYP1A nel fegato di Zosterisessor ophiocephalus come biomarcatore di inquinamento nella laguna di Venezia. Recentemente, è stato dimostrato che i biomarcatori (BM) sono molto utili per rilevare dei cambiamenti biologici precoci nell’inquinamento ambientale. Uno dei BM più comunemente usati nei pesci è l’induzione dell’attività di etossiresorufina-O-deetilasi (EROD) che è un indicatore dell’esposizione dell’organismo a composti potenzialmente tossici, come ad esempio i policloro-bifenili e gli idrocarburi aromatici policiclici (Burgeot et al., 1994). Di conseguenza, lo scopo del presente lavoro è stato quello di valutare l’attività di EROD tramite HPLC in Zosterisessor ophiocephalus, una specie bentonica che date le sue caratteristiche, può rappresentare un utile indicatore biologico dei livelli di stress ambientale presente nella Laguna di Venezia. I pesci sono stati raccolti in primavera ed in autunno in tre aree della Laguna di Venezia: Porto Marghera (PM), Valle di Brenta (VB) e Porto Canale (PC); i campioni sono stati poi suddivisi in femmine, maschi e sneakers (maschi giovani). L’analisi fattoriale ha evidenziato la significatività dei fattori sito, categoria e stagione (p12), intermedia nei pressi di Valle di Brenta (EF=5-12) e ridotta nel territorio contiguo al sito di Porto Canale (EF=1-5; Guerzoni et al., 2004). L’effetto del sito dipendeva comunque dalla categoria di animali considerata ed in particolare sono state evidenziate delle differenze tra maschi e femmine, dovute probabilmente comunque al campione analizzato più che a differenze reali in termini di induzione. Dai risultati ottenuti, l’attività di EROD è da considerarsi un buon biomarcatore anche se, considerando la natura multifattoriale della risposta dell’individuo, è necessario l’utilizzo congiunto di più biomarcatori significativi per effettuare una valutazione accurata degli effetti dell’inquinamento nell’ecosistema acquatico.
V) Messa a punto di metodi high-throughput in luminescenza per la valutazione dell’attività di CYP3A e di CYP2C nel fegato di cavallo. Nell’ultimo capitolo della tesi, sono riportati i risultati relativi agli studi di cinetica enzimatica e di inibizione chimica volti alla valutazione delle attività di CYP2C e CYP3A nel fegato di cavallo mediante l’utilizzo di saggi Glo. Lo scopo è stato quello di valutare le performance di questa tecnologia allo scopo di applicarla in studi di metabolismo e di interazioni tra farmaci. I parametri di cinetica enzimatica per le attività di CYP3A e di CYP2C sono risultati rispettivamente 14,5 ± 7,3 e 175,9 ± 16,24 μM per la Km e 0,022 ± 0,004 e 0,025 ± 0,0009 nmol/min/mg proteina per la Vmax. Chetoconazolo (inibitore di CYP3A) ha evidenziato un valore di IC50 pari a 0,035 μM, confermando quindi una buona specificità del substrato luciferina (L)-derivato utilizzato per CYP3A (L-IPA). Sulfafenazolo (inibitore di CYP2C) ha evidenziato un valore di IC50 pari a 47,2 μM, suggerendo dunque la necessità di effettuare ulteriori studi volti a verificare la specificità di substrato (L-H), ad esempio utilizzando altri inibitori selettivi per tale sottofamiglia come l’ibuprofene o il diclofenac. I metodi in luminescenza messi a punto permettono di analizzare un numero elevato di campioni in tempi brevi, di monitorare più di un’isoforma contemporaneamente nella stessa piastra e sono caratterizzati da una buona sensibilità, confermata dai valori di LOD ottenuti: 0,2 e 0,11 nM per L-H e L-IPA, rispettivamente. I risultati ottenuti dunque possono costituire un ottimo punto di partenza per poter applicare la tecnologia di tali saggi in studi relativi alle specie di interesse veterinario con vantaggi di costi e tempi di realizzazione delle analis
Terapia con ormone della crescita in età pediatrica. Importanza delle dosi nelle varie indicazioni
No full textIn Europa le indicazioni per la somministrazione
dell’ormone della crescita in età pediatrica approvate
dall’European Medicines Agency (EMA) sono: il
deficit di GH (Growth Hormone Deficiency - GHD), la
sindrome di Turner, la sindrome di Prader-Willi, l’insufficienza
renale cronica, i bambini nati piccoli per
l’età gestazionale (Small for Gestational Age - SGA) e
l’aploinsufficienza del gene SHOX, ciascuna con specifica
posologia. Tali condizioni presentano infatti
una differente risposta alla terapia, espressione di
una diversa sensibilità al GH. Sicuramente in un’ottica
di ottimizzazione della terapia, il ruolo della dose
di GH e della sua modificazione nelle varie fasi di
crescita è fondamentale. Recenti studi di farmacogenomica
hanno inoltre dimostrato che il background
genetico può contribuire alla variabilità individuale
nella risposta al trattamento con GH, prospettando la
possibilità di un’individualizzazione delle dosi
- …
