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Effects of calcium availability on calmodulin level and on metabolic reactivation in early germination phases of radish seeds : ninth international workshop on plant membrane biology
No full textEFFECT' OF CALCIUM AVAILABILITY ON CALMODULIN LEVEL AND ON
METABOLIC REACTIVATION IN EARLY GERMINATION PHASES OF
RADISH SEEDS.
Cocucci. M. and Negrini. N.
Dipartimento di Fisiologia delle Piante coltivate e Chimica agraria. Facolta di agraria. Universita di
Milano. via Celoria 2. 20133 Milano. Italy.
Calcium and Calmodulin (CaM) control many physiological processes in plants. The
level of Ca2+-CaM complex can be modulated by the level of intracellular Ca2+ and also by the level
of CaM. CaM level appears to play an important role in the metabolic reactivation which characterizes
seed germination (1. 2. 3). In radish seeds Ca2+-CaM active complex is also modulated by the
presence of a proteinaceous inhibitor (1). Seed germination is also characterized by the reactivation of
membrane functions suggesting a precocious recovery of the control of ionic homeostasis. The fact that
Ca2+ in early germination was released into the medium (1) sugge~ts a high level of cytosolic Ca2+.
The reduction of Ca2+ availability during radish seed germination was obtained by
incubating the seeds in the presence of the Ca2+ chelator EGTA. The presence of EGTA inhibited
germination (measured as increase in fr. wt.) at concentrations higher than 1 mM. When Ca2+ was
administered together with EGTA. the inhibition was removed suggesting that the EGTA effect is due
to the reduction of Ca2+ availability. EGTA treatment decreased the level of free Ca2+ in the medium.
but the cation bound to EGTA increased; parallelly Ca2+ in the embryo axes decreased. At 1 mM
EGTA. the reduction of Ca2+ availability only slightly affected metabolic reactivation (measured as
RNA and DNA increases) and had no effect on membrane reactivation.
The level and specific activity of CaM in the soluble fraction of radish embryos strongly
increased in early germination phases (ca. +450%). 1 mM EGTA greatly reduced (ca.-50%) the
increases in level and specific activity of CaM. When the soluble fraction was analyzed on Sephadex
G75 column. CaM was eluted in several peaks at MW higher than 30 ill and in particular. at 36 kD.
CaM was co-eluted with the proteinaceus CaM inhibitor present in ungerminated seeds. CaM eluted in
this zone decreased in the seeds germinated in the presence of EGT A.
The decrease in ]eve] and specific activity of CaM was not accompanied by a decrease in
germination and metabolic reactivation when the seed germinate at Jow Ca2+ suggesting that the level
of the cation might control CaM increase and level. that the level of CaM could contribute to control
the level of cytosolic Ca2+ and that the Ca2+-CaM dependent activities could also be also controlled
by the presence of the CaM inhibitor.
1.
2.
3.
Cocucci. M. and Negrini. N. (1988) Plallt Physinl. 88.910- 914.
Cocucci. M. and Negrini. N. (1989) Plalll Membrane trallsport. Dainty 1. et al. eds. pp
355- 360.
Cocucci, M. and Negrini. N. (1991)Physiol. Plalll. 82.143- 149.
I
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Reactivation on membrane activity from germinated and ungerminated radish seeds
No full textReactivation by polar lipidis of membrane ATPase activity from germinated and ungerminated radish seeds. M. COCUCCI. Centro di Studio del C.N.R. per la Biologia Cellulare e Molecolare
delle Pi ante Istituto di Scienze Botaniche Universita di Milano. The early phases of germination of radish (Raphanus saf;vus L.) seed are cha racterized by the activation of plasmamembrane functions such as K + uptake. acid secretion, transitory increase of negati ve transmembrane potential. T here is evidence suggesting that these functions may depend, in this and in other materials, on the acti vity of a Mg++ , K+ activa ted, dicycJohexylcarbodiimide-sensitive plasmamembrane ATPase. This ATPa ~e activity increases in the membrane fraction in the fi rst 23h of germination (+ 300%).
The removal of polar lipids from membrane preparations by cholate treatment almost completely suppreses the ATPase activity. The subsequent addition of polar Lip ids from radish seeds reconstitutes the ATPase activity. Polar lipids from germinated seeds are more active than that from ungerminated seeds. This data suggest that variation of polar lipids composition of the membrane, during early phases of germination. may be an important factor in determining the rise in ATPase activity duri ng early phases of germination
Growth inhibition without ATP decrease in Rhodotorula gracilis coltured under reduced oxygen pressure
No full textIn Rhodotorula gracilis ccultured in liquid medium, growth (as protein accumulation) is progressively inhibited when pO2 is lowered from 3 mm Hg (in the liquid medium) to zero.
Half-maximum growth is observed at a pO2 value of 2 mm Hg. Under this condition the rate of incorporation of labelled leucine into protein is about halved. The inhibition of leucine incorporatedn below pO2 is almost immediate and remains quantitavively unchanged for almost 30 min after the shift. In contrast, no changes in the ATP, ADP and AMP levels are observed during the shift and in following 10 min; only in the period from 10 to 45 min after the shift ADP and AMP progressive y increase.
These results are interpreted as indicating that the inhibition of protein synthesis and growth by O2 shortage under the experimental condition investigated does not depend on changes in the phosphorylation state of the adenosine phosphate syttem, thus suggesting that some other system able to react to pO2 changes is involved in the response of the biosynthesis processes to O2 deficiency
Il Contributo della biologia vegetale nella salvaguardia dell'ambiente e della produzione: aspetti biochimici e fisiologici
No full textModello in vitro per lo studio dello sviluppo e delle caratteristiche fitochimiche dei noduli fogliari di Hypericum perforatum L.
No full textHypericum perforatum L. (erba di S. Giovanni) è una pianta officinale appartenente alla famiglia delle Clusiaceae, spontanea in Europa, Asia, Nord Africa e naturalizzata in Nord America e Australia. E’ una pianta erbacea perenne, alta 25-60 cm, possiede fiori gialli a cinque petali e foglie opposte, che viste in trasparenza, danno l’impressione di essere perforate, poiché dotate di numerose tasche traslucide di natura schizogena. L’Hypericum perforatum, oltre a ghiandole traslucide e canali di secrezione presenti su foglie e fiori contenenti olii essenziali, possiede anche noduli ghiandolari diffusi su foglie, petali, fusto e stami (1). Tali strutture, presenti per lo più lungo i margini fogliari, hanno differenti stadi di sviluppo; infatti si distinguono noduli allo stadio giovanile, di colore rosa, che virano verso un colore rosso scuro-nero a maturità assumendo un aspetto rigonfio e un diametro di circa 0,1 mm (2-3).
La maggior parte degli studi condotti e pubblicati su questa pianta riguarda le modalità di azione dei principi attivi ritenuti responsabili dell’azione farmacologica, mentre sono tuttora scarse le conoscenze relative alla biosintesi e all’accumulo di tali molecole nei tessuti della pianta. Fra i principi attivi contenuti in H. perforatum vi sono i naftodiantroni ipericina, pseudoipericina e derivati, che determinano il titolo dell’estratto commerciale e l’iperforina, un derivato del floroglucinolo; sono inoltre presenti metaboliti secondari più comuni come flavonoidi, xantoni, terpeni e olii essenziali (4). L’ipericina e le sostanze ipericino-simili sono fotodinamiche e la loro biosintesi è connessa con la morfogenesi e lo sviluppo dei noduli rosso scuro-neri. Tradizionalmente, le ipericine sono state considerate le principali responsabili delle proprietà antidepressive di H. perforatum. Tuttavia, da poco il loro ruolo è diventato secondario, sopravanzato da quello della iperforina, che studi più recenti indicano come l’autentica, anche se non l’unica, sostanza antidepressiva della droga. Inoltre sono oggetto di studio l’attività inibitoria dell’Iperico nei confronti di alcuni retrovirus (HIV) e quella citotossica verso alcune forme tumorali (5).
In questo lavoro si è valutata la sintesi e l’accumulo di principi attivi quali ipericina, pseudoipericina e iperforina in un modello sperimentale in vitro di Hypericum perforatum. Gli obiettivi erano:
- indagare le caratteristiche fitochimiche e istologiche dei noduli fogliari di H. perforatum presenti nel modello in vitro mettendole a confronto con analoghe strutture presenti nelle foglie in vivo.
La presenza di ipericine per lo più all’interno dei noduli è stata dimostrata con l’analisi all’HPLC su campioni di foglie provenienti da colture idroponiche; infatti, all’interno dei noduli è stato localizzato l’96% delle ipericine, mentre nel tessuto fogliare extra nodulare solo il restante 4 %.
Nelle colture in vitro si è verificato il differenziamento di strutture nodulari che mostrano gli stessi stadi di sviluppo dei noduli fogliari, almeno all’osservazione al microscopio stereoscopico e fino a 40 gg. dalla semina. Dopo i 40 gg. non sono più visibili i classici noduli, mentre si possono solo osservare degli ammassi cellulari rosso-vivo che sembrano non possedere una struttura ben organizzata. Inoltre, il numero e lo sviluppo dei noduli stessi appaiono influenzati dalla luce; infatti i noduli differenziati nel callo cresciuto al buio sono meno numerosi e si trovano soltanto allo stadio iniziale di sviluppo (stadio giovanile). La presenza di ipericina e pseudoipericina è stata confermata dalle analisi con HPLC di estratti ottenuti dai calli. L’iperforina è stata trovata in tutte le colture cellulari alla luce , ma mai in quelle al buio.
L’indagine ultrastrutturale dei noduli provenienti dai modelli in vivo e in vitro ha condotto alle seguenti osservazioni: i noduli delle foglie sono strutture cellularizzate contenenti al loro interno la secrezione. Essi sono formati da una fascia periferica di cellule appiattite e una zona centrale di cellule isodiametriche. Nei noduli giovani, in entrambi i tipi di cellule, sono evidenti organuli ben strutturati e si riscontra la presenza di vescicole contenenti materiale elettrondenso disposte nello spazio periplasmatico, alle estremità tra le cellule e lungo le pareti cellulari. Durante lo sviluppo del nodulo si assiste ad un ispessimento della parete delle cellule che lo compongono, accompagnato dalla degenerazione degli organuli cellulari. In questo stadio le cellule del nodulo rimangono intatte e non formano nessun lume; infatti non appare nessuna cavità ghiandolare, ma il materiale si accumula progressivamente nello spazio intracellulare che risulta, quindi, pieno di materiale elettrondenso. Nella parete cellulare del nodulo maturo non è presente nessuna sostanza osmiofilica, come suberina o lignina (6). Analogamente al nodulo fogliare, il nodulo prelevato dalla coltura in vitro alla luce e ad uno stadio avanzato dello sviluppo (stadio maturo) possiede delle cellule più esterne che circondano quelle interne. Le cellule esterne sono caratterizzate dalla presenza di grandi vacuoli che non mostrano inclusi; il citoplasma e gli organuli sono poco riconoscibili per la notevole presenza di materiale elettrondenso. Le cellule più interne, invece, non mostrano differenze dalle altre cellule del callo: sono ben strutturate e possiedono grandi vacuoli, che anche in questo caso sono privi di inclusi.
Dai risultati ottenuti si può affermare che, nonostante nei noduli fogliari sia presente la maggior parte delle ipericine, queste sono state trovate anche nel mesofillo, con una ripartizione tale da far ipotizzare una sintesi nodulare e un successivo trasporto o diffusione extra nodulare dei principi attivi suddetti.
Il modello in vitro messo a punto si presta ad indagini relative alla sintesi e all’accumulo di questi metaboliti secondari, oltre allo studio del differenziamento delle strutture nodulari. Inoltre nelle colture cellulari, la luce è un fattore che influisce notevolmente sia sul differenziamento dei noduli sia sulla sintesi di iperforina.
BIBLIOGRAFIA
1. Capasso R., De Pasquale G., Grandolini, Mascolo, 2000 – Farmacognosia – ed. Springer. Cap. 2, pag.: 17-26.
2. Curtis J.D. & Lersten N.R., 1980 – Internal secretory structure in Hypericum (Clusiaceae): H. perforatum L. and H. Balearicum L. – New Phytol. 114: 571-58
3. Giorgi A. , Ferrario M., Onelli E., Rivetta A., Patrignani G., Cocucci M.: “Localizzazione dei naftodiantroni ipericina e pseudoipericina nelle foglie di Hypericum perforatum L. e variazione dei loro livelli durante lo sviluppo dei noduli fogliari” Convegno SIGA, SOI, ISF, Sanremo, 21 marzo 2002
4. Nahrstedt A., Butterweck V., 1997 – Biologically active and other chemical constutuents of the herb of Hypericum perforatum L. – Pharnacopsychiat. 30 (Supplement), pag.: 129-134.
5. Lavie G., Valentine F., Levin B., Mazur Y., Gallo G., Lavie D., Weiner D., Meruelo D., 1989 – Studies of the mechanisms of action of antiretroviral agents hypericin and pseudohypericin – Medical Sciences Vol. 86, pag.: 5963-5967.
6. E. Onelli, A. Rivetta, A. Giorgi, M. Cocucci, G. Patrignani, 2002 - Ultrastructural studies on the developing secretory nodules of Hypericum perforatum. Flora 197, 92-10
Sviluppo della coltivazione delle piante officinali: un esempio di valorizzazione del territorio montano
No full textChanges of the main cells costituents during the growth of Rhodotorula gracilis coltured in liquid medium
No full text
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