152 research outputs found
Genetic variations at the human growth hormone receptor (GHR) gene locus are associated with idiopathic short stature
No full textGH plays an essential role in the growing child by binding to the growth hormone receptor (GHR) on target cells and regulating multiple growth promoting and metabolic effects. Mutations in the GHR gene coding regions result in GH insensitivity (dwarfism) due to a dysfunctional receptor protein. However, children with idiopathic short stature (ISS) show growth impairment without GH or GHR defects. We hypothesized that decreased expression of the GHR gene may be involved. To test this, we investigated whether common genetic variants (microsatellites, SNPs) in regulatory regions of the GHR gene region were associated with the ISS phenotype. Genotyping of a GT-repeat microsatellite in the GHR 5'UTR in a Montreal ISS cohort (n = 37 ISS, n = 105 controls) revealed that the incidence of the long/short (L/S) genotype was 3.3× higher in ISS children than controls (P = 0.04, OR = 3.85). In an Italian replication cohort (n = 143 ISS, n = 282 controls), the medium/short (M/S) genotype was 1.9× more frequent in the male ISS than controls (P = 0.017, OR = 2.26). In both ISS cohorts, logistic regression analysis of 27 SNPs showed an association of ISS with rs4292454, while haplotype analysis revealed specific risk haplotypes in the 3' haploblocks. In contrast, there were no differences in GT genotype frequencies in a cohort of short stature (SS) adults versus controls (CARTaGENE: n = 168 SS, n = 207 controls) and the risk haplotype in the SS cohort was located in the most 5' haploblock. These data suggest that the variants identified are potentially genetic markers specifically associated with the ISS phenotype
PLAGL1/ZAC, a transient neonatal diabetes mellitus locus gene, in pancreatic beta-cell development and function
No full textStudies on congenital disorders of the pancreas have contributed to the identification of genes that are critical in beta-cell development and function. Transient neonatal diabetes mellitus (TNDM) is a rare congenital disorder of the pancreas. It involves severe insulin deficiency at birth that reverses over weeks or months but may relapse with diabetes in later life. PLAGL1 (pleiomorphic adenoma gene-like 1, also known as ZAC, zinc finger protein that regulates apoptosis and cell cycle arrest, and LOT1, Lost On Transformation 1) is one of the two possible genes at the TNDM locus and the multiple functions of PLAGL1/ZAC strongly suggest it as the causative gene of TNDM. We hypothesized that double dose expression of PLAGL1/ZAC impairs both beta-cell development and function. To test this hypothesis, we began with the study of ZAC ontogeny. In developing human pancreas, ZAC is expressed with considerable specificity in differentiated beta-cells, and its expression decreases dramatically from the second trimester to adult. These results imply a role of ZAC in a critical time window in beta-cell development, supporting its role in TNDM and explaining the transient nature of the TNDM. In vitro, effects of ZAC overexpression on beta-cell function was observed in INS-1 cells by using tetracycline regulatable system. Overexpression of ZAC inhibits glucose-stimulated insulin exocytosis and proinsulin biosynthesis. Glucose was found to be able to downregulate Lot1/Zac1 expression in INS-1 cells and mouse islets. These data suggest ZAC as a negative regulator in some glucose-regulated pathways whose abnormally high level impairs beta-cell function that explains the relapse of diabetes in TNDM. Finally, a gene expression profile study of INS-1 cells with or without induced ZAC expression identified STC1, IGF1R, SNAP25, GRP78, and P58IPK as possible targets of ZAC that mediate beta-cell dysfunctions. CRABP2, strongly upregulated by ZAC, together with G0S2, GADD45alpha, and FHL2, may mediate ZAC function in both normal beta-cell development and TNDM pathophysiology. In general, these studies suggest that tightly controlled expression level of ZAC is critical for beta-cell development and function. It provides strong evidence that ZAC overexpression causes TNDM. In addition, two previously unstudied genes, STC1 and CRABP2, are suggested to play potential important roles in beta-cell function and development.Les études portant sur les désordres congénitaux du pancréas ont contribué à l'identification de gènes critiques pour le développement et la fonction des cellules bêta. Le diabète néonatal transitoire (DNNT) est une maladie héréditaire du pancréas. Elle est caractérisée par une déficience sévère en insuline à la naissance qui disparaît après quelques semaines/mois mais pouvant réapparaître plus tard au cours de la vie. PLAGL1 (pleiomorphic adenoma gene-like 1, aussi connu comme ZAC, zinc finger protein that regulates apoptosis and cell cycle arrest, et LOT1, Lost On Transformation 1) est un des deux gènes dans la région critique du DNNT et ses multiples fonctions en font le candidat causatif le plus probable. Notre hypothèse est que sa surexpression compromet la fonction et le développement des cellules bêta. Notre étude ontgénique de ZAC dans le pancréas en développement, démontre que ZAC était exprimé avec une spécificité considérable dans les cellules bêta, expression qui diminuait à partir du second trimestre. Ces résultats supportent l'existence d'une fenêtre temporelle critique pour la fonction de ZAC dans le développement des cellules bêta, compatible avec la nature transitoire du DNNT. In vitro, les effets de la surexpression de ZAC ont été observés dans les cellules bêta INS-1 en utilisant un système d'expréssion inductible par la tétracycline. L'exocytose glucose-dépendante de l'insuline et la biosynthèse de la proinsuline sont diminués par la surexpression de ZAC. Le glucose pouvait diminuer l'expression de Lot1/Zac1 dans les INS-1 et dans les îlots murins, une observation qui propose ZAC comme un régulateur négatif de voies métaboliques régulées par le glucose dont les niveaux anormalement élevés affectent la fonction des cellules bêta. Le profile d'expression génique sur les INS-1 après induction de ZAC a identifié STC1, IGF1R, SNAP25, GRP78 et P58IPK comme cibles potentielles de ZAC intervenant dans les dysfonctionnements des cellules bêta. CRABP2, qui est fortement augmenté, tout comme G0S2, GADD45alpha et FHL2, pourrait servir de médiateur de ZAC dans le développement des cellules bêta et dans le DNNT. Ces études indiquent qu'une expression minutieusement contrôlés de ZAC est critiques pour le développement et la fonction des cellules bêta et que sa surexpression peut causer le DNNT. Finalement, un rôle de STC1 et CRABP2 dans la fonction et le développement des cellules bêta est suggéré
An autosomal recessive alopecia areata locus with lymphoproliferative syndrome in mice
No full textABSTRACTA novel animal model of alopecia areata (AA) has been developed spontaneously due toan autosomal recessive mutation in the NOD background. Alopecia mice have strikingalopecia phenotype accompanied by drastically swelling cervical lymph nodes, enlargedspleen and body weight loss. In the present study, we identified a locus that segregateswith the alopecia phenotype, and we investigated the cause of alopecia phenotype. Weperformed exome sequencing on two alopecia mice and one obligate heterozygote mousewhich we used as a control to identify the candidate mutation. As a result, we were ableto identify a mutation in 5’UTR of the Ptprd gene that segregates very well withphenotype (LOD=8.3 at θ=0). However, the KO mice of Ptprd gene don’t have the samephenotype, thus, making it unlikely that this mutation is causative. We believe that themutation maps to one of the neighboring genes.Histology and immunohistochemistry staining show that the hair loss is associated with Tlymphocyte infiltration in the upper part of the hair follicle. Histological sections showevidence of hair shaft destruction, epithelial and sebaceous gland hyperplasia in theaffected skin. Flow cytomery analysis of cells from the enlarged cervical lymph nodes ofmice aged 8 weeks showed a significant association between alopecia phenotype andreduction of T cells (P=0.0001*) and significant increase in the non-T cells populations(P<0.0007*) and in the proliferation of T-cells (P< 0.000424*). Moreover, in mice aged 6months, alopecia phenotype found to be associated with significant increase in the splenicmacrophage population and in the CD4+CD25+ Treg cell population in the cervical lymphnodes, which indicates the involvement of both innate and adaptive immunity in thepathogenesis of AA.RÉSUMÉUn nouveau modèle animal de la pelade (alopecia areata, AA) a été développé spontanément chez la souris, en raison d'une mutation autosomique récessive dans le background génétique NOD. Les souris atteints ont un phénotype frappant d'alopécie, accompagnée par un gonflement de important les ganglions cervicaux, la rate et la perte de poids corporel. Dans la présente étude, nous avons identifié un locus cohérité avec le phénotype de l'alopécie, et nous avons étudié la cause de ce phénotype d'alopécie. Nous avons effectué le séquençage d'exome de deux souris avec alopécie et une souris hétérozygote obligatoire que nous avons utilisé comme contrôle pour identifier la mutation. En conséquence, nous avons pu identifier une mutation dans le 5'UTR du gène Ptprd fortement lié au phénotype (LOD = 8,3 à θ = 0). Cependant, les souris KO de Ptprd n’ont pas le même phénotype, ce qui rend peu probable que cette mutation est responsable. Nous pensons que la maladie est due à une mutation d’un gène voisin. Histologie et immunohistochimie montrent que la perte de cheveux est associée à l'infiltration de lymphocytes T dans la partie supérieure du follicule pileux. Des coupes histologiques montrent des signes de destruction du corps des cheveux, une hyperplasie des glandes sébacées et de l’ épithélium de la peau affectée. L'analyse par cytomerie en flux des cellules des ganglions cervicaux enflés à l’âge de 8 semaines a montré une association significative entre l'alopécie et la réduction des cellules T (p = 0,0001 *) et augmentation significative de la population des cellules non-T (P <0,0007 *) ainsi qu’une inhibition de la prolifération des lymphocytes T (p <0,000424 *). En outre, chez des souris âgées de 6 mois, l'alopécie est associée à une augmentation significative de la population de macrophages de la rate et de la population de cellules CD4 + CD25 + Treg dans les ganglions lymphatiques cervicaux, ce qui indique l'implication de l'immunité innée et adaptative dans la pathogenèse de AA
Characterization of regulators of insulin expression in medullary thymic epithelial cells
No full textType 1 diabetes susceptibility is associated with genetic variants that cause a lower level of insulin expression in the thymus, and more specifically in the medullary thymic epithelial cells (mTECs). The expression of insulin as well as other self-antigens in these mTECs has been demonstrated to be an essential component in the maintenance of self-tolerance. Although the Aire regulator is a known modulator of self-antigen expression in mTECs, not much else is known on the regulation of specific self-antigens and particularly of insulin's expression. My thesis project centers on this question.I first generated direct evidence that higher glucose, the main metabolic stimulus regulating insulin secretion in the pancreas, had no effect on the expression of insulin in the thymus with studies both in vivo and in vitro. I then showed that pro-inflammatory cytokines Ifn-γ and Tnf-α have a regulatory effect whereby their addition to cultured mTECs decreased levels of insulin, and mice lacking either of the two cytokines had increased levels of both insulin and other self-antigens. In addition, this mechanism was found to be independent of Aire, the first finding where Aire and insulin expression are discordant. Another factor that modulated the expression of insulin was the co-culturing of thymocytes with mTECs. The direct cell-to-cell contact of the two cell types upregulated insulin expression, as well as the expression of Aire. Furthermore, a microarray analysis generated an expression profile for two individual clones of mTECs, one that expresses insulin and one which does not. This has enabled a comprehensive view of the genes expressed by single mTECs, which had previously been impossible to define. A new surface marker was found to be differentially expressed in the insulin positive clone; CD34. The isolation of CD34+ primary mTECs showed an increased level of insulin expression and Aire expression. These findings have uncovered some of the Aire-independent regulatory mechanisms for insulin expression as a self-antigen in mTECs.La prédisposition au diabète de type 1 est associé aux variantes génétiques qui modulent le taux d'expression de l'insuline dans le thymus et particulièrement dans les cellules médullaires epithéliales (mTECs). Cette expression de l'insuline ainsi que d'autres auto-antigènes dans les mTECs est essentielle pour maintenir l'auto-tolérance. Bien que le régulateur Aire est reconnu comme le principal contrôleur de l'expression des auto-antigènes il n'existe pas beaucoup plus d'information sur la régulation des auto-antigènes spécifiques et particulièrement sur l'insuline. Ma thèse est centrée sur ces questions.J'ai premièrement obtenu la preuve directe que le taux de glucose, le stimulus principal qui module l'insuline dans le pancréas ne modifie pas les niveaux d'expression de l'insuline dans le thymus, et ceci avec des études in vivo et in vitro. J'ai par après aussi démontré que les cytokines pro-inflammatoires Ifn-γ et Tnf-α ont des effets régulateurs dans le thymus, et l'addition de ces cytokines aux lignées cellulaires mTECs réduit les niveaux de l'insuline. Dans les souris manquant les gènes pour ces cytokines l'expression de l'insuline et d'autres auto-antigènes augmente. En plus, ce mécanisme est indépendant du régulateur Aire et constitue la première observation montrant l'absence de correlation entre l'insuline et Aire. Un autre facteur qui modifie les niveaux de l'insuline est la co-culture des thymocytes avec les mTECs. Le contact direct des deux types de cellules a augmenté l'expression de l'insuline ainsi que l'expression de Aire. De plus, nous avons procédé à l'analyse du profil transcriptionnel d'ARN de deux souches clonales de mTECs, une qui exprime l'insuline et une qui ne l'exprime pas. Ces résultats ont permis une vue d'ensemble des gènes qui sont exprimés par un mTEC individuel, que auparavant était impossible. Un nouveau marqueur de surface a été ainsi identifié, CD34, qui est exprimé à plus haut niveau dans le clone positif pour l'insuline. Les cellules mTECs primaires qui expriment CD34 ont étés séparées et elles expriment un niveau élevé l'insuline et le Aire. Ces résultats ont démontrés des nouveaux mécanismes indépendants de Aire qui contrôlent l'expression de l'insuline comme auto-antigène dans les mTECs
Autosomal recessive insulin-dependent diabetes
No full textBackground and hypothesis: Type 1 diabetes (T1DM) is due to the autoimmune destruction of the insulin-producing pancreatic beta-cells. T1DM is a multifactorial disease with a strong genetic (polygenic) component. However, not all cases of insulin-dependent diabetes starting early in life are of autoimmune and polygenic etiology. Indeed, neonatal diabetes and MODYs (Maturity-Onset Diabetes of the Young) are both monogenic diseases that can still be misdiagnosed as T1DM. Our hypothesis is that a new form of monogenic, autosomal recessive, non-autoimmune, insulin-deficient, young-onset diabetes exists but has escaped identification because of lack of strongly suggestive family or clinical history. Objective: To discover genes whose mutations are responsible for this type of diabetes by exome sequencing of selected multiplex families diagnosed as T1DM. Materials and Methods: Data from 2,345 sibling pairs affected with T1DM, from the T1DM Genetics Consortium (T1DGC) were analyzed for the presence of autoimmune markers (3 available autoantibody tests (GAD65, ZNT8 and IA2)). From 167 families where both affected siblings were autoantibody-negative, we found 37 families in which both were also negative for any of the known predisposing HLA haplotypes (e.g. HLA-DRB1*04/DQB1*0302 or HLA-DRB1*0301/DQB1*0201). Although some of these 37 families may still have autoimmune T1DM, we posited that most could have diabetes for a reason other than autoimmunity. DNA from all members of these 37 families was obtained from the NIDDK repository and DNA from 14 affected children was sent to McGill/Génome Québec Innovation Centre for whole-exome sequencing (WES). Results: Before filtering WES results to select new candidate genes, we identified 3 families with mutations in genes already known to be involved in monogenic diabetes: KCNJ11 and WFS1. Thereafter, we selected 20 new candidate genes according to 3 criteria: 2 or more protein-altering variants, positive LOD (Logarithm of Odds) score in the nuclear family, and significant expression of the gene in the pancreatic islets (RPKM (reads per kb per million) higher than 3). We genotyped probands and their families for SNVs found in 16 of those candidate genes and we found 3 genes carrying variants that segregated with the disease under a recessive model (NCKAP5L, HSPBAP1 and SCAMP2). We sequenced all families linked to those 3 loci but we did not find any other family with mutations inherited on a recessive Mendelian fashion within one of those 3 genes. Based on our first findings (KCNJ11 and WFS1 diabetes misclassified as T1DM), we posited that some patients with MODY3, the most frequent type of MODY, must also be misdiagnosed as T1DM. Among all samples listed in the NIDKK repository, we selected families where one parent was diabetic and where the affected children and the affected parent were negative for autoimmune markers. Nine families fulfilled these criteria. All protein-coding exons of HNF-1α were sequenced in 2 families that showed linkage at the HNF-1a locus and whose DNA was available. We found c.599 G>A missense mutation (p.R200Q) within exon 3 in the affected mother and in the 3 affected children of the first family, confirming MODY3 diagnosis. Conclusions: Different cases of monogenic diabetes are still misdiagnosed as T1DM. Usually, clinical and/or family history should help us making the right diagnosis. Some monogenic diabetes (e.g. KCNJ11) represent life-changing diagnosis as they can be treated with sulfonylureas for perfect glycemic control without risk of hypoglycemia. In addition to missed diagnosis, some mutations appear to alter to a lesser extent the protein function which can influence clinical evolution of the disease and explain misdiagnosis. In the same way, we have identified three highly likely candidate genes for a new form of autosomal recessive form of diabetes that remain to be confirmed in at least 1 additional unrelated proband.Introduction et hypothèse: Le diabète de type 1 (DT1) est une maladie causée par la destruction auto-immune des cellules β du pancréas, productrices d'insuline. L'origine du DT1 est multifactorielle avec une composante génétique (polygénique) importante. Tous les cas de diabète insulino-dépendant débutant précocement ne sont cependant pas d'origine polygénique. En effet, les diabètes néonataux et les MODYs sont des maladies monogéniques qui sont encore sous-diagnostiquées ou mal catégorisées. Notre hypothèse est qu'une nouvelle forme de diabète monogénique, autosomique récessif, non auto-immun, insulino-dépendant, à début précoce existe et serait non diagnostiquée en raison de l'absence d'histoire familiale ou de tableau clinique spécifiques. Objectif: Découvrir un gène dont la mutation serait responsable de ce type de diabète, par séquençage d'exons de familles multiplexes diagnostiquées avec un DT1. Méthodologie: 2,345 paires de frères et sœurs atteints de DT1 et regroupées au sein du T1DM Genetics Consortium (T1DGC) furent testées pour les 3 auto-anticorps disponibles (GAD65, IA2 et ZnT8)). Des 167 familles où les 2 enfants diabétiques étaient négatifs pour les auto-anticorps, 37 étaient également négatifs pour les haplotypes prédisposant du HLA (HLA-DRB1*04/DQB1*0302 or HLA-DRB1*0301/DQB1*0201). Bien que certaines de ces 37 familles doivent malgré tout souffrir d'un diabète auto-immun, nous avons émis l'hypothèse que la majorité devait être atteinte d'une autre forme de diabète. L'ADN des membres des 37 familles a été obtenu du NIDDK et 14 échantillons ont été envoyés à McGill/Génome Québec Innovation Centre pour un séquençage complet d'exons Résultats: Nous avons identifié 3 familles avec des mutations dans les gènes KCNJ11 et WFS1, impliqués dans des diabètes monogéniques connus. Nous avons ensuite sélectionné 20 gènes candidats sur 3 critères : la présence d'au moins deux variants modifiant la séquence de la protéine, un LOD (Logarithm of Odds) score positif dans la famille du proband et l'expression significative du gène dans le pancréas (RPKM (reads per kb per million) supérieur à 3). Nous avons génotypé les probands et leurs familles pour les variants trouvés dans 16 de ces 20 gènes candidats et nous avons trouvé 3 gènes d'intérêt où les variants étaient transmis selon un mode autosomique récessif (NCKAP5L, HSPBAP1 et SCAMP2). Nous avons séquencé toutes les familles qui avaient un LOD score positif pour ces loci mais n'avons trouvé aucune autre famille qui portait une variation transmise selon un mode autosomique récessif. Étant donnée la découverte de familles porteuses de diabètes monogéniques connus au sein de notre cohorte initiale, nous avons émis l'hypothèse que certains patients étiquetés de DT1 pouvaient être atteints de MODY3. Parmi les échantillons du T1DGC, nous avons sélectionné les familles où un parent était diabétique et où les enfants et le parent atteints étaient négatifs pour tout marqueur d'auto-immunité. Neuf familles remplirent ces critères. Nous avons séquencé tous les exons codants d'HNF-1α dans 2 d'entre elles qui présentaient un LOD score positif pour le locus de ce gène et pour lesquelles nous disposions d'ADN. Nous avons trouvé la mutation faux-sens c.599 G>A (p.R200Q) chez la mère et les 3 enfants diabétiques de la première famille, confirmant le diagnostic de MODY3. Conclusions: Différents cas de diabètes monogéniques sont encore mal diagnostiqués et étiquetés de DT1. Le tableau clinique et/ou l'histoire familiale devraient aider le clinicien à poser un diagnostic adéquat permettant dans certains cas de changer le schéma thérapeutique pour une médication orale, plus confortable avec un meilleur contrôle de la glycémie. Nous avons également identifié 3 gènes candidats très prometteurs pour une nouvelle forme autosomique récessive de diabète qui doivent cependant encore être validés chez un proband non lié aux familles séquencées
A functional analysis of the IDDM2 susceptibility locus in type 1 diabetes /
No full textType 1 diabetes is an autoimmune disease characterized by destruction of the insulin-producing pancreatic beta-cells. Genetic predisposition, encoded by a number of loci, plays a large role in the probability of disease development. The IDDM2 susceptibility locus maps to the insulin gene (INS) variable number of tandem repeats (VNTR) minisatellite, which has two main clusters of alleles. As a whole, alleles of the class III cluster reduce the probability of developing type 1 diabetes and those of the class I cluster predispose to type 1 diabetes. To determine the functional basis of this susceptibility and protection, we tested the hypothesis that the IDDM2 effect is mediated through INS VNTR effects on transcription levels of the nearby INS and insulin-like growth factor 2 (IGF2) genes, in tissues known to be of importance in the pathogenesis of the disease. We have found evidence to suggest that protective INS VNTR alleles are associated with different levels of INS expression in the thymus than predisposing alleles, and that these levels correlate with the level of protection conferred by the INS VNTR alleles in population studies. Thus, alleles associated with high expression are protective, while alleles associated with no expression are very predisposing. This suggests that IDDM2-encoded susceptibility is mediated, at least in part, through variable expression of thymic INS which may in turn affect the efficiency of central immune tolerance induction to INS-encoded antigenic epitopes and the probability of an autoimmune response against the beta-cells. Furthermore, we did not detect any significant difference in IGF2 mRNA levels associated with the protective INS VNTR class of alleles as compared to the predisposing class in thymus, pancreas and leukocytes. This argues against IGF2 as a target gene through which INS VNTR alleles mediate susceptibility to type 1 diabetes
Variability of genomic imprinting in human disease
No full textGenomic imprinting is the differential expression of genetic material depending on the parent from which it is transmitted. It is involved in the pathogenesis of many diseases, especially those involved in development, growth abnormalities and cancer. We examined the extent of and the variability of genomic imprinting amongst individuals in three human diseases, Wilms' tumour, Type 1 diabetes and Silver-Russell syndrome.Wilms' tumour (WT) is a renal embryonal cancer associated with overexpression of the insulin-like growth factor 2 (IGF2). IGF2 is directed to the lysosomes for degradation by the mannose-6-phosphate/insulin-like growth factor two receptor (M6P/IGF2R) encoded by the IGF2R gene, a known tumour suppressor gene on 6826. IGF2R is imprinted in the mouse, with exclusive maternal expression. In humans, however, IGF2R imprinting is a polymorphic phenomenon only being found in a small subset of people. We present results suggesting that IGF2R imprinting provides the first "hit" in IGF2R inactivation in WT, and show the presence of a second "hit" in the form of deletions detectable as loss of heterozygosity.Another disease investigated in this report is Type 1 diabetes (TID), an autoimmune, polygenic disease. Of the several T1D loci, IDDM8 on 6q, has been found to be subject to parent-of-origin effects and encompasses IGF2R. M6P/IGF2R is involved in immune system regulation. In this study we show an association between TID and IGF2R that is confined to maternally inherited alleles. Our results strongly suggest that IGF2R is a TID susceptibility gene and may be universally imprinted at some tissue or developmental stage not yet studied.A third disease displaying both tissue-specific and isoform-specific imprinting is Silver-Russell syndrome (SRS), a growth disorder associated with double dose of a maternally expressed gene within 7p11.2--p13, a region in which the imprinted GRB10 gene was a prime candidate. We studied the complex tissue and isoform-dependence of GRB10 imprinting and demonstrated absence of imprinting in growth plate cartilage, the tissue most directly involved in linear growth thus eliminating GRB10 as the gene responsible for SRS.It is evident that genomic imprinting plays a prominent role in various diseases. Imprinted genes can be expressed in a tissue-specific, isoform-specific or a temporally regulated manner. In addition, there is a wide variability of imprinting between individuals
Functional characterization of novel genetic loci associated with type 1 diabetes
No full textType 1 diabetes (T1D) is an autoimmune disease that results from the destruction of the insulin producing beta cells by the immune system. A disease of complex etiology, it involves both genetic and environmental factors. Over 40 genetic loci have been shown to increase T1D risk, where allelic variation at several polymorphisms underlies their genetic association. Two of the most important ones map to chromosome 2q24.3, containing functional polymorphisms at the IFIH1 gene, whose role is to bind double stranded (ds) viral RNA and to subsequently induce a type I interferon response, and to chromosome 16p13, encompassing the single CLEC16A gene whose function is unknown. To elucidate the mechanism of these associations, we undertook separate studies to functionally evaluate the role of a T1D-associated IFIH1 polymorphism and to characterize the possible role of CLEC16A in immunity. We began by investigating the role of the T1D-associated coding polymorphism in the IFIH1 gene, Thr946Ala, contained in a linkage disequilibrium (LD) block that encompasses three other genes. Due to the extent of the LD in the region and the possibility of genetic heterogeneity, the Thr946Ala IFIH1 polymorphism could be a marker for a regulatory variant that affects the expression of IFIH1 or the other genes in the IFIH1 block: GCA, KCNH7, and FAP. Upon testing this hypothesis, we observed no significant transcriptional effects at the IFIH1 locus in tissues most relevant to T1D. We also report that protein alleles of the Thr946Ala single nucleotide polymorphism (SNP) had no significant effect on secreted IFN-α levels induced by poly I:C, a dsRNA mimic. Taken together, both studies suggest that the mechanisms of the observed association of the Thr946Ala SNP remains to be determined but does not involve modulation of mRNA or a poly I:C-driven IFN-α response. For the latter, a greater sample size would be needed to confirm this, due to the large observed variability in the IFN response.Our last study focused on the characterization of the CLEC16A protein, whose preferential expression in two antigen presenting cell types points to its potential role in immunity. We thus hypothesized that CLEC16A could be involved in T-cell co-stimulation and activation and assessed this in an antigen-independent model. We found that CLEC16A does not participate in the T-cell co-stimulation pathway, as shown by the lack of effect of the CLEC16A knockdown on T-cell activation and proliferation. We also show subcellular localization of CLEC16A to the rough endoplasmic reticulum (ER). Our results highlight the difficulty in transitioning from T1D genetic associations to functional studies, which are essential in bridging genetic predisposition with biological mechanisms underlying the immune dysregulation associated with T1D. All hypotheses will need to be examined and ruled out one by one until the true mechanism is discovered.Le diabète de type 1 (DT1) est une maladie auto-immune où les cellules bêta, productrices de l'insuline, sont détruites par le système immunitaire. Cette maladie dont l'étiologie est complexe, implique à la fois des facteurs génétiques et environnementaux. Plus de 40 loci génétiques, où il y a une association avec la variation allélique de plusieurs polymorphismes, ont été montré comme augmentant le risque de DT1. Deux de ces régions les plus importantes sont localisés dans la région chromosomique 2q24.3, qui contient des polymorphismes fonctionnels au niveau du gène IFIH1 dont le rôle est de lier l'ARN double brin (DS) viral pour à la suite induire une réponse interféron de type I (IFN), et dans la région chromosomique 16p13, englobant un seul gène nommé CLEC16A dont la fonction est inconnue. Pour élucider le mécanisme de ces associations, nous avons entrepris des études distinctes pour évaluer le rôle fonctionnel d'un polymorphisme de IFIH1 associé au DT1 et de caractériser le rôle possible de CLEC16A dans l'immunité. Nous avons commencé par étudier le rôle d'un polymorphisme codant, Thr946Ala, du gène IFIH1 associé au DT1 et situé dans un bloc de déséquilibre de liaison (DL) qui comprend trois autres gènes. En raison de l'ampleur du DL dans la région ainsi que la possibilité d'une hétérogénéité génétique, le polymorphisme Thr946Ala IFIH1 pourrait être un marqueur pour un variant qui affecte l'expression du gène IFIH1 ou des autres gènes dans le bloc : GCA, KCNH7 et FAP. Lorsque nous avons testé cette hypothèse, nous n'avons observé aucun effet significatif sur la transcription au niveau du locus IFIH1 dans les tissus les plus pertinents pour le DT1. Nous indiquons également que les allèles protéiniques du polymorphisme d'un seul nucléotide (SNP) Thr946Ala n'ont pas d'effets significatifs sur les niveaux l'IFN-α sécrété suite à une stimulation par le poly I:C, un composé imitant l'ARN double brin. Pris ensemble, ces deux études suggèrent que les mécanismes de l'association observée pour le SNP Thr946Ala restent à déterminer, mais n'impliquent pas la modulation de l'ARNm ou la réponse d'IFN-α via le poly I:C. Pour ce dernier, un échantillonnage plus grand serait nécessaire afin de confirmer cette hypothèse en raison de la grande variabilité observée dans la réponse IFN. Notre dernière étude portait sur la caractérisation de la protéine CLEC16A dont l'expression préférentielle par deux types de cellules présentatrice d'antigènes, suggère un rôle potentiel dans l'immunité. Nous avons donc émis l'hypothèse que CLEC16A pourrait être impliqué dans la co-stimulation et l'activation des lymphocytes T et avons évalué celle-ci dans un modèle indépendant d'un antigène. Nous avons constaté que CLEC16A ne participe pas dans la voie de la co-stimulation, comme en témoigne par l'absence d'effets sur l'activation et la prolifération des lymphocytes T lors de la déplétion de CLEC16A. Nous montrons également que la localisation subcellulaire de CLEC16A est dans le réticulum endoplasmique rugueux (RE). Nos résultats mettent en évidence la difficulté qu'est de faire la transition à partir d'associations génétiques avec le DT1 vers des études fonctionnelles, qui sont essentielles pour pouvoir faire le pont entre la prédisposition génétique et les mécanismes biologiques qui sous-tendent le dysfonctionnement immunitaire associé au DT1. Toutes les hypothèses devront être examinées et écartées une par une jusqu'à ce que le mécanisme réel soit découvert
Effects of RNA polymorphisms on ribosomal protein S26 (RPS26) translational efficiency
No full textBackground: The effect of common polymorphisms on transcription levels of a large number of genes has been well documented and defined genome-wide in numerous studies. However, the effects of common mRNA polymorphisms on translation have received little attention. RPS26 exhibited one of the strongest associations (p = 10-10) in our group's genome-wide search to identify transcripts whose relative distribution between heavy polysomes (active translation) and soluble RNA (inactive) was skewed by single-nucleotide polymorphisms. The RPS26 SNPs most strongly associated with ribosomal distribution, rs17118262 (C/G) and rs1131017(C/G), are located 9 bases apart, are in strong linkage disequilibrium (D'=1) but have different allele frequencies (r2=0.54). The goal of the present study was to confirm and quantify the effect of those RPS26 SNPs on translational efficiency at the protein level. RPS26 was selected for this purpose because rs1131017 is also associated with type 1 diabetes (T1D), the second strongest novel association in our genome-wide association study (GWAS).Methods: To independently confirm the translational imbalance found by ribosomal distribution, we studied allelic ribosomal distribution in single heterozygous samples (allelic translation) with Single Nucleotide Primer Extension (SNuPE) and Pyrosequencing. To test the hypothesis that mRNA with the allele most associated with ribosomes also produces more RPS26 protein, we applied both an ex vivo direct measurement and an in vitro translation approach.Results: Pyrosequencing and SNuPE confirmed the translational imbalance favouring the G allele of the rs17118262. Both ex vivo and in vitro translation showed that the same allele that was found at a higher proportion in the polyribosomal fraction than in the soluble RNA produces more protein product under the same translational environment. Conclusion: Both SNPs (the common rs1131017 and the rare rs17118262 variant) exert a significant effect on the amount of RPS26 protein that is produced. Adding to the well-studied polymorphic transcriptional effects, the effects of exonic single-nucleotide polymorphisms (SNPs) on translational efficiency may be equally important in determining protein expression levels and therefore contributing significantly to the disease risk. RPS26 in type 1 diabetes is an excellent example of such an association.L'effet des polymorphismes fréquents (SNPs) sur les niveaux de transcription d'un grand nombre de gènes a été bien documenté et défini à l'échelle du génome dans de nombreuses études. Toutefois, les effets des polymorphismes communs sur la traduction de l'ARN messager (ARNm) ont reçus peu d'attention. Dans notre étude à l'échelle du génome qui étudiait des polymorphismes donnant une distribution différentielle entre les polysomes lourds (traduction active) et de l'ARN soluble (inactif), le gène RPS26 a montré une des plus fortes associations (p = 10-10). Les SNPs dans RPS26 les plus fortement associés à une différence de distribution des ribosomes, rs17118262 (C / G) et rs1131017 (C / G), sont séparés par 9 bases et sont en fort déséquilibre de liaison (D '= 1) mais ont des fréquences alléliques différentes (r2=0.54). L'objectif de la présente étude était de confirmer et de quantifier l'effet de ces SNP dans RPS26 sur son efficacité de traduction au niveau protéique.Méthodes: Pour confirmer de manière indépendante le déséquilibre constaté au niveau de la distribution des ribosomes, nous avons étudié la distribution des allèles dans des échantillons hétérozygotes pour chaque un des 2 SNPs avec à l'aide des techniques d'extension nucléotidique simple d'amorces (SNuPE) et de pyroséquençage. Pour tester l'hypothèse que l'ARNm avec un allèle particulier produit plus de protéines RPS26, nous avons appliqué à la fois une approche de quantification ex vivo et traduction in vitro.Résultats: Le SNuPE et le pyroséquençage ont confirmé le déséquilibre au niveau de la traduction montrant une supériorité de l'allèle G du SNP rs17118262. Les approches ex vivo et in vitro ont montré que la traduction de l'allèle trouvé dans une proportion plus élevée dans la fraction de polysomes lourds produit plus de protéines par rapport à l'autre allèle dans les même conditions.Conclusion: Les deux SNPs (le rs1131017 qui est fréquent et le rs17118262, de moindre fréquence) exercent un effet significatif sur la quantité de protéine RPS26 produite. Combiné à l'effet déjà connu des SNPs sur les niveaux de transcription, leur effet sur la variation du niveau de traduction est peut-être aussi important dans la détermination du niveau total de protéines et par le fait même contribuer au risque de maladie de manière significative. RPS26 au niveau du diabète de type I en est un parfait exemple
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