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Role of Antibiotic Side Chains in Uptake Through OmpPst1 Channel from Providencia Stuartii
No full textStructural and functional insights into the contribution of Providencia stuartii's porins to the persistence of infections
No full textLes porines sont des protéines « canal » qui assurent la diffusion non-spécifique des ions et nutriments au sein des bactéries à Gram-négatif. Elles sont également la voie d'entrée des antibiotiques hydrophiles, en particulier les β-lactames. Des mutations au sein des porines, ou leur sous-expression, ont été rapportées dans de nombreux cas d'infections multi-résistantes au cours de la dernière décade, soulignant le rôle de ces protéines dans la résistance aux antibiotiques.La première partie de ma thèse a porté sur l'étude des relations structure fonction au sein des deux porines non spécifiques de Providencia stuartii, Omp-Pst1 et Omp-Pst2. Il a été montré qu'Omp-Pst1 est majoritairement responsable de l'entrée des antibiotiques. Afin de comprendre comment évolue cette porine in situ, nous avons réalisé une étude comparative sur les variantes d'Omp-Pst1 issues de la souche sauvage et de deux isolats cliniques. Globalement, ces structures pointent vers un consensus dans l'adaptation des porines in situ, lequel repose sur l'accumulation de résidus chargés positivement dans les boucles extracellulaires et dans le canal. Cette observation est en accord avec les mesures de translocation effectuées à l'échelle de la porine unique, lesquelles montrent une diffusion ralentie des antibiotiques chargés négativement au travers des porines issues des isolats cliniques. Mis ensemble, nos résultats démontrent le rôle critique joué par les porines dans la résistance aux antibiotiques, lequel vise à diminuer l'influx de ces derniers tout en conservant l'habilité pour la bactérie de se nourrir.La deuxième partie de ma thèse s'est focalisée sur une fonction inédite des porines, à savoir leur rôle dans l'association intercellulaire et la genèse de biofilms bactériens. Les porines sont généralement exprimées sous la forme de trimères fonctionnels enchâssés dans la membrane externe des bactéries à Gram-négatif. Le mécanisme d'adhésion mis en évidence par mes travaux de thèse repose sur la formation de dimères de trimères de porines, associées face à face par leurs boucles externes, grâce à une interaction de type steric zipper. En exploitant un large panel de méthodologies biophysiques et d'imageries, nous avons caractérisé les propriétés adhésives d'Omp-Pst1 et Omp-Pst2, à la fois in vitro et in vivo. Nous avons également investigué le transport de petites molécules fluorescentes au travers de ces dimères de porines, afin de vérifier leur putative implication dans la communication intercellulaire. Nos résultats démontrent la capacité des porines Omp-Pst1 et Omp-Pst2 à former des jonctions intercellulaires et les suggèrent donc comme des cibles thérapeutiques prometteuses dans la lutte contre les infections bactériennes.Present in the outer membrane of bacteria, porins are the main gateway for soluble molecules, such as nutrients and ions, into the bacteria. They are also the way taken by hydrophilic antibiotics to reach their targets and kill the cell. Under the strong selective pressure caused by antibiotic overuse, bacteria have evolved modified porins that are less permeable to antibiotics. Although not the only strategy developed by bacteria to survive drug treatment, it is an important factor in the spreading phenomenon of multidrug resistant infections.In order to gain further insights into the molecular determinants of antibiotic translocation, the first part of my thesis work aimed at resolving the crystallographic structures of Omp-Pst1 and Omp-Pst2, two non-specific porins encoded in the genome of Providencia stuartii. This bacterial species is not very invasive and, therefore, causes endemic rather than epidemic infections. However, these infections are often fatal given the intrinsically stringent MDR phenotype of this species. It has been shown that Omp-Pst1 is the main entrance for β-lactam antibiotics. To provide structural and functional insights into the contribution of P. stuartii porins to antibiotic resistance phenotypes, structural analysis was undertaken, not only from the wild type strain but also from two clinical mutant strains i.e. Omp-Pst1-99645 and Omp-Pst1-Nea16. Mutations result in more pronounced anion selectivity due to an increased number of positively charged amino acids lining the pore and mostly in the extracellular loops in both mutants compared to the wild type. To further determine whether these mutations contributed to a decrease in antibiotic uptake, we undertook the characterization of β-lactam antibiotics transport kinetics using electrophysiology studies at the single protein level. For the zwitterionic β-lactam tested, single-molecule conductance measurements evidenced a decrease in the association rate constant, in both mutants compared to the wild type. However, we observed instead an increase in these values for the negatively charged β-lactam, which is in good agreement with our structure-based analysis. All together, our results point towards porins playing a major role in the antibiotic resistance mechanism by reducing drug uptake.In the second part of my thesis work, we discovered that porins could self-associate to form adhesive junctions between two cells and could provide the initial scaffold for the establishment of biofilms at early stages of their developpement. The self-matching interaction is mediated by a steric zipper interaction and involves their extracellular loops. In order to confirm the adhesive proprieties of porins, we exploited a large panel of biophysical and imaging methods both in vitro and in vivo. Furthermore, we studied their diffusive proprieties in reconstituted liposomes, to explore whether these self-matching interactions between porins could play a role in cell-to-cell communication. Our results point at a major role of P. stuartii porins, Omp-Pst1 and Omp-Pst2, in cell-to-cell adhesion and make them promising targets to disrupt bacterial biofilm infections
Exploring the limits of in vivo micro-diffraction and nanocrystallography by implementing a serial data collection approach
No full textAlors qu’il fallait jusqu’en 2011 utiliser des cristaux de taille submillimétrique (~50-100 µm) pour espérer résoudre une structure macromoléculaire à résolution atomique, des échantillons nanométriques peuvent désormais être utilisés. Ce changement de paradigme a été permis par l’avènement des méthodes de diffraction en série tel que la cristallographie sérielle à l’échelle de la femtoseconde (SFX) implémentée dans des XFEL, mais aussi grâce à l’exploitation de l’interaction des électrons avec la matière, permettant d’obtenir des données de diffraction utiles à partir de nanocristaux présentés au faisceau d’électrons dans un environnement cryogénique. Le bénéfice de l’approche sérielle a été démontré pour la diffraction électronique (serial-ED), mais le nombre d’échantillons jusqu’ici étudié par cette méthode reste anecdotique. Parallèlement, la plupart des synchrotrons ont vu leur brillance augmenter, à la faveur de leur mise à jour en sources synchrotrons de quatrième génération, posant la question de savoir si certaines des structures aujourd’hui résolues dans les XFEL ou les microscopes électroniques pourraient un jour être résolues par cristallographie sérielle au synchrotron (SSX). Spécifiquement, c’est la SSX basée sur l’utilisation d’un nano-faisceau de rayons-X (nano-SSX) qui doit être interrogée, pour des cristaux nanocristaux.En vue d’évaluer les avantages et limites de chacune de ces méthodes, nous avons au cours de cette thèse comparé leur performance en utilisant comme échantillons modèles des nanocristaux provenant de toxines recombinantes produites in vivo par la bactérie Bacillus thuringiensis (Bt).Dans ce contexte, nous nous sommes intéressés à des protéines naturellement cristallines dont les structures avaient préalablement été déterminées à haute résolution par SFX. Nos expériences ont démontré la faisabilité de collecter des données de diffraction à partir de nanocristaux par nano-SSX. La résolution des données est actuellement trop basse pour autoriser une détermination de structure, cette méthode présente des perspectives d’amélioration en termes de méthode et de temps d’acquisition des données. Pour la SED, nos recherches ont montré la pertinence de la méthode pour collecter des données à haute résolution à partir de nanocristaux de protéines. Toutefois, en raison de problèmes inhérents au microscope et à sa correction imparfaite des aberrations, l’indexation des données a été contrariée, expliquant qu’aucune détermination de structure n’ait été possible. Grâce à la Micro-ED, nous avons pu déterminer la structure de la toxine Cry11Aa (Bt sv israelensis) à partir de beaucoup moins de nanocristaux recombinants produits in vivo, mais à des résolutions et complétudes plus basses que celles obtenues par SFX. Ainsi, nos études confortent l’hypothèse selon laquelle la SFX est la méthode phare pour déterminer de nouvelles structures macromoléculaires à partir de nanocristaux. C’est ainsi cette méthode que nous avons choisie pour étudier des souches naturelles de Bt et vérifier la conservation de la structure et le repliement de ses protéines naturellement cristallines lors de l’expression et de la cristallisation recombinante dans des souches acrystallifères de Bt. Nos structures naturelles des toxines Cry11Ba (Bt sv jegathesan), Cry11Aa et Cyt1Aa (Bt sv israelensis) démontrent que les structures et leurs repliements précédemment résolus et rapportés sont corrects, mais aussi qu’il est désormais possible de ne pas recourir à l’expression recombinante pour obtenir des structures à partir des cristaux de Bt. De plus, nous avons pu déterminer, à haute résolution, les structures inédites des toxines Cyt2Bb (Bt sv jegathesan) et Cry26Aa (Bt sv finitimus) à partir des souches naturelles. Enfin, nous avons investigué les moyens par lesquels la consommation d’échantillon pourrait être réduite en SFX, notamment une nouvelle méthode de purification des nanocristaux et leur présentation par un jet visqueux.Until 2011 it was necessary to use submillimeter-sized crystals (~50-100 µm) to solvemacromolecular structures at atomic resolution, but nowadays samples within the micro- ornanometer size range can be used. This paradigm shift has been made possible by the advent of serial diffraction methods, notably with the implementation of Serial FemtosecondCrystallography (SFX) in X-ray Free Electron Laser (XFEL) facilities. Parallelly, theexploitation of the strong interactions between electrons and matter enables useful diffractiondata to be obtained from nanocrystals presented to an electron beam in a cryogenicenvironment. The benefits of the serial approach have been demonstrated for electrondiffraction (serial electron diffraction), but the number of samples so far studied usingthis method remains marginal. At the same time, most synchrotrons have seen their brightness increase by two orders of magnitude, as they are upgraded to fourth-generation synchrotron sources, raising the question as to whether or not some of the structures currently resolved in XFELs or electron microscopes could one day be resolved by Serial Synchrotron crystallography (SSX). Specifically, it is SSX using X-ray nano-beams (nano-SSX) that needs to be interrogated for micro- and nanometer-sized crystals. The aim of my thesis was to assess the advantages and limitations of each method using as a proxy the diffraction signal from naturally-occurring nanocrystals of the bacterium Bacillus thuringiensis (Bt). In this context,I focused on naturally-crystalline proteins whose structures had previously been determined at high resolution by SFX (Cry11Aa, Cry11Ba, Cyt1Aa). We could demonstrate the feasibility of collecting diffraction data from nanocrystals using nano-SSX. Although the resolution of the data is currently too low to allow for structure determination, this method offers prospects for improvement in terms of data collection approaches, which could enable us to overcome its weaknesses in the future. With regards to SED, our research demonstrates the suitability of such a method for collecting high-resolution data from protein nanocrystals. However, due to problems inherent in the microscope and its imperfect correction of aberrations introduced into the electron path, data indexing was thwarted, explaining that no structure determination was in the end achieved with this technique. Using Micro-ED, we were able to determine the structure of the Cry11Aa toxin (Bacillus thuringiensis sv israelensis) from far fewer recombinant nanocrystals produced in vivo, but at lower resolution and completeness than those obtained by SFX. Our studies thus support the notion that SFX is the leading method fordetermining new macromolecular structures from nanocrystals. Accordingly, this is the method that we retained in our study on natural strains of Bt, where we sought to verify whether or not the structure and packing of Bt naturally crystalline proteins is influenced by the cellular that we retained in our study on natural strains of Bt, where we sought to verify whether or not the structure and packing of Bt naturally crystalline proteins is influenced by the cellular context.Our 'natural' structures of the Cry11Ba (Bacillus thuringiensis sv jegathesan), Cry11Aa, and Cyt1Aa (Bacillus thuringiensis sv israelensis) toxins demonstrate not only that their previously reported structures and packing are correct, but as well that structures of naturally-crystalline Bt proteins can now be solved without resorting to recombinant expression in an acrystalliferous strain. For example, we were able to determine, at high resolution and from the natural strains, the previously unknown structures of the toxinsCyt2Bb (Bacillus thuringiensis sv jegathesan) and Cry26Aa (Bacillus thuringiensis sv finitimus). Finally, we investigated ways in which sample consumption could be reduced in SFX, including a new method for purifying nanocrystals and presenting them in a viscous jet
Structural insights into the photoactivation and recovery of the Orange Carotenoid Protein obtained by time-resolved X-ray scattering and crystallography
No full textL’Orange Caroténoïde Protéine (OCP) est une protéine à deux domaines stabilisés par la présence d’un pigment kéto-caroténoïde à leur interface. Chez la cyanobactérie, l’OCP joue un rôle de photoprotection, et est capable de se lier aux antennes collectrices de lumière, i.e. les phycobilisomes (PBS) et dissiper l’excès d’énergie collectée sous forme de chaleur. Pour exercer sa fonction de photoprotection la protéine doit être photoactivée, par absorption d’unphoton bleu-vert, ce qui déclenche sa transition d’un état orange inactif (OCPO) vers un état rouge photoactif (OCPR). Le mécanisme de photoactivation s’étend sur 13 échelles de temps et implique des changements structuraux au sein du caroténoïde et de la matrice protéique.En vue d’investiguer ces changements, au cours de ma thèse j’ai étudié le mécanisme de photoactivation d’OCP en utilisant diverses méthodes de biochimie et de la biologie structurale. Tout d’abord, en combinant la spectroscopie et la diffusion des rayons X en mode stationnaire et résolue en temps (TR), nous avons investigué les réarrangements conformationnels à grande échelle impliqués dans la photoactivation et le retour thermique de l’OCP. Nous avons démontré que l’OCPO et l’OCPR peuvent oligomériser, et que les processus d’oligomérisation participent à la régulation du photocycle de la protéine. Deuxièmement, en utilisant lacristallographie aux rayons X, nous avons déterminé la structure de l’OCP synthétisé chez la cyanobacterie Planktothrix agardhii, auparavant non caractérisée. Notre analyse a renseigné sur comment la flexibilité structurale de cette variante influence son activité d’extinction d’énergie, ainsi que sa vitesse de photoactivation et relaxation. En utilisant la cristallographie résolue en temps, nous avons caractérisé les premières étapes de photoactivation de l’OCP. Nous avons utilisé des méthodes de cristallisation in vitro et in vivo pour produire des cristauxOCP de taille nanométrique. Nous avons investigué la cristallisation in vivo dans la bactérie Bacillus thuringiensis (Bt), à dessein d’obtenir des cristaux de fusion de l’OCP avec deux toxines de Bt naturellement cristallines, la Cyt1Aa et la Cry11Aa. En termes de production de cristaux d’OCP, ce travail a été sans succès, néanmoins il a permis d’étudier la structure et la cascade de bioactivation de ces deux toxines, ainsi que d’élucider les mécanismes moléculaires qui sont à la base de leur cristallisation in vivo.The Orange Carotenoid Protein (OCP), involved in energy-quenching of the cyanobacterial light-harvesting antennae, is a two-domain protein functionalized by a non-covalently bound keto-carotenoid. To elicit its photoprotection function, the protein must be photoactivated by a blue-green photon, triggering transition from an orange inactive “dark” state (OCPO) to a red photoactive “light” state (OCPR). The photoactivation mechanism, which spans 13 decades in time, involves structural rearrangements at the level of both the photoexcited carotenoid and the protein scaffold. During my thesis, I investigated rhe OCP photoactivation mechanism using variety of biochemistry and structural biology methods.Firstly, through combination of spectroscopy and steady-state and time-resolved (TR) X-ray scattering, we examined the large-scale motions involved in the photoactivation and recovery of OCP. We demonstrated that oligomerization occurs at both the OCPO and OCPR level, and that it partakes in the regulation of the protein photoactivation and thermal recovery. Secondly, by using conventional X-ray crystallography, we determined the previously-uncharacterized crystal structure of Planktothrix aghardii OCP. Structural analysis pointed to the influence of protein flexibility on the photoactivation and recovery rates, and on the energy-quenching activity of this variant. In an effort to characterize early stages of OCP photoactivation by means of TR crystallography, we investigated in vitro and in vivo crystallization methods to produce sub-micron-sized OCP crystals. Specifically, we attempted in vivo crystallization in the crystalliferous bacterium Bacillus thuringiensis (Bt), endeavoring to obtain crystals of fusions of OCP with Cyt1Aa and Cry11Aa Bt toxins. While unsuccessful in terms of production of OCP crystals, this work enabled to shed light on the structure and bioactivation cascade of the two toxins, and to investigate the molecular mechanisms at the basis of their crystallization
Implication of porins in the genesis and scaffolding of Providencia stuartii's biofilm
No full textLes biofilms, communautés multicellulaires bactériennes, sont omniprésents. Malgré leur importance pour l’écosystème, ils présentent une menace pour l'industrie autant que pour la santé humaine. La virulence des biofilms procède surtout de leur résistance élevée aux antibiotiques, qui rend leur éradication quasiment impossible. Ainsi, les biofilms sont impliqués dans la plupart des infections bactériennes chroniques, causant chaque année plus de 4000 décès en France. P. stuartii est une bactérie connue pour sa capacité à former des biofilms dans le tractus urinaire humain. Elle est responsable de 10% des INU chroniques et est décrite comme étant la plus résistante de son genre. Malgré ces faits, les études menées sur cette bactérie sont rares, freinant la compréhension du mécanisme de développement et de résistance de ses biofilms et compliquant ainsi l’avancement de nouvelles thérapies pour lutter, prévenir ou éradiquer ces infections. P. stuartii exprime au niveau de sa membrane externe deux porines, Omp-Pst1 et Omp-Pst2, qui constituent 70% du contenu protéique membranaire. Ces porines sont le conduit principal permettant à la bactérie de communiquer et d’échanger avec son milieu environnant. Ainsi, les porines sont vitales pour la bactérie.A ce jour, trois publications sont disponibles qui traitent de ces deux porines, mais aucune n’a exploré leur influence sur la formation des biofilms bactériens. Les travaux effectués au cours de ma thèse ont ainsi visé à réduire le manque de connaissance sur les biofilms de P. stuartii et à dévoiler le rôle des porines dans l’établissement et la résistance de ces biofilms. Pour cela, nous avons segmenté notre travail en quatre parties ayant pour objectifs (1) de comprendre la formation des biofilms de P. stuartii et leur réponse aux stress du milieu environnant ; (2) de décrire l’effet de la suppression ou la surexpression des porines ; (3) d’étudier à l’échelle moléculaire et atomique le comportement des porines isolées ; et (4) de développer des outils pour étudier les porines à l’échelle moléculaire au sein d’un biofilm de P. stuartii.Biofilms, bacterial multicellular communities, are ubiquitous. Despite their importance to the ecosystem, they pose a threat to both industry and human health. The virulence of biofilms is mainly due to their high resistance to antibiotics, which makes their eradication virtually impossible. Thus, biofilms are involved in most chronic bacterial infections, causing each year more than 4,000 deaths in France. P. stuartii is a bacterium known for its ability to form biofilms in the human urinary tract. It is responsible for 10% of chronic nosocomial urinary infections and is described as the most resistant of its kind. Despite these facts, studies on this bacterium are rare, hampering the understanding of the mechanism of development and resistance of its biofilms and thus complicating the advancement of new therapies to fight, prevent or eradicate these infections. P. stuartii expresses at its outer membrane two porins, Omp-Pst1 and Omp-Pst2, which constitute 70% of the membrane protein content. These porins are the main conduit allowing the bacterium to communicate and exchange with its surrounding environment. Thus, porins are vital for the bacteria.To date, three publications are available that deal with these two porins, but none have explored their influence on the formation of bacterial biofilms. The work carried out during my thesis thus aimed to reduce the lack of knowledge about P. stuartii's biofilm and to unveil the role of porins in the establishment and resistance of these biofilms. For this, we have divided our work into four parts aiming at (1) understanding of P. stuartii's biofilms formation and their response to the stresses of the surrounding environment; (2) describing the effect of suppression or overexpression of porins; (3) studying the behavior of isolated porins on a molecular and atomic scale; and (4) developing tools for studying porins on a molecular scale within a biofilm of P. stuartii
Development of new strategies to fight biofilms of Providencia stuartii, a multi-resistant human pathogen
No full textLes biofilms bactériens, communautés multicellulaires adhérentes à une surface et enrobées d’une matrice extracellulaire, sont cruciaux pour le maintien de la plupart des écosystèmes de notre planète mais représentent également une menace pour la santé humaine. Leur éradication est un véritable défi pour la microbiologie moderne du fait de leur résistance élevée aux antibiotiques. Providencia stuartii est une bactérie Gram-négative connue pour sa forte capacité à former des biofilms dans le tractus urinaire humain, qui est responsable pour environ 10% des infections nosocomiales urinaires chroniques. Nous avons montré que cette souche bactérienne exploite un moyen de socialisation supplémentaire préalable à l’adhésion des cellules aux surfaces et la sécrétion d’une matrice extracellulaire, les communautés flottantes. Les deux porines de P. stuartii, Omp-Pst1 et Omp-Pst2, soutiennent la formation des communautés flottantes en s’auto-associant à travers leurs boucles extracellulaires pour former des dimères de trimères (DOTs) intercellulaires. La formation des DOTs, rivetant les cellules adjacentes entre elles, est médiée par des forces électrostatiques et des interactions de type steric zipper.Les deux grands objectifs de la thèse ont été i) de caractériser les impacts environnementaux sur l’établissement et la survie des deux types de communautés formés par P. stuartii, et ii) d’empêcher la socialisation bactérienne par inhibition des DOTs de porines. Nos résultats ont montrés que des peptides mimant les résidus impliqués dans les interactions de type stérique zipper des DOTs de porines, et couplés à de la coumarine, sont prometteurs pour diagnostiquer les infections à P. stuartii. De plus, nous avons mis en avant qu’une combinaison d’antibiotiques avec certains de ces peptides est une nouvelle approche thérapeutique envisageable pour lutter contre les infections de P. stuartii. Nos résultats montrent aussi que les futurs traitements devraient être évalués sur les communautés flottantes et les biofilms adhérents, dans des conditions imitant les voies urinaires, afin d’être efficaces et potentiellement éradiquer P. stuartii.Bacterial biofilms are multicellular communities adherent to surfaces and surrounded by an extracellular matrix. They are crucial for maintaining most of our planet’s ecosystems, but also a threat to human health. Biofilm eradication is one of the greatest challenges of modern microbiology due to their high resistance to antibiotics. In this PhD, we focused on Providencia stuartii, a Gram-negative pathogen that forms biofilms in the human urinary tract and is responsible for about 10% of hospital-acquired urinary tract infections. P. stuartii exploits an additional means of socialization, forming floating communities of cells (FCCs), that later sediment and adhere onto surfaces yielding surface-attached biofilms (SABs). The two porins of P. stuartii, Omp-Pst1 and Omp-Pst2, are involved in FCC formation by self-association into intercellular dimers of trimers (DOTs). The main driving force behind DOT formation is electrostatic attraction, yet the DOT structure is locked-in by steric zipper interactions between facing extracellular loops.The two main objectives of this PhD were (i) to characterize the environmental impacts on the establishment and survival of the two type of socialized communities formed by P. stuartii, and (ii) to inhibit bacterial socialization by targeting porin DOTs. Our results reveal that peptides featuring residues involved in the steric zipper interaction of DOTs, and coupled with coumarin, are promising lead compound to diagnose P. stuartii infections. In addition, we tested combinations of antibiotics with some of these peptides and results suggest that is was a new therapeutic approach that can be envisaged to fight against P. stuartii infections. Future treatments should be evaluated on FCCs and SABs in conditions mimicking urinary tract, to be efficient and potentially eradicate P. stuartii
Time-resolved X-ray crystallography of the vitamin B12-dependent CarH photoreceptor
No full textLes recherches effectuées durant cette thèse ont visé l’élucidation du mécanisme de photoactivation d’un photorécepteur fonctionnalisé par un dérivé de la vitamine B12 (adénosylcobalamine, AdoCbl) en utilisant une approche intégrative de dynamique structurale. Spécifiquement, nos travaux ont porté sur le photorécepteur CarH de la bacterie Thermus thermophilus (TtCBD), dont la fonction est de réguler l’expression de l’opéron CarB, codant pour un ensemble de gènes permettant la synthèse de caroténoides. Ces caroténoïdes participent à la lutte contre les dommages causés par les radiations lumineuses. Dans l’obscurité, le photorécepteur CarH est présent sous la forme d’un tétramère qui se lie au promoteur dudit opéron, empêchant ainsi la transcription de CarB. Sous l’effet de l’exposition à la lumière, ce tétramère se dissocie permettant ainsi la transcription de CarB. Nous nous sommes concentrés durant cette thèse sur le domaine de liaison à l’adénosylcobalamine, ce dernier récapitulant l’ensemble de la photophysique du récepteur entier, tout en permettant d’obtenir des cristaux diffractant à plus haute résolution.Afin de déterminer les changements structuraux photoinduits au sein de TtCBD en temps réel, nous avons utilisé la cristallographie aux rayons X, et plus particulièrement la cristallographie sérielle résolue en temps à l’échelle de la femtoseconde (ou time-resolved serial femtosecond crystallography, TR-SFX) comme principale méthode d’étude. Les recherches effectuées durant cette thèse ont permis de dépasser certains défis majeurs de cette technique, en refondant l’ensemble de la méthodologie, de la préparation des échantillons jusqu’à la collecte et le traitement des données. Notamment, nos travaux ont permis le développement de protocoles standardisés pour l'obtention de microcristaux de TtCBD et leur présentation au faisceau de rayons X par le biais de supports solides (ou fixed targets) ou de micro-injecteurs (high viscosity extruder, ou HVE ; gas dynamic virtual nozzle, ou GDVN). Plusieurs campagnes de collectes de données de diffraction ont été réalisées, soit au sein du synchrotron européen (ESRF), pour les expériences de cristallographie non résolue dans le temps, soit au sein de lasers à électrons libres X (ou XFELs) pour les expériences de cristallographie résolue dans le temps (SACLA, LCLS, EuXFEL et SwissFEL). Afin de mieux comprendre la photoactivation de CarH, nous avons en sus réalisé avec notre consortium (IBS, ESRF, Université de Manchester, Université de Louisville) des expériences complémentaires de diffusion des rayons X résolue dans le temps (time-resolved solution scattering, de spectroscopie d'absorption transitoire (transient absorption spectroscopy) et des calculs de prédiction de structures à l’état excité, grâce à la QM/MM. En combinant l’ensemble de ces informations, nous avons pu caractériser la séquence d’évènements chimiques et structuraux qui permettent, en suite de l’absorption du photon actinique, la dissociation du tétramère de CarH sur une échelle de temps allant de la nanoseconde jusqu’à la seconde.Parallèment nous avons, dans le contexte de nos précaractérisations, testé, caractérisé et démontré la possible utilisation d’un nouvel hydrogel, dérivé de la guanisine, pour des injecteurs HVE. Certains paramètres, tel que sa viscosité, sa capacité à former un jet stable et sa relative inoffensivité pour les microcristaux de protéines ont été étudiés. Le potentiel de cet hydrogel pour de futures études de (TR)-SFX a été montré en utilisant des cristaux de lysozyme.The research performed in this thesis seeks primarily to elucidate the mechanism of B12 photoreceptors by using an integrated structural-dynamic and kinetic approach. The main system studied in this work is the CarH photoreceptor. CarH is a gene regulator photoreceptor that binds to operator DNA in bacteria in a tetrameric complex to inhibit gene expression. The suppressed gene controls carotenoid production that protects bacteria from sunlight radiation damage. The tetramer is stable in dark conditions and dissociates when it is exposed to light. The monomerization leads to a dissociation from the DNA, therefore allowing gene transcription to occur. The CarH photoreceptor hosts a B12 derivative chromophore (AdoCbl) which senses light, thus regulating gene expression. We focused on the chromophore binding domain (TtCBD) of the Thermus thermophilus CarH. We employed X-ray crystallography, specifically time-resolved serial femtosecond crystallography (TR-SFX) as the main technique, for studying structural changes in TtCBD in real time. This thesis addresses key challenges and enhances methodologies across the entire experimental workflow for TR-SFX experiments, from sample preparation to data collection and processing. We report on the development of standardized protocols for obtaining seeded TtCBD microcrystals. We investigated and optimized different media (cellulose, lipidic cubic phase, grease) and methods for injecting and delivering microcrystals (high viscosity extruders, gas dynamic virtual nozzles, and fixed targets) while preserving their quality and photosensitivity. In terms of data collection, the thesis involves conducting static experiments at the ESRF synchrotron using macrocrystals of TtCBD and performing time-resolved experiments at various XFEL facilities (SACLA, LCLS, EuXFEL and SwissFEL). To further understand CarH photoactivation we have employed different techniques in collaboration, such as time-resolved solution scattering, transient absorption spectroscopy, and QM/MM calculations. We have elucidated structural and chemical changes following photon absorption up to tetramer dissociation on the ns to s timescale.In the last part of this thesis, we introduce and characterize a novel viscous medium for high-viscosity extrusion (HVE) injection, based on guanosine derivatives hydrogels. Guanosine and guanosine-5’-monophosphate self-assemble into G-quartets, forming three-dimensional G-quadruplexes (G4) that create stable, viscous hydrogels with up to 99% water content. Our research focused on utilizing G4 hydrogels as a crystal-carrier matrix for SFX experiments. We investigated the hydrogel's viscosity, jet generation, stability with protein crystallants, and ability to preserve microcrystals and enable photoactivation. We compared the G4 hydrogel’s X-ray background scattering at the ESRF ID29 beamline with other known media. Finally, we tested diffraction using this carrier medium with lysozyme microcrystals at SACLA, proving that we can obtain meaningful crystallographic data revealing the hydrogel's effectiveness, highlighting its potential TR- SFX studies.This thesis is part of a collaborative consortium involving laboratories from IBS Grenoble, the ESRF, the University of Manchester, and the University of Louisville
MICRO- ET NANO-CRISTALLOGRAPHIE : OPPORTUNITÉS COURANTES ET FUTURES EN CRISTALLOGRAPHIE MACROMOLÉCULAIRE
No full textMICRO- ET NANO-CRISTALLOGRAPHIE : OPPORTUNITÉS COURANTES ET FUTURES EN CRISTALLOGRAPHIE MACROMOLÉCULAIRE
No full textEtude des relations structure-dynamique-fonction au sein de l`acetylcholinesterase
No full textAcetylcholinesterase is a very rapid enzyme, essential in the process of nerve impulse transmission at cholinergic synapses. It is the target of all currently approved anti-Alzheimer drugs and further progress in the modulation of its activity requires structural as well as dynamical information. Here we report three experimental approaches that allowed to gain structural insight into the dynamics of acetylcholinesterase. First, the structure of its complex with a putative secondgeneration anti-Alzheimer drug is presented. Next, a steady-state approach for determining atomic-resolution structures of enzyme/substrate complexes is detailed, which permitted to structurally follow the traffic of substrates within the active site of the acetylcholinesterase. Lastly, a new kinetic-crystallography strategy is described, in which UV-laser induced cleavage of a photolabile precursor of the enzymatic product is combined with temperaturecontrolled X-ray crystallography, in order to enable the molecular motions necessary for the expulsion of photolysis products to occur. Taken together, the results described herein permit a detailed description of the traffic of substrates and products within acetylcholinesterase, and provide insights into its conformational energy landscape.L'acétylcholinestérase est une enzyme très rapide, essentielle à la neurotransmission cholinergique. Elle est la cible de toutes les molécules actuellement utilisées dans le traitement de la maladie d'Alzheimer, et les progrès à venir dans la modulation de son activité réclament une connaissance plus fine de sa structure et de sa dynamique. Dans cette thèse, nous décrivons trois approches expérimentales ayant permis d'obtenir des informations structurales sur la dynamique de l'acétylcholinestérase. Nous rapportons, dans un premier temps, la structure de cette enzyme en complexe avec un putatif médicament anti-Alzheimer de seconde génération. Nous décrivons, par ailleurs, une approche de mise à l'équilibre réactionnel de complexes enzyme/substrat cristallins, grâce à laquelle le trafic des substrats au sein de l'acétylcholinestérase a pu être suivi structuralement. Nous présentons, enfin, le développement d'une stratégie nouvelle en cristallographie cinétique des protéines, basée sur l'utilisation d'un précurseur photosensible du produit de réaction enzymatique, sa photolyse in-crystallo par le biais d'un laser, et l'application subséquente de profils de température adéquats afin de permettre la survenue des mouvements moléculaires nécessaires à l'expulsion des produits de photolyse. Prises conjointement, les différents résultats de cette thèse permettent une description détaillée du trafic des substrats et produits au sein de l'acétylcholinestérase, et fournissent un aperçu structural de son paysage conformationnel
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