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Oxygenase Activities for the Biosynthesis of Aromatic Antioxidants
No full textReactions in which organic compounds are oxygenated or hydroxylated are of great value for organic synthesis. The “oxyfunctionalization” of aromatic compounds is a modification of primary interest for the pharmaceutical and food industries allowing to obtain high-value-added compounds, characterized by a wide array of biological activities, starting from cheap and commercially available molecules. Selective oxyfunctionalization of organic substrates, however, can be a significant problem in organic synthesis, as these reactions are often carried out with strong oxidizing agents and occur with little chemo-, regio-, and enantio- selectivity. Thus, growing attention has been dedicated in the last years to the development of biotransformations, also known as bioconversions, which make use of the metabolic versatility of either purified enzymes or whole microorganisms to perform oxyfunctionalization of organic substrates of industrial interest. These methodologies, compared with already established chemical processes, are appealing alternatives for obtaining active aromatic compounds under mild experimental conditions and without employing toxic reagents. In this thesis project several aspects of this kind of biotransformation were analyzed; more in detail the attention was focused on:
- The use of the bacterial multicomponent monooxygenase ToMO from Pseudomonas sp. OX1 for the production of novel hydroxylated antioxidants starting from commercially available aromatic precursors such as 2-phenoxyethanol, 2,3-dihydrobenzofuran, 2-indanol and phtalan. The antioxidant potential of the hydroxylated compounds obtained in ToMO-catalyzed bioconversion was assessed both in vitro, by using the DPPH assay, and ex vivo on the embryionic rat cardiomyoblast cell line H9C2 subjected to oxidative stress induced by sodium arsenite. Not all compounds showed antioxidant potential in the DPPH assay; however, when cells where incubated with each of them, a differential protective effect towards the oxidative stress induced by sodium arsenite was observed.
- The recombinant expression of ToMO in the GRAS host microorganism Bacillus subtilis to analyze the potential use of this bacterium for the industrial scale-up of ToMO-catalyzed hydroxylation of aromatic substrates of interest. To this purpose, ToMO gene cluster was cloned in two different shuttle vectors, a non- integrative plasmid indicated as pHT01, and Pr19, a vector that allows instead the direct integration of the recombinant gene in B.subtilis chromosomal DNA through single crossing-over. In this latter case, no integration was observed. When using a non-integrative shuttle vector, the ToMO system was efficiently expressed in E.coli, but RT-PCR experiments showed that almost no mRNA corresponding to the tou gene cluster appeared to be transcribed when the plasmid was inserted in B.subtilis.
- The expression and purification of the Baeyer Villiger 3,6-diketocamphane 1,6 monooxygenase (3,6 DKCMO) and its flavin reductase component from Pseudomonas putida NCIMB 10007. The optimization of the expression and the purification of these proteins will pave the way to the future biochemical characterization of this flavoenzyme and to its biotechnological use for the oxyfunctionalization of aromatic compounds of industrial interest
The Binding of Ligands to Proteins: Methodological Approaches.
No full textA brief survey of the techniques available for measuring the binding of small molecules to proteins is presente
Sviluppo di un sistema cellulare microbico per la decontaminazione di siti inquinati da composti organici recalcitranti
No full textRibonucleasi citotossiche: uno studio dei determinanti strutturali mediante ingegneria proteica
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Basi molecolari delle capacità degradative di composti aromatici in Pseudomonas stutzeri OX1 e in Sulfolobus solfataricus P2.
No full textL'inquinamento ambientale è oggi una delle emergenze maggiormente sentite dalla società a causa dei suoi disastrosi effetti sui delicati equilibri degli ecosistemi mondiali e sulla salute umana. Le tecnologie di risanamento ambientale che sfruttano le bioconversioni microbiche degli agenti inquinanti rappresentano una prospettiva scientifica particolarmente interessante, ma lo sviluppo di queste metodiche si basa necessariamente sulla conoscenza delle basi biochimiche, genetiche e molecolari delle vie metaboliche evolute da tali microrganismi. Vari ceppi di Pseudomonas hanno la capacità peculiare di crescere su sostanze aromatiche e/o alogenate utilizzate come unica fonte di carbonio utilizzando vie cataboliche che generalmente sono organizzate in un “upper" e in un "lower" pathway che portano alla formazione di molecole capaci di entrare nel ciclo degli acidi tricarbossilici. Le ossigenasi rappresentano enzimi chiave degli upper pathway poichè attivano la stabile struttura degli anelli aromatici grazie all'aggiunta di gruppi ossidrilici. Nell'ambito di tali studi il batterio Pseudomonas stutzeri OX1 riveste una particolare importanza poiché mostra una attività ossigenasica di ampio spettro. Nel batterio sono stati individuati i locus genici che codificano per due complessi monoossigenasici: ToMO (toluene/ o-xylene monooxygenase) e PH (phenol hydroxylase). E' stato dimostrato che entrambi i complessi agiscono attraverso una catena di trasporto elettronico che trasferisce gli elettroni dal NAD(P)H al sito attivo del complesso responsabile dell'ossidrilazione delle molecole aromatiche. Per spiegare la co-presenza dei due complessi, sono state espresse e purificate le proteine appartenenti al complesso PH e ne è stata fatta una preliminare caratterizzazione cinetica. Per confrontare le diverse specificità di substrato sono stati effettuati saggi su cellule di E.coli esprimenti i due complessi utilizzando benzene e fenolo quali substrati modello. I dati contenuti nel presente lavoro di tesi hanno consentito di avanzare l'ipotesi che la copresenza dei due complessi non sia ridondante ma aumenti l'efficienza d'utilizzo dei substrati non ossidrilati . Un futuro impiego biotecnologico di Pseudomonas stutzeri OX1 comporta inoltre lo studio delle componenti strutturali e dei meccanismi d'azione mediante i quali tale batterio interagisce con l'ambiente circostante. Sono state conseguentemente effettuate delle analisi strutturali sui lipopolisaccaridi e sui lipooligosaccaridi della membrana di P.stutzeri OXI che evidenziano modificazioni peculiari degli LPS di membrana che farebbero parte di un complesso meccanismo di difesa contro l'eccessiva entrata di composti aromatici nell'ambiente citoplasmatico. Nell'ambito di questa tesi sono state inoltre effettuate delle analisi volte ad analizzare la presenza di una nuova monoossigenasi nel batterio ipertermofilo Sulfolobus solfataricus P2. Analisi di omologia sul genoma di tale batterio, hanno permesso di individuare la presenza di un cluster genico costituito da ORFs che mostrano interessanti omologie con le subunità di altre monoossigenasi batteriche.Sono state perciò effettuate delle prove di crescita in terreno minimo, che hanno consentito di dimostrare che Sulfolobus solfataricus P2 è in grado di usare il fenolo come unica fonte di carbonio e di energia a 80°C. Si è in seguito proceduto al clonaggio, all'espressione e alla caratterizzazione della proteina codificata da una delle ORFs del cluster. I dati riportati dimostrano che si tratta di una ferredossina Rieske-type che, nella catena di trasporto elettronico mediante il quale dovrebbe agire anche questo nuovo complesso, è responsabile del passaggio degli elettroni dalla NADH-ossidoreduttasi al subcomplesso ossidrilasico. Questi dati, oltre ad esperimenti di RT-PCR effettuati su cellule cresciute in presenza di fenolo, consentono di avanzare l'ipotesi che la monossigenasi individuata sia probabilmente attiva anche in vivo
Toluene o-xilene monoossigenasi e fenolo ossidrilasi da Pseudomonas stutzeri OX1: dai geni alle proteine
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