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Sviluppo e caratterizzazione di marcatori e strumenti molecolari per il monitoraggio di esocitosi ed endocitosi nel rimodellamento dell'apoplasto durante la crescita e i meccanismi di difesa
No full textLa notevole dinamicità dell’apoplasto dipende dalla funzionalità del sistema di endomembrane. Polisaccaridi di matrice (pectine ed emicellulose) e proteine di parete vengono sintetizzati rispettivamente nei dittiosomi e nel reticolo endoplasmico e raggiungono via vescicole il plasmalemma per essere incorporati nell’apoplasto. Via vescicole arriva al plasmalemma, e qui viene inserito, il complesso cellulosa sintasi. Nonostante l’intenso traffico vescicolare verso l’apoplasto, molto poco si conosce sui meccanismi molecolari alla base di questi eventi. Sembra, comunque accertato il coinvolgimento delle proteine SNARE e di RabGTPasi nel trasporto TGN-membrana plasmatica. Poichè non si conoscono segnali specifici che mediano il trasporto alla membrana plasmatica ed in parete, si pensa che il traffico vescicolare verso lo spazio apoplastico sia un processo di “Bulk flow”. Ciò implica che la membrana plasmatica sia la destinazione di default di materiale polimerico di parete (proteine e polisaccaridi) e di proteine generiche di secrezione. Questo concetto implica che le vescicole non siano selettive e mal si addice alla consapevolezza che l’apoplasto rappresenta un compartimento altamente dinamico e continuamente modulato durante la crescita, il differenziamento e nella risposta a stress biotici e abiotici. Recenti risultati ottenuti dall’UR proponente hanno dimostrato che proteine marker di secrezione generica (secGFP) e polisaccaridi di matrice si muovono attraverso vie secretorie differenti. E’ recente l’idea che la via di secrezione è strettamente correlata al network endocitotico. Le cellule vegetali internalizzano grandi quantità di pectine e arabinogalattano proteine legate da un’ancora di GPI al plasmalemma. Recentemente, è stato dimostrato che il recettore per le flagelline FLS2, presente sulla membrana plasmatica, viene internalizzato in vescicole endocitotiche in seguito a stimolazione da flg22, peptide derivato dalla flagellina batterica.
L’unità proponente si prefigge di chiarire il ruolo della secrezione e della endocitosi nel rimodellamento della parete durante i processi di differenziamento associati allo sviluppo e di difesa attraverso l’uso di specifiche proteine marker fluorescenti, inibitori e di mutanti negativi coinvolti negli eventi di riconoscimento e fusione delle vescicole secretorie ed endocitotiche.
Il programma prevede la costruzione di marker specifici che permettano di seguire gli eventi di secrezione di proteine coinvolte nel rimodellamento dell’apoplasto e gli eventi di endocitosi nelle risposte di difesa. Si costruiranno fusioni tra GFP e:
a) CslAO2 (ipotetica funzione di beta mannano sintasi, localizzazione: Golgi);
b) CesA6 (subunità del complesso cellulosa sintasi, localizzazione: membrana plasmatica);
c) Air12 (proteina correlata agli eventi di patogenesi, localizzazione: membrana plasmatica), in collaborazione con l’UR IV;
d) FLS2 (recettore per le flagelline, localizzazione: membrana plasmatica), in collaborazione con l’UR II;
e) EFR (recettore del PAMP Ef-Tu, localizzazione: membrana plasmatica), in collaborazione con l’UR II;
f) chimera FLS2/EFR, in collaborazione con l’UR II;
e) PAO (Poliammina ossidasi, localizzazione: parete), in collaborazione con l’UR I.
Con i costrutti ottenuti si effettueranno espressioni transienti in protoplasti preparati da foglie di tabacco e foglie di piante di tabacco trasformate attraverso agroinfiltrazione. Il pattern di secrezione e di endocitosi dei costrutti verrà seguito attraverso osservazioni di microscopia confocale e avvalorato con analisi di immunoblotting delle proteine solubili, di parete e di membrana. Test con mannosamina (inibitore della sintesi dell’ancora di GPI), tunicamicina (inibitore degli eventi di N-glicosilazione), thyrphostin A23 (inibitore dell’interazione tra le adattine e le proteine cargo) e BFA (inibitore del riciclo fra gli endosomi e la membrana plasmatica) verranno condotti sui protoplasti trasformati con i costrutti ottenuti per stabilire il ruolo di questi eventi nella secrezione all’apoplasto e nell’endocitosi correlata a meccanismi di difesa in risposta a elicitori (OG e flg22). L’unità di ricerca è in possesso di mutanti dominanti negativi (DN) di SYP121 e SYP122 (sintaxine della membrana plasmatica) e di Rab11a e costruirà i mutanti DN di RabA2, RabA3, RabA5 e RabF2. I marcatori fluorescenti verranno testati in presenza dei diversi mutanti DN per verificare se e quali delle SNARE e Rab prese in esame intervengono nella loro secrezione e se alcune Rab intervengono negli eventi di internalizzazione in seguito a stimolazione con flg22 e OG. Per ricercare segnali di targeting specifici per l’apoplasto, verranno effettuate delle fusioni tra GFP e frammenti di PGIP2 e ZmPAO utilizzando la porzione C- ed N- terminale, includendo le porzioni altamente conservat
Rete regionale di laboratori per la selezione, caratterizzazione e conservazione di germoplasma e per la prevenzione della diffusione di organismi nocivi di rilevanza economica e da quarantena
No full textIl progetto si propone di raccordare e potenziare le attrezzature ed innovare i Laboratori istituzionalmente impegnati nelle attività di miglioramento genetico e diagnosi fitosanitaria presenti nel territorio regionale al fine di introdurre innovazioni tecnologiche al servizio della caratterizzazione varietale, dell'indagine biochimica e genetica e del controllo degli organismi nocivi e da quarantena
Secrezione di polisaccaridi e proteine di parete: meccanismi di controllo nel trasporto post-Golgi
No full textNelle cellule vegetali vi è continua sintesi e incorporazione di materiale polimerico nella parete con conseguente rimodellamento della stessa. Gran parte del flusso vescicolare è quindi coinvolto nel trasporto di proteine e polisaccaridi verso questo compartimento caratterizzato da una notevole dinamicità. Questo processo occupa un ruolo centrale nella traduzione di segnali esterni ed interni in risposte cellulari quali ad esempio la crescita polarizzata o l'esocitosi di specifiche molecole in riposta a patogeni. Sorprendentemente si conosce poco dell'interfaccia tra la regolazione di questi processi ed il trasporto vescicolare. Sono stati messi in evidenza parametri d'ordine generale quali calcio e fosforilazione ma poco si sa della regolazione delle SNARE e del loro assemblaggio in complessi specifici.
Obiettivo della ricerca è quello di stabilire se proteine di secrezione e componenti polimerici di parete, proteine e polisaccaridi, vengono secreti attraverso vescicole differenti, utilizzando lo stesso meccanismo di secrezione con una differente specificità, o meccanismi differenti, e se tali meccanismi variano durante la risposta di difesa. Il sistema sperimentale da utilizzare è rappresentato da piantine di tabacco (Nicotiana tabacum L) wild type e piantine transgeniche alterate nel trasporto post-Golgi con l'utilizzo di mutanti dominanti negativi delle proteine preposte a queste funzioni (Geelen D, et al., 2002. The Plant Cell 14: 387-406).
Il programma è articolato in due fasi strettamente correlate e interdipendenti: nella prima fase si studierà il ruolo di diverse proteine candidate a regolare il traffico vescicolare post-Golgi; nella seconda fase si studierà il trasporto di specifiche proteine e polisaccaridi di parete utilizzando i nuovi strumenti sviluppati nella prima fase
Ruolo della glicosilazione come risposta allo stress idrico in due genotipi di grano duro
No full textEffect of water stress on the biosynthesis of glycoproteins in roots of two genotypes of wheat varying in drought tolerance
No full textTolos
Membrane-bound glucosamine acetyltransferase in coleoptile segments of Avena-Sativa
No full textThe in vivo metabolism of D-[U-C-14]glucosamine and the in vitro properties of glucosamine acetyltransferase (EC 2.3.1.3), the first committed enzyme in the metabolism of exogenously supplied D-glucosamine, were studied in coleoptile segments of Avena sativa L. cv. Sole II. D-[U-C-14]glucosamine was taken up by oat coleoptile segments and sequentially metabolised to radioactive N-acetylglucosamine, N-acetylglucosamine 6-P, N-acetylglucosamine 1-P, UDP-N-acetylglucosamine and UDP-N-acetylgalactosamine. In addition, N-acetylglucosamine residues were incorporated into glycoproteins and glycolipids of the cells. All glucosamine acetyltransferase activity was found to be membrane-bound. The enzyme was solubilized by either digitonin or CHAPS. The specificities and the kinetics of the membrane-bound and soluble glucosamine acetyltransferase were determined. The effects of ions, nucleotides, nucleoside diphosphate amino sugars, coenzymes and group-specific chemical probes on the rate of membrane-bound and CHAPS-solubilized enzyme were investigated. Our data indicate that UDP-N-acetylglucosamine and UDP-N-acetylgalactosamine do not exert a feed-back control on the glucosamine acetyltransferase either in vivo or in vitro. Further, some nucleotides and the metal ions Cu2+, Zn2+, Fe2+, Fe3+ and Co2+ affect the activity of the enzyme in vitro
Biosynthesis of cell wall polysaccharides during drought stress in apical roots of a drought-tolerant cv. of Triticum durum.
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