345 research outputs found
In search of second generation HIV integrase inhibitors; targeting integration beyond strand transfer
No full textHighly active antiretroviral therapy combines antiviral drugs targeting different steps in the HIV replication cycle in order to reduce viral loads in patients to undetectable levels. Since HIV readily develops resistance and can therefore escape the action of existing drugs, novel drugs with novel mechanisms of action must be developed. The integration of the viral genome into the human genome is an essential and critical replication step that is catalyzed by the viral integrase with the help of cellular cofactors. Although HIV-1 integrase has been studied for more than two decades, the first integrase inhibitor, raltegravir, was only recently approved for clinical use. A second compound, elvitegravir, is currently in advanced clinical trials. Both drugs interfere with the strand-transfer reaction of integrase. Due to the complexity and multistep nature of the integration reaction, several other functions of integrase can be exploited for drug discovery. In this review, we will describe these alternative strategies to inhibit integration. They have recently attracted considerable interest for the development of second-generation integrase inhibitors.sponsorship: Support was provided by the Research Fund of the University of Leuven (IDO/06/006). Arnoud Voet is supported by a fellowship from the Institute for the Promotion of Innovation through Science and Technology in Flanders (IWT-Vlaanderen). Frauke Christ is funded by an IOF (Industrial Research Fund) mandate of the KU Leuven. The authors have no other relevant affiliations or financial involvement with any organization or entity with a financial interest in or financial conflict with the subject matter or materials discussed in the manuscript. This includes employment, consultancies, honoraria, stock ownership or options, expert testimony, grants or patents received or pending, or royalties. (University of Leuven|IDO/06/006, Institute for the Promotion of Innovation through Science and Technology in Flanders (IWT-Vlaanderen), IOF (Industrial Research Fund))status: Publishe
Transportin-SR2 en HIV-1: de weg naar de nucleus
No full textHet humaan immuundeficiëntievirus (HIV) is de oorzaak van het verworven immuundeficiëntiesyndroom (AIDS). Sinds de ontdekking van HIV in 1981 zijn er meer dan 25 miljoen mensen gestorven aan AIDS. Aan het einde van 2008 leefden er naar schatting 33.4 miljoen mensen wereldwijd met AIDS en vonden naar schatting 2.7 miljoen nieuwe infecties plaats. Afrika alleen heeft 14 miljoen weeskinderen ten gevolge van AIDS. De huidige HIV therapie is een combinatietherapie van middelen die verschillende stappen in de virale replicatiecyclus als doelwit hebben. Deze stappen zijn het binnendringen in de doelwitcel, reverse transcriptie van het virale RNA genoom, de integratie van het provirale DNA in het chromatine van de gastheercel, en de proteolytische klieving van virale polyproteïnen tijdens de maturatie van virale partikels. Combinatietherapie is in staat om de virale replicatie in geïnfecteerde personen te controleren tot onder het niveau van detectie. Echter, het ontstaan van multiresistente virale stammen dwingt ons tot het voortzetten van het onderzoek naar nieuwe antivirale moleculen en doelwitten. Bovendien hebben 9.5 miljoen mensen in ontwikkelingslanden dringend levensreddende antiretrovirale therapie nodig, maar krijgen momenteel maar 4 miljoen mensen antivirale middelen toegediend. Bovendien veroorzaakt de dure, levenslange behandeling van HIV infecties met antivirale middelen ingrijpende neveneffecten. Daarom zijn wetenschappers genoodzaakt om veiligere en goedkopere antivirale middelen te ontwikkelen. Omwille van zijn beperkte genomische capaciteit interageert HIV met vele cellulaire eiwitten om te kunnen vermenigvuldigen. Deze interacties tussen virale en cellulaire eiwitten kunnen mogelijks nieuwe antivirale doelwitten vormen. Het gebruik van de interacties tussen virale en cellulaire factoren als antivirale doelwitten zou een hogere genetische barrière kunnen opwerpen tegen het ontstaan van virale resistentie aangezien het cellulaire deel van de interactie niet variabel is. Bovendien verkleint het gebruik van meerdere stappen van de HIV levenscyclus als doelwit de kans op het ontstaan van multiresistente HIV stammen. De potentiële cellulaire toxiciteit zou een nadeel kunnen zijn van deze benadering. Onze onderzoeksgroep is specifiek geïnteresseerd in de cellulaire cofactoren van het virale enzyme integrase (IN). Lens epithelium-derived growth factor/p75 (LEDGF/p75) is een voorbeeld van een cofactor van IN. In 2003 werd LEDGF/p75 ontdekt als een bindingspartner van IN, en nadien is LEDGF/p75 door verschillende onafhankelijke onderzoeksgroepen gevalideerd als een essentiële cofactor van HIV integratie en als een nieuw doelwit voor antiretrovirale therapie. Wij hebben recent een nieuwe klasse van antivirale moleculen gepubliceerd, de LEDGINS, die de eiwit-eiwit interactie tussen LEDGF/p75 en IN verbreken en een sterke antivirale activiteit vertonen in celcultuur. Deze verwezenlijking versterkt de algemene aanpak om eiwit-eiwit interacties tussen virale en cellulaire factoren te gebruiken als doelwitvoor antivirale therapie. In de algemene inleiding van deze thesis worden de cofactoren van HIV-1 IN besproken, met nadruk op LEDGF/p75 en de ontwikkeling van kleine moleculen als eiwit-eiwit interactie inhibitoren van de interactie tussen LEDGF/p75 en IN. Meer algemeen worden de problemen en uitdagingen beschreven van het onderzoek naar eiwit-eiwit interactie inhibitoren. Wij hebben dit thesisproject opgestart op zoek naar nieuwe cellulaire cofactoren van HIV-1 IN als nieuwe mogelijke antivirale doelwitten. Uit een yeast two-hybrid screen voor cellulaire bindingspartners van HIV-1 IN kwamen verscheidene kandidaten voort, waaronder het cellulaire importine transportine-SR2 (TRN‑SR2). Om een productieve infectie te bewerkstelligen moet het provirale HIV DNA, in een complex met verscheidene virale en cellulaire eiwitten dat het pre-integratiecomplex of PIC genoemd wordt, het nucleaire membraan binnendringen om het chromatine van de gastheercel in de celkern te bereiken, waar IN de stabiele integratie van het provirus in het cellulaire chromatine bewerkstelligt. Deze nucleaire import stap in de levenscyclus van HIV is lang onopgehelderd gebleven omdat er in de literatuur verschillende virale en cellulaire factoren verantwoordelijk werden gesteld voor de nucleaire import van het HIV PIC. Aangezien reeds beschreven werd dat transportine-SR2 SR-rijke eiwitten importeert vanuit het cytoplasma naar de celkern, werd onze interesse gewekt in een mogelijke rol van TRN-SR2 in de nucleaire import van het HIV-1 PIC. In het eerste deel van deze studie hebben we TRN-SR2 gevalideerd als een belangrijke nucleaire import factor van het HIV PIC. Deze resultaten werden gepubliceerd. Reverse yeast two-hybrid screening toonde aan dat geen enkel van de andere HIV eiwitten rechtstreeks interageerde met TRN-SR2. De interactie tussen TRN-SR2 en HIV-1 IN werd aangetoond in pull-down experimenten gebruik makende van recombinante eiwitten en cellulaire lysaten.Zowel in delende als niet-delende cellen, transiënt of stabiel neerwaarts gereguleerd (knockdown) voor TRN-SR2 expressie, werd HIV replicatie sterk geblokkeerd. Er werd aangetoond dat TRN-SR2 knockdown specifiek de vroege maar niet de late stappen van de HIV replicatiecyclus inhibeert. Ten slotte werd een rechtstreeks effect van TRN-SR2 knockdown op de nucleaire import van PICs aangetoond gebruik makende van groen fluorescent proteïne (GFP)-gemerkt HIV. De bovenstaande resultaten werden grotendeels bevestigd in andere studies. Echter, recente publicaties stelden de rol van IN in de TRN-SR2-afhankelijkheid van HIV-1 in vraag en suggereerden dat het HIV-1 capside (CA) eiwit de belangrijkste determinant is van de TRN-SR2-afhankelijkheid van HIV-1. Deze resultaten spraken onze vorige bevindingen, namelijk dat TRN-SR2 interageert met IN, tegen. Daarom hebben we in het tweede deel van deze studie de gepubliceerde data geëvalueerd. We bevestigden de lentivirus-specifieke rol van TRN-SR2 in vector transductie experimenten gebruik makende van verschillende lentivirale en retrovirale vectoren. Er werd aangetoond dat de DNA flap niet betrokken is bij de TRN-SR2-afhankelijkheid van HIV-1. Een chimeer virus dat het muis leukemie virus capside bevat in plaats van het HIV capside, en een HIV-1 N74D CA mutant virus, bleken onafhankelijk te zijn van TRN-SR2 wanneer ze gepseudotypeerd werden met de vesiculair stomatitis virus glycoproteïne enveloppe, hetgeen suggereert dat CA de TRN-SR2-afhankelijkheid van HIV-1 bepaalt. Echter, het HIV-1 N74D CA mutant virus was wel nog gevoelig voor TRN-SR2 knockdown wanneer het de natuurlijke HIV-1 enveloppe droeg. Op deze manier tonen we een tot nog toe onbekend verband aan tussen het binnendringen van de gastheercel en de nucleaire import van het viraal DNA, hetgeen een voorzichtige interpretatie vraagt van andere experimenten die uitgevoerd werden met gepseudotypeerde virussen om de vroege stappen van de virale replicatie te bestuderen. Deze gegevens ondersteunen samen de belangrijke rol van TRN-SR2 in HIV replicatie. Verder onderzoek is nodig om de interactie tussen TRN-SR2 en het HIV PIC op te helderen. Wij beschouwen de interactie tussen TRN-SR2 en IN nu reeds als een interessant nieuw antiviraal doelwit en wij hebben dan ook projecten opgestart om nieuwe moleculen op te sporen die deze interactie kunnen verhinderen.status: Publishe
Nieuwe HIV inhibitoren gericht tegen de interactie van integrase met LEDGF/p75
No full textThree decades after its discovery, the human immunodeficiency virus (HIV), the etiologic agent of the acquired immunodeficiency syndrome (AIDS), continues to wreak havoc on a global scale. However, thanks to the significant scientific achievements, combination antiretroviral therapy (ART) better known as highly active antiretroviral therapy (HAART) has significantly improved the prognosis of the disease. There is a continuous search for better drugs targeting alternative steps of the replication cycle with a higher genetic barrier and tolerability aiming at complementing the existing repertoire of drugs and reducing thelatent reservoir, a major obstacle of an HIV cure. Moreover, their application can help us to further understand the knowable unknowns of thebiology of the HIV. Although most clinical anti-HIV drugs target reverse transcriptase and protease, integrase is also a prime target for anti-HIV therapy. Accordingly, several classes of integrase (IN) inhibitors have been discovered including the first IN inhibitor approved for patient treatment, raltegravir. To efficiently insert the viral DNA, IN is dependent on cellular proteins called cofactors. One such protein is lens epithelium-derived growth factor (LEDGF)/p75. The interaction between LEDGF/p75 and IN is a potential therapeutic target thatcan accommodate small molecule inhibitors. At the start of this doctoral study, through multidisciplinary efforts, our research group identified three novel classes of integration inhibitors: (i) IN catalytic site inhibitors, (ii) LEDGINs and (iii) LEDGF/p75-binding peptides identified by phage display. The present study focuses on the virological characterization and the elucidation of the mechanism of action of these inhibitors. Moreover, using some of these inhibitors we investigated the role ofLEDGF/p75 in late stage HIV replication. The first part of the study aimed at the characterization of the antiviral activityof the IN catalytic site inhibitor MB-76, a lead compound of the 2-hydroxyisoquinoline-1,3(2H, 4H)diones (HQD) series . In a series of experiments, we showed that MB-76 displays a broad-spectrum antiviral activity with low to submicromolar 50% effective concentrations (EC50) with aselectivity index (SI) of >53. MB-76 exhibits no cross-resistance with other classes of antiretrovirals (ARVs) including integrase strand transfer inhibitors (INSTIs). Using quantitative PCR and time-of-addition experiments, we demonstrated that MB-76, similar to raltegravir, solely inhibits the integration step. We could not select resistant variants afterpassaging the virus for 15 months in cell culture, indicating that the HQD compounds have a superior genetic barrier to resistance development compared to the clinical INSTIs supporting their potential for further development. In search of a novel class of allosteric IN inhibitors, we exploited the interaction between LEDGF/p75 and HIV-1 IN. This protein-protein interaction (PPI) displays a distinct key and lock-like interaction, amenable for small molecule PPI inhibitor design. A rational drug design effort has led to the identification of small molecule allosteric IN inhibitors targeting the LEDGF/p75 binding pocket in integrase termed LEDGINs. Here, I characterized the antiviralactivity and pinpointed the mechanism of action of LEDGINs. LEDGINs prevent the interaction between LEDGF/p75 and HIV-1 IN, and indirectly interfere with the catalytic activity of IN. LEDGINs inhibit HIV-1 replication at low micromolar EC50 by blocking the integration step. Furthermore,a resistance selection experiment revealed a single amino acid substitution, A128T, in the IN-coding region confirming the molecular target. LEDGINs lack cross-resistance with other ARVs including INSTIs. Moreover, we observed a significant effect on the infectivity of progeny virions produced in the presence of LEDGINs, suggesting that LEDGINs inhibit bothintegration and late stages of HIV. In conclusion, our work demonstrates the feasibility of rational design of small molecules inhibiting PPI between a viral protein and a cellular factor underscoring their potential for further (clinical) development. While LEDGINs inhibit HIV-1 replication by occupying the LEDGF/p75 pocket in integrase,it remained unknown whether LEDGF/p75 by itself can be targeted. Therefore, using cyclic peptides (CPs) identified by a carefully designed phage display strategy, we demonstrated for the first time that LEDGF/p75-binding ligands can inhibit HIV replication by blocking the interaction between LEDGF/p75 and HIV-1 IN. Here, we showed that the CPs inhibit HIV replication without overt toxicity. In accord with the role of LEDGF/p75 in HIV integration, CP64 and CP65 block HIV replication by inhibiting integration. Moreover, the CPs retained activity against HIV-1 strains resistant to raltegravir or LEDGINs and HIV-2, indicating their differing mechanism of action compared to LEDGINs or INSTIs. We also observed a strong effect on the infectivity of progeny virions generated in CP65 expressing cells, suggesting a yet unidentified role of LEDGF/p75 in late stage HIV replication. Serial passaging of virus in the presence of CPs did not yield resistant strains. Our work provides proof-of-concept for direct targeting of LEDGF/p75 as a novel therapeutic strategy. Moreover,the CPs may serve as a scaffold for future development of new HIV therapeutics. In the final part of this doctoral study,we elucidated the molecular mechanism of the late effect of LEDGINs, which can also explain the late effect of the LEDGF/p75-binding CPs. Through parallel approaches using LEDGINs, LEDGF/p75-depleted cells, and interaction mutants of LEDGF/p75 (D366N) and HIV-1 IN (W131A), we unveil a hitherto unknown role of LEDGF/p75 in HIV biology by demonstrating its requirement for the generation of fully infectious HIV particles. Virions produced in the presence of LEDGINs display a 2- to 4-log reduction in infectivity. Detailed analysis excluded defects in genomic RNA packaging or proteolytic maturation of the virions produced in the presence of LEDGINs; instead, our findings reveal a post-entry defect during early replication steps including reverse transcription, nuclear import, and integration in the target cells. Experiments to explain the mechanism of the late effect of LEDGINs indicated that LEDGF/p75 is incorporated in the viral particles and is inhibited by LEDGINs. We then showed that LEDGF/p75 is recruited through its direct interaction with IN and/or Pol polyprotein into nascent virions. In summary, we have identified an unanticipated role of LEDGF/p75 in HIV-1 replication and corroborated a unique mechanism of action of LEDGINs inhibiting both early and late steps of HIV replication. These novel classes of inhibitors, results of multidisciplinary efforts, represent some of the most attractive ARVs for further pharmacological development to complement the existing drugs. The inhibitors described in this study have proven multimodal anti-HIV activity and a moderate to very high genetic barrier to resistance development. Particularly, LEDGINs - allosteric IN inhibitors in advancedpreclinical development - are highly potent and have compatible pharmacokinetic profiles to advance further. Notwithstanding, their ultimate success will critically depend on further clinical research and development.status: Publishe
Rol van integratie plaatsen in HIV-1 pathogenese
No full textHIV-1 persists lifelong in memory cells of the immune system as latent provirus that rebounds upon treatment interruption. Therefore, the latent reservoir is the main target for an HIV cure. In order to find such cure further research on the determinants of HIV latency is essential. During my PhD, I investigated the role of integration sites in HIV-1 pathogenesis.
HIV integration is catalyzed by the viral integrase (IN) enzyme that employs the cellular chromatin reader LEDGF/p75 to target the virus to active transcription units. Our lab developed small molecule inhibitors of the interaction between LEDGF/p75 and IN, named LEDGINs. LEDGINs have a multimodal mechanism of action: they inhibit HIV integration (early effect) and enhance IN oligomerization resulting in defective progeny virions (late effect). In 2016, we have shown that LEDGIN treatment during infection inhibits integration and retargets residual integrants out of active genes. Moreover, these proviruses were more often in a latent state and refractory to reactivation, suggesting a link between HIV-1 integration and transcription.
During my PhD, I continued this research and studied the link between integration and HIV-1 expression with an advanced barcoded HIV technology (B-HIVE) developed by the Filion lab. B-HIVE tags individual HIV genomes with a unique barcode allowing for detection of insert-specific expression. In collaboration with the Filion lab, I confirmed that LEDGIN treatment during infection retargets integration out of active genes and reduces HIV RNA expression. Silent proviruses obtained after treatment with LEDGINs were located at increased distance from H3K36me3, the marker recognized by LEDGF/p75, and enhancers. Interestingly, enhancers stimulated HIV transcription irrespective of the presence of LEDGINs.
In a second project, I investigated whether LEDGIN treatment during virus production (the late effect) affects HIV-1 latency. Residual integrants obtained after infection of cells with virus produced in the presence of LEDGINs were more latent and refractory to reactivation. The chromatin environment surrounding these proviruses was associated with latency. However, LEDGIN treatment during virus production did not alter LEDGF/p75-mediated targeting to active genes, indicating that LEDGF/p75 is not the only determinant of integration site selection.
Altogether, these results show that LEDGINs retarget integration out of active genes to sites that are less susceptible to reactivation. As such, they might be useful in an alternative 'block and lock' HIV cure strategy that aims to permanently silence HIV provirus even after treatment interruption.status: Publishe
Cluster headache and macroprolactinoma: Case report of a rare, but potential important causality.
No full textWhile headache is not an uncommon symptom in patients suffering from pituitary adenomas, cluster headache (CH) has rarely been reported in such cases. Headache associated with hyperprolactinemia has been reported to be responsive to dopamine agonists (DA agonists) in many patients. We report on a patient with refractory CH secondary to a macroprolactinoma who showed immediate and permanent clinical and radiologic recovery following medical treatment with DA agonists. Measurement of prolactin levels in addition to cranial magnetic resonance imaging might be considered in patients with refractory CH, until the significance of this potential causality becomes clearer
Development of an AlphaScreen-Based HIV-1 Integrase Dimerization Assay for Discovery of Novel Allosteric Inhibitors
No full textAbstract
In recent years, HIV-1 integrase (IN) has become an established target in the field of antiretroviral drug discovery. However, its sole clinically approved inhibitor, the integrase strand transfer inhibitor (INSTI) raltegravir, has a surprisingly low genetic barrier for resistance. Furthermore, the only two other integrase inhibitors currently in advanced clinical trials, elvitegravir and dolutegravir, share its mechanism of action and certain resistance pathways. To maintain a range of treatment options, drug discovery efforts are now turning toward allosteric IN inhibitors, which should be devoid of cross-resistance with INSTIs. As IN requires a precise and dynamic equilibrium between several oligomeric species for its activities, the modulation of this equilibrium presents an interesting allosteric target. We report on the development, characterization, and validation of an AlphaScreen-based assay for high-throughput screening for modulators of HIV-1 IN dimerization. Compounds identified as hits in this assay proved to act as allosteric IN inhibitors. Additionally, the assay offers a flexible platform to study IN dimerization
Validatie van LEDGF/p75 als nieuw doelwit voor de behandeling van acute leukemie.
No full textMixed-lineage leukemias (MLL) represent a genetically distinct subset of acute leukemias characterized by chromosomal translocations in the MLL gene. Balanced rearrangements result in the formation of new fusion proteins inducing myeloid as well as lymphoblastic leukemias with poor prognosis. All N-terminal MLL fusions (MLLNT-fusions) form a complex with the lens epithelium-derived growth factor (LEDGF/p75) and MENIN. LEDGF/p75, a chromatin reader recognizing H3K36me3 marks, contributes to the association of the MLLNT-fusion multiprotein complexes to chromatin and interacts with MLL-MENIN via its integrase binding domain (IBD). Knockdown of LEDGF/p75 or the expression of an LEDGF/p75 C-terminal fragment containing the IBD, but lacking the chromatin binding domain (LEDGF325-530) impairs clonogenic growth of MLL-fusion gene transformed cells in vitro and in a mouse model. Therefore, the interaction of LEDGF/p75 with MLL/MENIN is considered a promising target for MLL leukemia treatment.
Through NMR spectroscopy and mutational analysis, we identified, mapped and validated a non-resolved MLL-LEDGF/p75 interface. The MLL-LEDGF/p75 interaction interface is maintained mainly by two phenylalanine side chains occupying two hydrophobic pockets on the IBD surface. From a structural point of view these two pockets represent the only obvious druggable site on the interface between LEDGF/p75 and MLL/MENIN. Overexpression of a LEDGF/p75 IBD binding peptide (CP65) impaired clonogenic growth of primary murine MLL-AF9 expressing leukemic blasts. The selective anti-leukemic activity of CP65 provides a direct rationale for the design of small molecules targeting the newly defined LEDGF/p75-MLL interface. Based on these results, we performed the first steps towards the development of small molecule LEDGF/p75-MLL interaction inhibitors. We employed a high throughput AlphaScreen based assay to screen a diverse library of over 72 000 drug-like compounds. Currently we are in the early hit-to-lead optimization phase of the first MLL-LEDGF/p75 interaction inhibitors.
Next to ongoing drug development efforts, we also characterized the interaction of the LEDGF/p75 IBD with its other known cellular interaction partners. Beside MLL, the LEDGF/p75 IBD is known to interact with several other cellular proteins like JPO2, PogZ and ASK. Using NMR spectroscopy, we characterized the interaction of LEDGF/p75 with the transcriptional repressor JPO2 and the domesticated transposase PogZ. This resulted in the identification of an intrinsically disordered IBD-binding motif (IBM) common to all known cellular partners of LEDGF/p75 including MLL. The importance of the IBM to maintain the interaction was verified through mutational analysis. In addition, based on IBM conservation, we identified and validated IWS1 as a novel LEDGF/p75 interaction partner. The similar binding mode of physiological LEDGF/p75 interaction partners represents a challenge for the development of selective interaction inhibitors.status: Publishe
Karakterisatie van de interactie van HIV-1 integrase met zijn cellulaire cofactor LEDGF/p75
No full textDe bestrijding van het humaan immunodeficiëntie virus (HIV), wat het verworven immunodeficiëntie syndroom (AIDS) veroorzaakt, blijft een enorme uitdaging op wereldniveau. Momenteel zijn er wereldwijd meer dan 30 miljoen personen geïnfecteerd met HIV. Sinds de eerste rapporteringen van HIV infecties in 1981 zijn er al meer dan 25 miljoen mensen gestorven aan AIDS. Doordat het virus een korte replicatiecyclus heeft en bovendien veel fouten maakt in zijn genoom, kan het snel muteren. Dit heeft tot gevolg dat virussen ontstaan die ongevoelig zijn aan de huidige therapie. Ondanks het feit dat de huidige behandeling voor HIV geïnfecteerde patiënten gebaseerd is op combinaties van zeer effectieve antiretrovirale middelen, blijven er toch resistente virusstammen ontstaan. Dit betekent dat wetenschappers continu op zoek moeten naar nieuwe inhibitoren die de resistente virussen kunnen bestrijden. Daarom werken deze nieuwe producten liefst tegen stappen van de replicatiecyclus waarvoor nog geen inhibitoren op de markt zijn.HIV zelf heeft slechts een zeer beperkte genomische capaciteit. Om toch zijn replicatiecyclus efficiënt te kunnen voltooien, heeft HIV strategieën ontwikkeld waarbij het gebruik maakt van humane eiwitten, welke cofactoren genoemd worden. De binding van virale aan humane eiwitten opent perspectieven voor de ontwikkeling van een nieuw prototype van inhibitoren: de cofactor remmers. De focus in ons laboratorium ligt op de interactie van het essentiële virale enzym HIV-1 integrase met zijn humane cofactor LEDGF/p75. Wij willen voornamelijk het therapeutisch potentieel van deze belangrijke associatie nagaan.Omdat niet alle retrovirussen dezelfde strategie volgen om tot een succesvolle infectie te komen, was een eerste doelstelling van dit werk het karakteriseren van de specificiteit van de associatie van de twee eiwitten. We hebben aangetoond dat LEDGF/p75 niet alleen bindt met het integrase van HIV type 1, maar ook met andere lentivirale integrases zoals dat van HIV type 2 en feline immunodeficiency virus. Er werd echter geen binding gezien met de integrases van oncoretrovirussen zoals Moloney murine leukemia virus (MoMLV). Deze resultaten toonden aan dat niet alle retrovirussen dezelfde strategie gekozen hebben om een cofactor te selecteren. Bovendien maakten ze duidelijk dat de binding van integrase met LEDGF/p75 enkel optreedt bij lentivirussen, zoals HIV.Om inzicht te krijgen in het werkingsmechanisme van LEDGF/p75 en zijn rol in de HIV integratie, hebben we gebruik gemaakt van fluorescentie correlatie spectroscopie. We toonden aan dat de affiniteit van integrase voor DNA dramatisch verhoogd wordt door LEDGF/p75 op een lentiviraal-specifieke manier. Deze bevindingen werden bovendien verder uitgewerkt met behulp van AlphaScreen technologie. Blijkbaar speelt LEDGF/p75 meerdere rollen in de vorming van het integrase-DNA complex. Terwijl het volledige eiwit de binding kan stimuleren, wordt deze associatie geïnhibeerd door C-terminale fragmenten van LEDGF/p75 die het domein bevatten dat verantwoordelijk is voor de binding met integrase, maar die geen DNA-bindende eigenschappen hebben. Deze resultaten suggereren dat kleine moleculen die interfereren met de integrase-LEDGF/p75 binding, meerdere effecten kunnen hebben als therapeutica. Ze beïnvloeden niet alleen de directe binding van de twee eiwitten, maar kunnen ook een effect uitoefenen op de enzymatische activiteit van integrase.Met het oog op de ontwikkeling van nieuwe antivirale producten is het belangrijk om over structurele informatie van het integrase-LEDGF/p75 complex te beschikken. Door een mutagenesestudie uit te voeren hebben we de aminozuren in integrase kunnen bepalen die verantwoordelijk zijn voor de binding met LEDGF/p75. Eén regio is gelegen rond de aminozuren W131 en W132, terwijl het tweede gebied zich uitstrekt van aminozuur I161 tot E170. Vervolgens kon een structuur-functie analyse aantonen dat een virus met de W131A mutatie in integrase een verminderde replicatiecapaciteit vertoont. Daarentegen is een virus met de Q168A mutatie volledig replicatiedeficiënt. Bovendien was het geobserveerde defect in replicatie te wijten aan een geblokkeerde integratie. Deze data hebben daardoor niet alleen bijgedragen aan de verdere validatie van LEDGF/p75 als belangrijke cofactor voor virale replicatie, maar hebben ook de structuur van het integrase-LEDGF/p75 complex verhelderd.De belangrijkste functie van LEDGF/p75 tijdens de replicatiecyclus is het richten van de binnenkomende virale partikels naar transcriptioneel actieve gebieden in het gastheergenoom, waardoor de integratie en infectie bevorderd wordt. Bovendien weten we dat lenti- en oncoretrovirussen verschillende regios in het genoom verkiezen voor hun integratie en dat LEDGF/p75 een lentiviraal-specifieke cofactor is. Daarom zijn we een zoektocht gestart naar de oncoretrovirale tegenhanger van LEDGF/p75. We hebben grootschalige immunozuiveringen uitgevoerd, die gevolgd werden door de identificatie van de gezuiverde eiwitten met massaspectrometrie. Zo hebben we meerdere mogelijke bindingspartners van MoMLV integrase kunnen identificeren. De functie van één veelbelovende bindingspartner werd verder onderzocht gebruik makend van zowel transiënte als stabiele RNA interferentie. Hoewel we nog geen essentiële rol als cofactor voor oncoretrovirale integratie konden aantonen, hebben we wel de nucleaire colokalisatie van MoMLV integrase en zijn cellulaire bindingspartner vastgesteld. Verder onderzoek zal moeten uitmaken of dit cellulaire eiwit gevalideerd kan worden als een oncoretrovirale cofactor die verantwoordelijk is voor het richten van de virale partikels naar specifieke plaatsen in het genoom.status: Publishe
Author Commentary: Mobile Music Technology: From Innovation to Ubiquitous Use
No full textThis author commentary chapter accompanies the re-publication of my co-authored 2006 paper ‘Mobile Music Technology: Report on an Emerging Community’ - one of 30 papers selected from 1,200 NIME papers to be included in the book ‘A NIME Reader: Fifteen Years of New Interfaces for Musical Expression, published by Springer and edited by Alexander Refsum Jensenius and Michael J. Lyons
- …
