1,721,033 research outputs found
Reprogramming the cyanobacterial metabolism of Synechocystis sp. PCC6803 for a better hydrogen photoproduction
No full textLe développement d'organismes photosynthétiques (piégeant le C02 en préservant l'eau douce et les terres cultivables sans ajout d'engrais) capables d'utiliser l'énergie solaire pour produire du dihydrogène (H2) passe par une meilleure compréhension du rôle de l'hydrogénase dans le métabolisme cyanobactérien. Le Laboratoire de Biologie et Biotechnologie des Cyanobatéries où j'ai travaillé durant ma thèse utilise une approche de "Biologie Intégrative" pour analyser le métabolisme qui conduit à la photo-production d’H2 chez la cyanobactérie modèle Synechocystis sp. PCC6803. Mon travail s'est focalisé sur l’analyse des réseaux de régulation amenant à la production d'H2 par l’hydrogénase bidirectionnelle à centre Ni-Fe (composée de 5 sous-unités) codée par l’opéron hox. Lorsque j’ai débuté ce travail, 2 activateurs de l’opéron hox avaient été identifiés: AbrB1 et LexA. Un article dont je suis co-premier auteur est paru (Dutheil et al. 2012 J Bact.), il décrit l'identification par l'utilisation de diverses approches d'un nouveau facteur de transcription de l'opéron hox: AbrB2 (homologue d'AbrB1). J'ai ainsi montré que l'expression de l’opéron hox était régulée négativement par AbrB2 en utilisant des fusions transcriptionnelles au gène rapporteur cat (introduites dans la souche sauvage ou dépourvues d'AbrB2) ainsi que des expériences de qRT-PCR. Par la technique de retard sur gel, nous avons confirmé une interaction directe entre AbrB2 et la région promotrice de l’opéron hox. En collaboration avec deux laboratoires du CEA, nous avons montré qu'un mutant dépourvu d’AbrB2 possède une activité hydrogénase augmentée, confirmant ainsi qu'AbrB2 est un régulateur négatif de la production d'H2.Dans un deuxième temps et en collaboration avec deux post-doc du laboratoire, nous avons mis en évidence le rôle de la cystéine unique d'AbrB2 dans le contrôle redox de son activité de régulation transcriptionnelle.Par la technique du retard sur gel,j’ai montré que cette cystéine n’est pas cruciale pour la fixation d'AbrB2 sur le promoteur hox, mais que par contre, la modification redox de celle-ci l’affecte de manière drastique. Dans le cadre de collaborations, nous avons identifié la modification post-traductionnelle qui peut avoir lieu sur la cysteine d'AbrB2 et il s’agit de la première fois, qu’un tel mécanisme de régulation est identifié pour cette famille de régulateur et chez les cyanobactéries. J’ai construit une souche portant l'allèle muté abrB2 Cys>Ser sur le chromosome et exprimé par le promoteur sauvage d’abrB2. J’ai montré grâce à cette construction et en utilisant diverses techniques (activité hydrogénase, qRT-PCR, Western blot et transcriptome) que la cystéine d'AbrB2 joue un rôle dans son activité de régulation qui est 60% moins bonne sur les 529 gènes cibles (directes ou indirectes) du régulateur muté. L’effet est également visible sur l’activité hydrogénase. Ce résultat a été complété par des tests de surexpression thermoinduite d’AbrB2 qui montrent que la mutation C34S affecte la stabilité de la protéine qui ne s’accumule pas autant que la sauvage dans les même conditions et dont la surexpression est létale. Un manuscrit dont je suis copremier auteur et décrivant ces résultats est en cours de finalisation et sera prochainement soumis à l’Intern. Journ. of Hydrogen Energy.L’ensemble de ces travaux permet de mieux comprendre les mécanismes biologiques liés à l’expression de l’hydrogénase bidirectionnelle et vont dans le sens d’un rôle important de celle-ci dans la détoxification des stress redox. La détermination des relations entre les différents régulateurs de l’hydrogénase et les possibles modifications post-traductionnelles de chacun de ces facteurs que j’ai mises en évidence traduisent une enzyme à la régulation complexe. Ces nouvelles connaissances permettent d’éclairer sous un angle nouveau la photoproduction d’H2 par les cyanobactéries et permettront peut-être d’élaborer des stratégies de production d’H2 efficace.Developing photosynthetic organism (trapping CO2 while preserving fresh water and arable soils without adding fertilizers) able to use Sun light to produce dihydrogen (H2) is depending on a better understanding of the role of hydrogenase in the cyanobacterial metabolism. The Laboratoire de Biologie et Biotechnologie des Cyanobactéries (LBBC) where I worked during my thesis uses « Integrative Biology » approach to analyze the metabolism leading to H2 photoproduction by the model cyanobacterium Synechocystis sp. PCC6803. My work focused on analyzing the regulation network leading to H2 production by the bidirectionnal hydrogenase with Ni-Fe cluster (composed of 5 subunits) encoded by hox operon. When I started this work, two transcriptionnal activators were identified : AbrB1 and LexA. An article, of which I’m sharing first author position, is published (Dutheil et al. 2012 J Bact.), it describes the identification by different approachs of a new transcriptionnal factor of hox operon : AbrB2 (homologous to AbrB1). I showed that hox expression is negatively regulated by AbrB2 by using transcriptionnal fusion to cat reporter gene (introduced in the wild type background or the AbrB2-deleted one) and qRT-PCR experiments. By the electrophoretic mobility shift assay (EMSA) method, we confirmed a direct interaction between AbrB2 and the promoter region of hox operon. Collaborating with two CEA laboratories, we showed that a mutant lacking AbrB2 harbours an increased hydrogenase activity, validating that AbrB2 is a negative regulator of H2 production.In a second time of my thesis and colaborating with two post-doc of the laboratory, we evidenced the role of the unique cysteine of AbrB2 in redox-controlling the transcriptionnal regulator activity of the protein.Using the EMSA method, I showed that the cysteine is not crucial for AbrB2 fixing on hox promoter, but also that the redox modification occuring on this residue inhibits this same binding activity. Collaborating with other labs, we identified the post-translational modifications that may occur on AbrB2 cysteine and it is the first time that such a regulating mechanism is identified for this family of regulators and in cyanobacteria. I constructed a strand harbouring the abrB2C34S mutant allele on the chromosome and expressed by the abrB2 natural promoter. I showed with this construction and using diverse methods (hydrogenase activity, qRT-PCR, Western blot and transcriptome) that AbrB2 cysteine plays a role in its regulating activity : regulating activity is 60% less efficient towards the 529 target genes (either direct and indirect) of the mutated regulator. The effect is also seen on hydrogenase activity and hox genes. This result was completed by thermoinduced overexpression assays that show that C34S mutation of AbrB2 alters protein stability : the mutated protein accumulates less than wild type allele in the same conditions, which is lethal. A manuscript, of which I’m sharing first author position, and describing those results is being finalised and will be submitted soon to the IJHE (International Journal of Hydrogen Energy).Altogether, my results allow a better understanding of the biological mechanisms linked to bidirectionnal hydrogenase expression and agree with a possible role for hydrogenase in detoxifying redox stresses. The determination of the relationships between the different regulators of hydrogenase, and their possible post-translational modifications that I revealed, highlight an enzyme with complex regulation. This new knowledge brings an original outlook on hydrogen photoproduction by cyanobacteria and shall allow elaboration of efficient H2 production strategies
System biology of the metabolic oxydative stress resistance : role of glutathione, methylglyoxal and glyoxalases
No full textApparues il y a environ trois milliards d'années, les cyanobactéries ont façonné notre planète, en produisant l’atmosphère oxygénique. De nos jours, les cyanobactéries sont les organismes photosynthétiques les plus abondants dans notre environnement, elles assurent environ 30 à 40% de la production d'O2, et de la consommation du CO2 par les océans et constituent le premier maillon de la chaîne alimentaire. A part la photosynthèse, leur métabolisme est encore très mal connu. Ainsi, pour mieux comprendre le métabolisme cyanobactérien et proposer des stratégies de reprogrammation, il est primordial de développer des méthodes analytiques permettant l’étude globale de leur métabolisme en réponse à des variations de conditions environnementales et de stress. La cyanobactérie modèle Synechocystis PCC6803 convient parfaitement à ce type d’analyse. En effet, Synechocystis est un unicellulaire, hétérotrophe facultative capable de se développer en eau douce ou saumâtre et à un pH alcalin. Synechocystis possède un petit génome d’environ 4.0 Mb entièrement séquencé et facilement manipulable grâce aux outils développés au laboratoire. Son génome prédit l'existence d'un métabolisme carboné complexe mais encore peu étudié. Mon travail de thèse est centré sur cette analyse par la combinaison de deux approches, la génomique fonctionnelle et la métabolomique. Durant ma thèse en collaboration avec le LEMM dirigé par Christophe Junot iBiTec-S/SPI, j’ai développé un protocole d’extraction des métabolites de Synechocystis, ainsi qu’une méthode d’analyse métabolomique par couplage de la chromatographie liquide à la spectrométrie de masse LTQ-Orbitrap à haute résolution. L’application de cette nouvelle méthode analytique m’a permis d’étudier l’influence de la lumière et du glucose sur le métabolisme de Synechocystis. Ainsi, j’ai montré que Synechocystis cultivée en présence du glucose reprogramme fortement son métabolisme. Parmi les résultats très intéressants, j’ai montré que le glucose engendre un stress oxydant. Chez tous les organismes, une forte activité du métabolisme carboné entraîne la production de métabolites toxiques tels que le méthyglyoxal (MG). Le MG modifie irréversiblement de nombreuses bio-molécules. Dans le cadre de ma thèse, j’ai commencé à m’intéresser à l'effet du MG sur la physiologie et le métabolisme de Synechocystis. J'ai construit 25 mutants KO pour les gènes de la glycolyse et du métabolisme du glycérol permettant de moduler la concentration intracellulaire de MG et également les gènes impliqués dans les voies de détoxication du MG dont celle dépendante de la synthèse du GSH (la voie des glyoxalases). J’ai pu montrer que les gènes responsables de la synthèse du GSH sont essentiels à la viabilité cellulaire. Je suis parvenu toutefois à obtenir un mutant déplété de gshB et ne produisant plus de GSH à un niveau détectable. En faisant une analyse métabolomique approfondie, j’ai mis en évidence pour la première fois que Synechocystis était capable produire deux tripeptides non-thiolés analogues structuraux du GSH; l’acide ophthalmique et l’acide norophthalmique identifiés jusqu’à présent uniquement chez les mammifères. La comparaison des métabolomes de culture de souches sauvage, ou dépletées en gshA, gshB ou ggt, a permis de montré que ces analogues sont synthétisés par les mêmes enzymes que le GSH à savoir GshA et GshB. Par ailleurs, une autre molécule anti-oxydante dont la synthèse est connue chez quelques champignons et qui s’accumule chez l’Homme par l’apport alimentaire a également été observée.Cyanobacteria are fascinating microorganisms. They are among the oldest life forms, regarded as the progenitors of the oxygenic photosynthesis and plant chloroplast. Furthermore, cyanobacteria have evolved as the largest and most diverse groups of bacteria in colonizing most marine and fresh waters, as well as soils. An important reason for the hardness of cyanobacteria is their successful combination of effective metabolic pathways driven by their efficient photosynthesis that uses nature's most abundant resources, solar energy, water and CO2, to produce a large part of the Planet's oxygenic atmosphere and organic assimilates for the food chain. Hence, cyanobacteria are receiving a growing attention because of their potential for the carbon-neutral production of biofuels and bioplastics. To better understand cyanobacteria and turn their biotechnological potentials into an industrial reality, we need to develop robust protocols for global analysis of their metabolism and its responses to environmental stresses. The model cyanobacterium Synechocystis PCC6803 is well suited for this purpose. Synechocystis is a basic organism, i.e. unicellular, which grows well (i) in fresh- and marine-waters; (ii) in the presence of glucose that can compensate for the absence of light; and (iii) at high pH that prevents microbial contaminations. Furthermore, Synechocystis harbors a small sequenced genome (about 4.0 Mb), which can be easily manipulated. In the present work, we developed a robust protocol for metabolome analyses of Synechocystis, using liquid chromatography (LC) for metabolite separation, coupled to a LTQ-Orbitrap mass spectrometer that provides high sensitivity and resolution, accurate mass measurements, and structural informations with MS/MS or sequential MSn experiments that facilitate metabolite identification. Consequently, we applied the PFPP-LC/MS method to analyze the metabolome of Synechocystis growing under various conditions of light and glucose, which strongly influence cell growth. We found that glucose increases glucose storage and catabolism, while it decreases the Calvin-Benson cycle that consumes photosynthetic electrons for CO2 assimilation. Depending on light and glucose availabilities, this global metabolic reprogramming can generate an oxidative stress, likely through the recombination of the glucose-spared electrons with the photosynthetic oxygen thereby producing toxic reactive oxygen species. Furthermore, we studied the metabolism of an endogenous toxic the méthylglyoxal and its main catabolic pathway going through the glyoxalases system glutathione dependent
Exploration du rôle des protéines du thylakoïde, Ape1 et Tlp15, chez la cyanobactérie, Synechocystis sp. PCC6803
No full textLa photosynthèse oxygénique est bien conservée, des cyanobactéries aux organismes contenant des chloroplastes, tels que les algues et les plantes. Utilisant l'énergie de la lumière, le dioxyde de carbone (CO₂), les minéraux et l'eau, les organismes photosynthétiques assimilent une grande quantité de carbone et d'azote inorganiques pour générer leur biomasse, qui est ensuite distribuée aux organismes hétérotrophes, suggérant qu'ils constituent la base de la chaîne alimentaire. Cependant, ce mécanisme peut produire des espèces réactives de l'oxygène (ROS), qui causent des dommages irréversibles aux protéines à l'appareil photosynthétique, puis réduisant l'efficacité de la photosynthèse. Les organismes photosynthétiques ont donc développé des processus pour diminuer aux ROS générés par la photosynthèse. L'un d'entre eux, appelé acclimatation, permet d'ajuster la composition de l'appareil photosynthétique afin de le rendre tolérant aux conditions fluctuantes. Deux protéines trouvées dans les membranes photosynthétiques à savoir i) d'Acclimatation de la Photosynthèse à l'Environnement 1 (Ape1) et ii) Protéine Luminale Thylakoïdienne 15 (Tlp15), sont conservées et, grâce au criblage génétique, ont été considérées comme impliquées dans le processus d'acclimatation chez la microalgue Chlamydomonas reinhardii et la plante Arabidopsis thaliana. Cependant, le rôle de ces protéines reste inconnu et n'a jamais été étudié chez les cyanobactéries, qui ont développé la photosynthèse oxygénique et sont considérées comme i) l'ancêtre des chloroplastes et ii) cellulaires potentielles pour la production durable de molécules pour la santé et l'énergie. L'objectif de cette thèse est d'analyser le rôle d'Ape1 (Slr0575) et de Tlp15 (Sll1071) chez le modèle cyanobactérien, Synechocystis sp. PCC 6803, qui est génétiquement manipulable et capable de croître en l'absence de photosynthèse grâce au glucose. Tout d'abord, des mutants à délétion des gènes codant ces deux protéines ont été construits en remplaçant par une cassette de résistance aux antibiotiques dans toutes les copies chromosomiques de Synechocystis. Les gènes ape1 et tlp15 sont trouvés dispensables dans les conditions de croissance photoautotrophiques standard. Ensuite, les phénotypes des mutants ont été analysés par des méthodes (croissance dans diverses conditions environnementales et de stress, mesures de l'évolution de l'O₂, tests enzymatiques, quantification des métabolites de certaines molécules carbonées, etc.). Le mutant Δape1 s'est révélé sensible au stress oxydatif (le peroxyde d'hydrogène et la ménadione) et produit plus de ROS que la souche sauvage (WT), suggérant que la protéine Ape1 est impliquée dans la tolérance au stress oxydatif. Le mutant Δtlp15 croît comme la souche WT dans des conditions photoautotrophiques sous diverses intensités lumineuses, mais produit moins d'O₂ que la WT. De manière surprenante, en présence de glucose (conditions mixotrophiques) sous une forte lumière qui favorise le stress oxydatif et la production de méthylglyoxal, le mutant Δtlp15 est capable de croître mais la souche WT ne l'est pas. Ce phénotype est dû à l'absence de tlp15, pas de mutation secondaire, puisque l'introduction du gène tlp15 (complémentation) dans le mutant Δtlp15 rétablit le phénotype WT. Le mutant Δtlp15 s'est également révélé plus tolérant à divers stress oxydatifs et capable de réorganiser les voies du métabolisme du carbone différemment de la souche WT. Une analyse structure-fonction a été réalisée en utilisant la mutagenèse dirigée. Le domaine transmembranaire de Tlp15 et les deux cystéines impliquées dans la formation d'un pont disulfure se sont révélés impliqués dans l'activité de Tlp15. Tous ces résultats suggèrent que Tlp15 participe à un mécanisme de régulation redox impliqué dans le processus d'acclimatation de la photosynthèse. Un modèle intégrant l'ensemble des résultats est proposé.Oxygenic photosynthesis is well-conserved from cyanobacteria to chloroplast-containing organisms such as algae and plants. Using energy from light, carbon dioxide (CO₂), minerals and water, the photosynthetic organisms assimilate a large number of inorganic carbon and nitrogen to generate their biomass to be distributed to the heterotrophic organisms suggesting that they are the base of the food chain. However, the mechanism can lead to the formation of Reactive Oxygen Species (ROS) which causes irreversible damages on proteins, lipids, DNA and photosynthetic apparatus thus decreasing the photosynthesis efficiency. Therefore, photosynthetic organisms had developed various processes to deal with ROS generated directly or indirectly from photosynthesis. Some of them are conserved through the evolution of the green lineage. One of these, named the acclimation, allows adjusting the composition of photosynthetic apparatus in the thylakoid membrane to make them tolerant to fluctuating conditions. Two proteins found in thylakoids, the photosynthetic membranes, i) the Acclimation of Photosynthesis to the Environment 1 protein (Ape1) and the Thylakoid Luminal Protein 15 (TLP15) are conserved through the green lineage and thanks to genetic screening, they were considered to be involved in the acclimation process in the microalga, Chlamydomonas reinhardii, and the plant, Arabidopsis. However, the role of these proteins remained unknown and was never been studied in cyanobacteria that have evolved oxygenic photosynthesis and are considered as i) the ancestor of the chloroplast of eukaryotic photosynthetic organisms, ii) potential cell factories for sustainable production of high added values molecules for health and energy. The objective of this thesis is to analyze the role of Ape1 (Slr0575) and Tlp15 (Sll1071) in the model cyanobacterium, Synechocystis sp. PCC 6803 that is genetically manipulable and is able to grow in the absence of photosynthesis at the expense of glucose. First, single knockout mutants of the genes encoding the two proteins were constructed by replacing their corresponding genes with an antibiotic resistance cassette in all chromosome copies of Synechocystis. ape1 and tlp15 genes were shown to be dispensable in standard photoautotrophic growth. Then the mutant phenotypes were analyzed by a combination of methods (growth in various environmental and stress conditions, O₂ evolution measurements, enzymatic assays, metabolites quantification of some carbonated molecules, etc..). The Δape1 mutant was shown to be sensitive to oxidative stress induced by hydrogen peroxide and menadione and produces more ROS than the wild-type strain (WT) suggesting that APE1 protein is involved in the tolerance to oxidative stress. The Δtlp15 mutant grows as the WT strain in photoautotrophic conditions under various light intensities but produce less O₂ than the WT. Surprisingly, in the presence of glucose (mixotrophic conditions) under high light that promote oxidative stress and methylglyoxal production, the Δtlp15 is able to grow whereas the WT strain is not. This phenotype is due to the absence of tlp15 and not to a secondary mutation since the introduction of tlp15 gene (complementation) in the Δtlp15 restores the WT phenotype. The Δtlp15 mutant was also shown to be more tolerant to various oxidative stresses and is able to reorganize carbon metabolism pathways differently than the WT. A structure function analysis was performed using site-directed mutagenesis. The transmembrane domain of Tlp15 as well as the two cysteines involved in the formation of a disulfide bridge were shown to be involved in the activity of Tlp15. All these results suggest that Tlp15 participates in a redox regulation mechanism involved in photosynthesis acclimation process. A model taking into account all the results is proposed
Towards a breakthrough effluent treatment process : use of cyanobacteria selectively precipitating strontium versus calcium
No full textMes travaux de thèse s’inscrivent dans le programme « FOCUSDEM» du CEA qui a pour but de développer sur le long terme des procédés en rupture dans le contexte du démantèlement, et notamment pour le traitement des effluents liquides et la diminution de leur volume. Le ⁹⁰Sr, un isotope radioactif du strontium, est un produit de fission de l’uranium et du plutonium généré dans les centrales nucléaires. Cet élément toxique à vie longue est retrouvé dans les effluents liquides de l’industrie électronucléaire qui doivent être décontaminés avant rejet. Le Sr et le calcium font partie de la famille des alcalino-terreux et possèdent donc des propriétés chimiques similaires. Les procédés de traitement actuels, basés sur des techniques physico-chimiques, sont de ce fait peu sélectifs et peuvent être une source de volumes importants de déchets secondaires. L’objectif de ce projet consistait à comprendre et exploiter la capacité exceptionnelle de la cyanobactérie Gloeomargarita lithophora à accumuler le Sr sélectivement par rapport au Ca à l’intérieur des cellules sous forme de granules de carbonates. Plusieurs axes de recherche ont été développés pour (i) optimiser les conditions de croissance de cet organisme photosynthétique ; (ii) décrypter les mécanismes moléculaires impliqués dans l’accumulation sélective du Sr et (iii) développer un procédé biotechnologique de décontamination d’effluents du nucléaire.Après avoir criblé différents paramètres, une amélioration de la production de biomasse a pu être obtenue en augmentant la concentration en fer et en carbonate d’un milieu minéral classiquement utilisé pour la culture en milieu liquide des cyanobactéries. Pour comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans la biominéralisation intracellulaire du Sr par une approche génétique, il était important d’axéniser la souche, de trouver des conditions pour obtenir des colonies et d’identifier les antibiotiques à utiliser pour la sélection. Après être parvenu à une axénisation partielle et à l’obtention de colonies sur boites, les premiers essais de conjugaison ont été réalisés. Bien que des colonies aient été obtenues, il reste à montrer que le plasmide se maintient dans les cellules. Les résultats ont montré qu’en milieu minéral G. lithophora peut accumuler rapidement (en moins de 3 jours) une dose de ⁹⁰Sr similaire à celle retrouvée dans les effluents et ce de façon stable dans le temps. De plus, l’accumulation intracellulaire de ce radionucléide, qui est un émetteur de rayonnements β, n’affecte pas la survie des cellules. L’activité photosynthétique joue un rôle dans ce mécanisme car l’inhibition de l’appareil photosynthétique provoque un ralentissement de l’accumulation suivi d’un relargage du ⁹⁰Sr par les cellules. Enfin, nos expériences indiquent que G. lithophora pourrait être utilisée dans un procédé de bioremédiation du ⁹⁰Sr pour traiter des effluents ayant une composition similaire à celle d’effluents traités dans une installation nucléaire.My thesis work is part of the CEA's "FOCUSDEM" program, which aims to develop long-term breakthrough processes in the context of dismantling, particularly for liquid effluent treatment and volume reduction. ⁹⁰Sr, a radioactive strontium isotope, is a fission product of uranium and plutonium generated in nuclear power plants. This long-lived toxic element is found in liquid effluents from the nuclear power industry, which must be decontaminated before discharge. Sr and calcium belong to the alkaline earth family and have similar chemical properties. Current treatment processes, based on physico-chemical techniques, are thus not very selective and can be a source of large volumes of secondary waste. The aim of this project was to understand and exploit the exceptional ability of the cyanobacterium Gloeomargarita lithophora to accumulate Sr selectively with respect to Ca inside its cells in the form of carbonate granules. Several lines of research were developed to (i) optimize the growth conditions of this photosynthetic organism; (ii) decipher the molecular mechanisms involved in the selective accumulation of Sr; and (iii) develop a biotechnological process for decontaminating nuclear effluents. After screening various parameters, an improvement in biomass production was achieved by increasing the iron and carbonate concentration of a mineral medium conventionally used for liquid culture of cyanobacteria. To understand the molecular mechanisms involved in the intracellular biomineralization of Sr using a genetic approach, it was important to axenize the strain, find conditions for obtaining colonies and identify the antibiotics to be used for selection. After achieving partial axenization and obtaining colonies on plates, the first conjugation trials were carried out. Although colonies were obtained, it remains to be shown that the plasmid is maintained in the cells. The results showed that in mineral medium, G. lithophora can rapidly accumulate (in less than 3 days) a dose of ⁹⁰Sr similar to that found in effluents, and in a stable manner over time. Moreover, intracellular accumulation of this radionuclide, which is a β-emitter, does not affect cell survival. Photosynthetic activity plays a role in this mechanism, as inhibition of the photosynthetic apparatus slows down accumulation, followed by release of ⁹⁰Sr from the cells. Finally, our experiments indicate that G. lithophora could be used in a ⁹⁰Sr bioremediation process to treat effluents with a composition similar to that of effluents treated in a nuclear facility
Molecular mechanisms of intracellular biomineralization of CaCO3 by cyanobacteria
No full textLa biominéralisation des carbonates de calcium est un processus répandu chez les bactéries. Cependant les mécanismes moléculaires sous-jacents restent mal compris. Récemment, la biominéralisation intracellulaire de phases amorphes de carbonate de calcium (iACC) a été découverte chez des cyanobactéries répandues environnementalement et phylogénétiquement. Un gène orphelin de fonction inconnue, nommé ccyA et codant pour une protéine nommée Calcyanine, a été identifié uniquement chez ces cyanobactéries. Ainsi mon travail de thèse a consisté à développer une approche génétique pour analyser la fonction in vivo du gène ccyA et déterminer si la protéine qu’il code est impliquée ou non dans la formation des iACC. L’échec des tentatives de délétion de ccyA chez Cyanothece sp. PCC 7425 et Synechococcus sp. PCC 6312 suggère que ce gène leur est essentiel. Nous avons donc construit une expression hétérologue de ccyA dans des cyanobactéries modèles ne formant pas naturellement des iACC. L’expression constitutive de diverses séquences du gène ccyA a montré que la croissance de Synechococcus elongatus PCC 7942 est ralentie par rapport à celle de la souche sauvage. En accord, les mutants exprimant le ccyA présentent plus de cellules mortes que la souche sauvage. Enfin, ces mutants possèdent plus de calcium intracellulaire que la souche sauvage, suggérant une modification de l’homéostasie du calcium. Enfin, j’ai introduit des plasmides par conjugaison chez Cyanothece sp. PCC 7425 et Synechococcus sp. PCC 6312 leur permettant de surproduire ccyA. La Calcyanine fusionnée avec la eGFP se localise à la membrane et aux pôles des cellules chez la souche Synechococcus sp. PCC 6312.The biomineralization of calcium carbonates is a common process in bacteria, however, the underlying molecular mechanisms remain poorly understood. Recently, intracellular biomineralization of amorphous calcium carbonate phases (iACC) has been discovered in environmentally and phylogenetically widespread cyanobacteria. An orphan gene of unknown function, named ccyA and coding for a protein named Calcyanin, has been identified only in these cyanobacteria. My thesis work consisted in developing a genetic approach to analyze the in vivo function of the ccyA gene and determine whether or not the encoded protein is involved in the formation of iACCs. The failure of ccyA deletion attempts in Cyanothece sp. PCC 7425 and Synechococcus sp. PCC 6312 suggests that this gene could be essential to cells viability. We have therefore introduced a plasmid allowing heterologous expression of ccyA in model cyanobacteria that do not naturally form iACC. The constitutive expression of various ccyA sequences in Synechococcus elongatus PCC 7942 is slowed down compared to that of the wild strain. In agreement, ccyA-expressing mutants have more dead cells than the wild-type strain. Finally, these mutants have more intracellular calcium than the wild strain, suggesting a modification of calcium homeostasis. Finally, I introduced plasmids by conjugation in Cyanothece sp. PCC 7425 and Synechococcus sp. PCC 6312 allowing them to overproduce ccyA. Calcyanin fused with eGFP is localized to the membrane and poles of cells in Synechococcus sp. PCC 6312
Towards the metabolic reprogramming of the cyanobacterium Synechocystis for sustainable biofuels production : Structuration of carbon fluxes by CP12 and implications on the bioenergetic balance, hydrogenase and genomic integrity
No full textLes biotechnologies sont un outil puissant permettant d’emprunter les circuits biologiques pour produire des composés aux applications multiples (médecine, alimentation, industries…). Les cyanobactéries possèdent des propriétés génétiques et trophiques précieuses pour réduire les coûts et l’empreinte environnementale de ces procédés (photosynthèse, fixation du CO₂, sources d’azote assimilables...). Elles produisent aussi naturellement certaines molécules énergétiques comme le H₂ dont pourraient émerger de nouvelles filières propres de biocarburants. Cependant, une compréhension globale et approfondie de leur physiologie est nécessaire pour concevoir un châssis biologique performant à partir de ces organismes. Elles sont aisément manipulables génétiquement mais présentent une versatilité favorisant la fixation de mutations bénéfiques mais aussi délétères pour leur exploitation à grande échelle. Au cours de ma thèse, j’ai construit et étudié des mutants d’un régulateur de l’assimilation du CO₂ dont l’activation est liée à la photosynthèse. J’ai montré que l’activité du cycle de Calvin synchronise les flux du carbone et le statut rédox de Synechocystis et que sa dérégulation se répercute de manière pléiotropique sur son métabolisme. Plus spécifiquement, je me suis intéressé au déséquilibre carbone/azote dans cette espèce et à son métabolisme de l’urée qui présente un intérêt biotechnologique considérable. J’ai démontré que ce dernier était en compétition avec l’hydrogénase pour l’insertion du nickel dans leurs centres catalytiques respectifs. L’insuffisance de ce métal a permis de sélectionner des mutants de l’uréase tolérant une exposition prolongée à l’urée et conservant une forte capacité de production de H₂ en présence de ce substrat azoté. L’ensemble de ces résultats montre que le métabolisme de Synechocystis peut être détourné au profit de certains processus cellulaires. Les approches « omiques » permettent d’identifier globalement les réponses physiologiques induites ainsi que les leviers biologiques de compensation. Ces travaux sont discutés au regard des implications biotechnologiques de l’instabilité génétique et de la nécessité de renforcer notre compréhension de la plasticité métabolique et génomique des cyanobactéries.Biotechnology is a powerful tool allowing exploitation of biological circuits to produce compounds with multiple uses (medicine, nutrition, industrial…). Cyanobacteria have valuable genetic and trophic properties which could reduce the costs and the environmental footprint of these processes (photosynthesis, CO₂ fixation, assimilation of diverse nitrogen sources…). They also naturally produce energetic molecules such as H₂ from which new and sustainable biofuels sectors may rise. However, a global and fine understanding of their physiology is required in order to design an efficient biological chassis with these organisms. They are genetically manipulable but also exhibit a strong versatility favoring fixation of mutations that can be either beneficial or harmful to their large-scale cultivation. Over the course of my PhD, I constructed and studied mutants of a CO₂ fixation regulator whose activation is linked to photosynthesis. I showed that the Calvin cycle activity synchronizes carbon fluxes and redox status in Synechocystis and that its deregulation affects the metabolism in a pleiotropic manner. I was specifically interested into the carbon/nitrogen balance in this species and its urea metabolism which is of prime interest in biotechnology. I demonstrated that the latter was in competition with the hydrogenase for the insertion of nickel into their respective catalytic centers. Scarcity of this metal leads to selection of mutants thriving upon prolonged exposure to urea that retained a high capacity of H₂ production in presence of this nitrogenic substrate. This work shows that the metabolism of Synechocystis can be altered in favor of other cellular processes. Omics approaches allow global identification of the physiological responses induced as well as the biological compensation mechanisms. These observations are discussed with regards to biotechnological implications of genetic instability and the need to strengthen our understanding of metabolic and genetic plasticity in cyanobacteria
Engineering cyanobacteria’s CO₂ capture metabolism for the photoproduction of high value added molecules (terpenes)
No full textLes cyanobactéries sont des micro-organismes photosynthétiques considérés comme des usines cellulaires prometteuses pour la production biotechnologique commercialement viable, durable et soutenable de molécules carbonées d’intérêts à partir de l’énergie solaire, du CO₂, et d’eau (même salée et/ou polluée). Le laboratoire s’intéresse à la production terpènes, des molécules au myriade d’applications pour la cosmétique (parfums), la santé (antimicrobiens) et l'environnement (biocarburants). Pour permettre aux cyanobactéries de devenir des usines cellulaires efficaces, un des défis majeurs est de mieux comprendre et d’améliorer leur métabolisme d’assimilation du carbone, où les principales pertes d'énergie au cours de la photosynthèse peuvent être attribuées à des goulets d'étranglement dans le cycle de Calvin-Benson (CCB), qui fixe le CO₂.En vue de l'optimisation du métabolisme de capture du CO₂, je me suis concentrée sur l'influence de la modification (au niveau de leur séquence) et de leur quantité (surproduction) de deux enzymes clés du CCB: la RuBisCO et la Phosphoribulokinase au sein de 3 châssis cyanobactériens modèles : Synechocystis PCC 6803, Synechococcus PCC 7942 et Synechococcus PCC 7002, présentant des particularités physiologiques intéressantes pour la biotechnologie.En vue de l’optimisation de la photoproduction de terpènes (limonène, bisabolène, farnésène et santalène), j’ai combiné au sein de ces 3 cyanobactéries, l’ingénierie métabolique du CCB à la production de terpènes, pour tirer parti de la redirection du flux de carbone du CCB vers la maximisation des rendements de ces molécules carbonées.Ainsi, pour plusieurs de ces stratégies, l’accumulation de biomasse, les vitesses de croissance et les rendements de production en terpènes ont été accrus.D’autre part, par une approche génétique chez la souche Synechocystis PCC 6803, j’ai participé à l’analyse des relations structure-fonction de la protéine rédox et intrinsèquement désordonnée CP12, un régulateur majeur du CCB. Dans cette étude, CP12 et ses cystéines en C-terminales ont montré in vivo, jouer un rôle majeur au niveau de processus lumière-dépendants, et de régimes de photohétérotrophie ou mixotrophie. Pour ces derniers, la protéine et ses résidus cystéines en C-terminal ont montré être essentiels pour métaboliser le carbone organique sous différentes formes, et ceci notamment dans le but d’économiser le pouvoir réducteur et maintenir une balance Carbone/Azote au sein de la cellule.L’influence de CP12 sur la production de divers terpènes a également été analysée, et a permis, pour chacun, une augmentation des rendements.Cyanobacteria are photosynthetic micro-organisms considered as promising cellular factories for the commercially viable, sustainable and durable biotechnological production of carbonaceous molecules of interest from solar energy, CO₂, and water (even salty and/or polluted). The laboratory is interested in the production of terpenes, molecules with myriad applications for cosmetics (perfumes), health (antimicrobials) and the environment (biofuels).To enable cyanobacteria becoming efficient cellular factories, one major challenge is to better understand and improve their carbon assimilation metabolism, where the main energy losses during photosynthesis can be attributed to bottlenecks in the Calvin- Benson cycle (CCB), which fixes CO₂.In order to optimize the CO₂ capture metabolism, I focused on the influence of the modification (protein sequence) and quantity (overproduction) of two key CCB enzymes: RuBisCO and Phosphoribulokinase in 3 model cyanobacterial species: Synechocystis PCC 6803, Synechococcus PCC 7942 and Synechococcus PCC 7002, presenting physiological peculiarities of interest for biotechnology.For the optimization of terpene (limonene, bisabolene, farnesene and santalene) photoproduction, I combined within these 3 cyanobacteria, metabolic engineering of CCB with terpene production, to take advantage of the redirection of carbon flux from CCB, to maximize yields of these molecules.Thus, for several of these strategies, biomass accumulation, growth rates and terpene production yields were increased.On the other hand, using a genetic approach in Synechocystis PCC 6803 strain, I participated in the analysis of the structure- function relationships of the redox and intrinsically disordered CP12 protein, a major regulator of CCB. In this study, CP12 and its C-terminal cysteines were shown in vivo to play a major role in light-dependent processes, and in photoheterotrophy or mixotrophy regimes. For the latter, the protein and its C-terminal cysteine residues have demonstrated to be essential for metabolizing organic carbon in different forms, in order to save reducing power and maintain a Carbon/Nitrogen balance within the cell. The influence of CP12 on the production of various terpenes was also analyzed, and resulted in increased yields for each
Vers la compréhension des mécanismes de formation des granules de carbonate de calcium intracellulaires chez les cyanobactéries par le développement de leur génétique
No full textLes cyanobactéries sont des microorganismes photosynthétiques qui ont joué un rôle important dans la formation des dépôts sédimentaires de carbonate de calcium (CaCO3). Pendant longtemps on considérait que cette biominéralisation se produisait uniquement à l'extérieur des cellules et était par conséquent le résultat indirect de leur métabolisme photosynthétique. Cependant, récemment, plusieurs espèces de cyanobactéries formant des inclusions intracellulaires de CaCO3 amorphe (iACC) dans des conditions thermodynamiques défavorables ont été isolées dans divers environnements. A ce jour, le(s) mécanisme(s) moléculaire(s) de ce processus reste(nt) inconnu(s). Une approche in-silico a permis d'identifier un gène orphelin nommé ccyA, présent dans toutes les cyanobactéries formant des iACC et absent du génome des autres, comme étant un marqueur de la formation des iACC.L'objectif de cette thèse était d'identifier in vivo la fonction de la protéine codée par gène ccyA et son rôle potentiel dans la formation des iACC. Les connaissances sur les espèces formant des iACC étaient très limitées. C'est pourquoi, diverses stratégies pour obtenir un mutant de délétion du gène ccyA ont été développées pour plusieurs espèces. De multiples tentatives pour obtenir un mutant par la méthode classique de transformation naturelle ont échoué. Par conséquent, le système CRISPR/Cas12a, nouvellement développé pour d'autres espèces a été adapté et a permis de déléter avec succès les gènes codant pour le glutathion réductase (gor) et un échangeur Ca2+/H+ (cax) de toutes les copies de chromosome de la cyanobactérie unicellulaire Cyanothece PCC 7425. Cependant, seul des mutants ΔccyA avec une croissance altérée et possédant encore des copies du chromosome sauvage ccyA+ ont été obtenus. Ces mutants ne possèdent pas ou peu granules d'iACC. Ces résultats suggérent que ccyA serait essentiel à la viabilité cellulaire et interviendrait directement ou indirectement dans les mécanismes de formation des iACC.La famille des protéines codées par ccyA, les calcyanines, contient quatre types distincts de domaines N-terminaux. De ce fait, l'effet de la surexpression de divers ccyA a été testée sur la croissance limitée de Cyanothece PCC 7425 dans les conditions de faible teneur en calcium (Ca). Uniquement, la surexpression de son propre gène ccyA a permis d'améliorer très significativement la croissance dans ces conditions et d'augmenter la teneur en Ca et le nombre d'inclusions de CaCO3.Dans l'ensemble, ces résultats suggèrent que la calcyanine jouerait un rôle direct ou indirect dans l'homéostasie du calcium crucial pour la formation des iACC. D'autres travaux portant sur les transporteurs de calcium sont également présentés. Avec la manipulation génétique maitrisée, Cyanothece PCC 7425 émerge donc comme un modèle important pour mieux comprendre le(s) mécanisme(s) de la biominéralisation intracellulaire chez les cyanobactéries.Cyanobacteria are photosynthetic microorganisms that have played an important role in the formation of calcium carbonate (CaCO3) sedimentary deposits. The CaCO3 biomineralization was thought to occur only extracellularly as a byproduct of their photosynthetic metabolism. However, recently several cyanobacterial species forming intracellular amorphous CaCO3 (iACC) inclusions in thermodynamically unfavourable conditions were isolated from various environments. The molecular mechanism(s) of this biomineralization process remains unknown. Subsequently, an in-silico approach allowed identification of an orphan gene named ccyA, present in all iACC forming cyanobacteria and absent in genome of other cyanobacteria, as a marker of iACC formation.The objective of this thesis was to identify the in vivo function of the ccyA gene and its potential role in iACC formation. The limited studies on iACC forming cyanobacteria have hindered progress of their genetic development. As a result, various strategies were explored across different strains to obtain a ccyA knockout mutant. Multiple attempts to obtain a ccyA mutant through natural transformation were unsuccessful. Consequently, the widely used CRISPR/Cas12a system was adapted, enabling the successful deletion of the genes encoding glutathione reductase enzyme (gor) and a Ca2+/H+ exchanger (cax) in the unicellular cyanobacterium Cyanothece PCC 7425. However, attempts to delete ccyA resulted in only a partial deletion, suggesting its essential role in cell viability. More importantly, partial deletion of the ccyA gene impaired growth and disrupted formation of iACC inclusions.Given that the ccyA-encoded protein family, Calcyanin, contains four distinct types of N-terminal domains, the impact of overexpressing various ccyA genes was evaluated on the restricted growth of Cyanothece PCC 7425 under low calcium conditions. The overexpression of only its own ccyA gene rescued growth under these conditions and the mutant had increased calcium content with more CaCO3 inclusions.Overall, these results suggest a crucial role of calcyanin in iACC formation potentially through a direct/indirect role in calcium homeostasis. Some additional work focusing on calcium transporters is also reported. With the newly established genetic manipulation, Cyanothece PCC 7425 emerges as an important model to better understand the iACC formation mechanism(s)
Biologie systémique de la résistance au stress oxydant métabolique (rôles du glutathion, du méthylglyoxal et des glyoxalases)
No full textApparues il y a environ trois milliards d'années, les cyanobactéries ont façonné notre planète, en produisant l atmosphère oxygénique. De nos jours, les cyanobactéries sont les organismes photosynthétiques les plus abondants dans notre environnement, elles assurent environ 30 à 40% de la production d'O2, et de la consommation du CO2 par les océans et constituent le premier maillon de la chaîne alimentaire. A part la photosynthèse, leur métabolisme est encore très mal connu. Ainsi, pour mieux comprendre le métabolisme cyanobactérien et proposer des stratégies de reprogrammation, il est primordial de développer des méthodes analytiques permettant l étude globale de leur métabolisme en réponse à des variations de conditions environnementales et de stress. La cyanobactérie modèle Synechocystis PCC6803 convient parfaitement à ce type d analyse. En effet, Synechocystis est un unicellulaire, hétérotrophe facultative capable de se développer en eau douce ou saumâtre et à un pH alcalin. Synechocystis possède un petit génome d environ 4.0 Mb entièrement séquencé et facilement manipulable grâce aux outils développés au laboratoire. Son génome prédit l'existence d'un métabolisme carboné complexe mais encore peu étudié. Mon travail de thèse est centré sur cette analyse par la combinaison de deux approches, la génomique fonctionnelle et la métabolomique. Durant ma thèse en collaboration avec le LEMM dirigé par Christophe Junot iBiTec-S/SPI, j ai développé un protocole d extraction des métabolites de Synechocystis, ainsi qu une méthode d analyse métabolomique par couplage de la chromatographie liquide à la spectrométrie de masse LTQ-Orbitrap à haute résolution. L application de cette nouvelle méthode analytique m a permis d étudier l influence de la lumière et du glucose sur le métabolisme de Synechocystis. Ainsi, j ai montré que Synechocystis cultivée en présence du glucose reprogramme fortement son métabolisme. Parmi les résultats très intéressants, j ai montré que le glucose engendre un stress oxydant. Chez tous les organismes, une forte activité du métabolisme carboné entraîne la production de métabolites toxiques tels que le méthyglyoxal (MG). Le MG modifie irréversiblement de nombreuses bio-molécules. Dans le cadre de ma thèse, j ai commencé à m intéresser à l'effet du MG sur la physiologie et le métabolisme de Synechocystis. J'ai construit 25 mutants KO pour les gènes de la glycolyse et du métabolisme du glycérol permettant de moduler la concentration intracellulaire de MG et également les gènes impliqués dans les voies de détoxication du MG dont celle dépendante de la synthèse du GSH (la voie des glyoxalases). J ai pu montrer que les gènes responsables de la synthèse du GSH sont essentiels à la viabilité cellulaire. Je suis parvenu toutefois à obtenir un mutant déplété de gshB et ne produisant plus de GSH à un niveau détectable. En faisant une analyse métabolomique approfondie, j ai mis en évidence pour la première fois que Synechocystis était capable produire deux tripeptides non-thiolés analogues structuraux du GSH; l acide ophthalmique et l acide norophthalmique identifiés jusqu à présent uniquement chez les mammifères. La comparaison des métabolomes de culture de souches sauvage, ou dépletées en gshA, gshB ou ggt, a permis de montré que ces analogues sont synthétisés par les mêmes enzymes que le GSH à savoir GshA et GshB. Par ailleurs, une autre molécule anti-oxydante dont la synthèse est connue chez quelques champignons et qui s accumule chez l Homme par l apport alimentaire a également été observée.Cyanobacteria are fascinating microorganisms. They are among the oldest life forms, regarded as the progenitors of the oxygenic photosynthesis and plant chloroplast. Furthermore, cyanobacteria have evolved as the largest and most diverse groups of bacteria in colonizing most marine and fresh waters, as well as soils. An important reason for the hardness of cyanobacteria is their successful combination of effective metabolic pathways driven by their efficient photosynthesis that uses nature's most abundant resources, solar energy, water and CO2, to produce a large part of the Planet's oxygenic atmosphere and organic assimilates for the food chain. Hence, cyanobacteria are receiving a growing attention because of their potential for the carbon-neutral production of biofuels and bioplastics. To better understand cyanobacteria and turn their biotechnological potentials into an industrial reality, we need to develop robust protocols for global analysis of their metabolism and its responses to environmental stresses. The model cyanobacterium Synechocystis PCC6803 is well suited for this purpose. Synechocystis is a basic organism, i.e. unicellular, which grows well (i) in fresh- and marine-waters; (ii) in the presence of glucose that can compensate for the absence of light; and (iii) at high pH that prevents microbial contaminations. Furthermore, Synechocystis harbors a small sequenced genome (about 4.0 Mb), which can be easily manipulated. In the present work, we developed a robust protocol for metabolome analyses of Synechocystis, using liquid chromatography (LC) for metabolite separation, coupled to a LTQ-Orbitrap mass spectrometer that provides high sensitivity and resolution, accurate mass measurements, and structural informations with MS/MS or sequential MSn experiments that facilitate metabolite identification. Consequently, we applied the PFPP-LC/MS method to analyze the metabolome of Synechocystis growing under various conditions of light and glucose, which strongly influence cell growth. We found that glucose increases glucose storage and catabolism, while it decreases the Calvin-Benson cycle that consumes photosynthetic electrons for CO2 assimilation. Depending on light and glucose availabilities, this global metabolic reprogramming can generate an oxidative stress, likely through the recombination of the glucose-spared electrons with the photosynthetic oxygen thereby producing toxic reactive oxygen species. Furthermore, we studied the metabolism of an endogenous toxic the méthylglyoxal and its main catabolic pathway going through the glyoxalases system glutathione dependent.PARIS11-SCD-Bib. électronique (914719901) / SudocSudocFranceF
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