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Untangling chromatin: investigating the role of transcription, supercoiling and topoisomerases in genome organization
No full textLa organización del genoma en células mamíferas sigue siendo en gran parte desconocida. Un nivel fundamental de organización se considera el bucle de cromatina, que consiste en una región de ADN atrapada en el interior de un complejo cohesina en forma de anillo, a menudo flanqueado por dos proteínas aislantes CTCFs. Aún se está investigando cómo se forman, mantienen y regulan estos bucles. Investigamos si la ARN polimerasa II es una fuerza impulsora para la translocación de cohesina en la cromatina. Mostramos que el superenrollamiento generado por la transcripción contribuye a la formación de bucles de cromatina y mejora la movilidad de la cohesina. Además, desarrollamos nuevos métodos sólidos para cuantificar cambios morfológicos en la cromatina dentro de las células utilizando microscopía confocal y de superresolución. Finalmente, investigamos en células individuales vivas el comportamiento de las enzimas que controlan la topología y el superenrollamiento del ADN: las topoisomerasas. En resumen, en este trabajo de tesis, estudié la relación entre la organización genómica, la transcripción y el superenrollamiento, y desarrollé enfoques novedosos para el análisis de la cromatina en células humanas.Genome organization in mammalian cells remains still largely unknown. One fundamental level of organization is considered the chromatin loop, consisting in a region of DNA entrapped in the lumen of a ring-shaped cohesin complex, often flanked by two CTCFs insulating proteins. Still, how loops are formed, maintained, and regulated is yet under investigation. We investigated whether RNA polymerase II is a driving force for cohesin translocation on chromatin. We showed that supercoiling generated by transcription contributes to chromatin looping and enhances cohesin mobility. In addition, we developed robust new methods for quantifying morphological changes in chromatin within cells using confocal and super-resolution microscopy. Finally, we investigated in living single cellsthe behavior of the enzymes controlling DNA topology and supercoiling: topoisomerases. Overall, in this thesis work, I studied the relationship between genomic organization, transcription, and supercoiling, and developed novel approaches for the imaging analysis of chromatin in human cells.Programa de Doctorat en Biomedicin
β-catenin fluctuates in mouse ESCs and is essential for Nanog-mediated reprogramming of somatic cells to pluripotency
No full textMouse embryonic stem (ES) cells derived from the inner cell mass of the blastocyst can be maintained in culture, under pluripotent conditions, using Serum+LIF medium. However, it has been published that the minimal combination of two compounds (GSK3 and MEK inhibitors) can sustain mouse ES cell self- renewal in absence of serum inhibiting ERK and Wnt/ β-catenin singaling pathways. Previous work of our laboratory has reported that periodic activation of the Wnt/β-catenin signalling pathway enhances reprogramming of somatic cells. Here we have demonstrated a dynamical interplay between β-catenin and Nanog in regulating both pluripotency and reprogramming. Specifically, fluctuations of Nanog affect β-catenin dynamics in serum+LIF, whereas, activation of the Wnt pathway, using Wnt3a or GSK3 inhibitors, causes β-catenin oscillations independent from Nanog. Moreover we have also proved that Nanog-mediate reprogramming depends on the indirect activation of the Wnt/β-catenin pathway. With our work we proposed a novel interaction between two parallel signalling pathways and provided a comprehensive mathematical model describing Nanog and β-catenin dynamics in mouse ES cells.Las células madre embrionarias de ratón (ES) derivadas de la masa celular interna del blastocisto, se pueden mantener en estado de pluripotencia, utilizando condiciones de cultivo que contiene Suero + factor LIF. Sin embargo, se ha publicado que la combinación mínima de dos compuestos (inhibidores de GSK3 y MEK) pueden sostener la autorrenovación de las ES en ausencia de un suero represor de las vías de señalización ERK y Wnt/β-catenina. Anteriores trabajos de nuestro laboratorio han demostrado que la activación periódica de la vía de señalización Wnt/β-catenina mejora la reprogramación de células somáticas. Aquí hemos demostrado que hay una interacción dinámica entre la β-catenina y Nanog en la regulación tanto de la pluripotencia como la reprogramación. Concretamente, las fluctuaciones de Nanog afectan a la dinámica de β-catenina en el medio con Suero + LIF, mientras que, la activación de la vía de señalización utilizando Wnt3a o inhibidores de GSK3, provoca oscilaciones de β-catenina independientes de Nanog. Por otra parte, también hemos demostrado que la reprogramación mediada por Nanog es dependiente de la activación indirecta de la vía señalización de Wnt/β-catenina. Nuestro trabajo ha propuesto una nueva interacción entre dos vías de señalización paralelas, además ha proporcionado un modelo matemático amplio que describe la dinámica de Nanog y de β-catenina en células ES de ratón.Programa de doctorat en Biomedicin
Endogenous mobilization of bone-marrow cells into murine retina induces fusion-mediated reprogramming of Müller glia cells
No full textMy PhD project was focused on understanding if endogenous bone-marrow cells (BMCs) could participate in the repair of mouse retina following N-Methyl-D-aspartate (NMDA) damage. We wanted to explore the possibility that endogenous BMCs could migrate from peripheral blood into the damaged retina and fuse with retinal neurons. We found that endogenous BMCs migrate into mouse retina upon NMDA damage and fuse with retinal neurons, mainly with Muller glia (MG) cells. MG cells undergo dedifferentiation and reprogramming after NMDA damage finally differentiating into ganglion and amacrine cells through a cell-fusion mediated mechanism. This neurogenic process was influenced by SDF-1/CXCR4 signaling pathway since when we manipulated it we were able to enhance or block the ability of MG cells to undergo reprogramming and to generate new neurons. All in all we described a novel mechanism by which murine MG cells can dedifferentiate through a cell fusion process with endogenous BMCs.Mi proyecto de doctorado ha sido enfocado en entender si las células de la medula (BMCs) pueden participar en la reparación de la retina del ratón después de causar un daño con N-Methyl-D-aspartate (NMDA). Hemos querido explorar la posibilidad de que las BMCs pudiesen migrar desde la sangre periférica hasta la retina dañada y fusionarse con las neuronas retinianas. Hemos encontrado que las células endógenas de la médula son movilizadas hacia la retina del ratón después de causar el referido daño fusionándose con las neuronas de la retina, principalmente con las células gliales Müller (MG). Las células MG empiezan un proceso de desdiferenciación y reprogramación después de causar el daño de NMDA, y acaban diferenciándose en células ganglionares y amacrinas a través de un mecanismo de fusión celular. Este proceso neurogénico está influenciado también de la vía de señalación SDF-/CXCR4, cuando hemos manipulado esta vía de señalación celular hemos sido capaces de aumentar o bloquear la capacidad de las células MG de reprogramarse y de generar nuevas neuronas. En general hemos descrito un nuevo mecanismo mediante el cual las células MG pueden desdiferenciarse a través de un proceso de fusión celular con la células endógenas del la médula.Programa de doctorat en Biomedicin
Wnt/beta-catenin activity controls the stability of imprinted genes in mouse embryonic stem cells
No full textLas células madre embrionarias (ESCs) derivan de la masa cellular interna de los blastocistos y son capaces de generar las tres capas germinales. Muchos factores controlan la pluripotencia incluyendo la ruta Wnt/β-catenina. La implicación de esta ruta en la renovación celular no ha sido aún esclarecida, mientras que su función es indispensable para la diferenciación de ESCs. En esta tesis investigamos como Wnt puede afectar la stabilidad epigenética de las ESCs. Interesantemente, observamos que la reducción de señal Wnt/β-catenina provoca desmetilación del ADN y perdida de represores de la cromatina en varias regiones de control de la impronta genética (ICR). Al contrario, el mantenimiento de Wnt/β-catenina no afectó el estado de los ICR. Además, mostramos que β-catenina puede interaccionar directamente con KAP1 y ZFP57, Finalmente, demostramos que una baja dosis de Wnt/β-catenina es necesaria durante los eventos tempranos de reprogramación cellular, pero la inhibición continua de Wnt perjudica este proceso.Mouse embryonic stem cells (ESCs) derive from the inner cell mass of the blastocyst and they are able to generate the three germ layers. Many factors control ESC pluripotency including Wnt/β-catenin signaling pathway. The implication of Wnt/β-catenin pathway in self-renewal remains still unclear, whereas its function is indispensable for ESC differentiation. In this study we investigate the effect of Wnt activity on ESC epigenetic stability. Indeed we observed that loss of Wnt/β-catenin signaling causes loss of DNA methylation and chromatin repressors recruitment, such as H3K9me3 and ZFP57, at several imprinted control region (ICR). On the contrary, sustained Wnt/β-catenin signaling protected the ICR status. Moreover, we showed that β-catenin could directly interact with KAP1 and ZFP57 proteins. Finally, we demonstrated that a low dosage of Wnt/β-catenin signaling is necessary during the early stages of somatic cell reprogramming process. However continuous inhibition of Wnt/β-catenin pathway is detrimental to this process.Programa de doctorat en Biomedicin
Investigating the role of Wnt/β-catenin pathway in pluripotency and somatic cell reprogramming
No full textThe adaptive response of cells to external stimuli is an intriguing mechanism at the basis of the existence of life itself. For this purpose, signalling pathways and gene regulatory networks elegantly evolved translating extracellular signals into finely tuned cellular responses. Among them, the Wnt/ß-catenin signalling pathway converges on the regulation of ß-catenin protein, which, in turn regulates target gene expression. In particular the Wnt/ß-catenin pathway plays a pivotal role in sustaining pluripotency and somatic cell reprogramming. Here we identified a temporal of Wnt/ß-catenin activity during somatic cell reprogramming, controlling the expression levels of mesenchymal-to-epithelial transition and senescence-associated genes through TCF1. We demonstrated that the “Wnt-OFF” state is an early reprogramming marker and that dynamic modulation can be effectively used to increase the reprogramming efficiency. Furthermore the Wnt/ß-catenin pathway is a key regulator of pluripotency and self-renewal of mouse embryonic stem cells (mESCs) and a small-molecule activator of the Wnt pathway is widely used to maintain embryonic stem cells in a ground state of pluripotency. The role of ß-catenin in mESCs is however still controversial. We noticed available ß-catenin knock-out models are flawed by the production of N-terminally truncated proteins with unknown functions. We therefore generated a novel ß-catenin knock-out using CRISPR/Cas9 technology, hoping to have clearer insight of ß-catenin functions in mESCs. We have also found that ground state pluripotency promoted by sustained Wnt pathway activation cannot be maintained indefinitely, resulting in a “lapsed” ground state possibly due, among other factors, to regulatory negative feedback loops that impair Wnt/ß-catenin activity.La respuesta adaptativa de las células a estímulos externos es un mecanismo fundamental de la existencia de la vida en sí misma. Para este fin, rutas de señalización y redes de regulación génica evolucionaron elegantemente, traduciendo señales extracelulares en respuestas celulares calibradas con precisión. Entre ellas, la ruta de señalización de Wnt/ß-catenin converge en la regulación de la proteína ß-catenin, que a su vez regula la expresión de genes diana. En particular, la ruta de Wnt/ß-catenin tiene un rol fundamental en el mantenimiento de la pluripotencia y la reprogramación de células somáticas. En esta tesis hemos identificado un papel temporal de actividad de Wnt/ß-catenin durante la reprogramación de células somáticas, lo que controla los niveles de expresión de genes asociados a transición mesenquima-epitelial y senescencia a través de TCF1. Además, la ruta de Wnt/ß-catenin es un regulador clave de la pluripotencia y la auto-renovación de células madre embrionarias de ratón (mESCs). Una pequeña molécula, activadora de la ruta Wnt es usada comúnmente para mantener las células madre embrionarias en “ground state” de pluripotencia. Sin embargo, el rol de la ß-catenin en las mESCs es aún controvertido. Observamos que los modelos disponibles de Knock-Out de ß-catenin producen proteínas truncadas en N-terminal con funciones desconocidas. Por ello, generamos un nuevo Knock-Out usando CRISPR/Cas9, al fin de clarificar funciones de ß-catenina en mESCs. Hemos encontrado también que el “ground state” de pluripotencia promovido por la activación sostenida de Wnt no puede ser mantenido indefinidamente, resultando esto en un“ lapsed ground state”; debido posiblemente, entre otros factores, a feedback-loop negativos que afectan negativamente la actividad de Wnt/ß-catenin.Programa de doctorat en Biomedicin
Mesenchymal stem cells generate distinc functional hybrids via cell fusion or entosis
No full textHomotypic and heterotypic cell-cell fusion are key processes during development and tissue regeneration. On the other hand, aberrant heterotypic cell fusion between cancer and normal cells can contribute to tumor initiation and metastasis. Additionally, a form of cell-in-cell structure called entosis has been observed in several human tumors. Here we investigate cell-cell interaction between mouse mesenchymal stem cells (MSCs) and embryonic stem cells (ESCs). MSCs have a great potential for regenerative medicine, but they are also involved in cancer progression. Here we report that MSCs can either fuse forming thereby heterokaryons, or be invaded by ESCs through entosis. Importantly we show that hetero-to-synkaryon transition occurs through a mitotic cell division and not by nuclear membrane fusion. Moreover, we also observe that the ROCK-actin/myosin pathway is required for both fusion and entosis in ESCs but only for entosis in MSCs. Overall, we show that MSCs can undergo fusion or entosis in culture by generating distinct functional cellular entities. Therefore, we conclude that both cellular processes should be explored for possible therapeutic application of MSCs.Las fusiones célula-célula homotípica y heterotípica son procesos clave durante el desarrollo y la regeneración de tejidos. Por otro lado, la fusión celular heterotípica aberrante entre células tumorales y células normales puede contribuir a la tumorigénesis y a la metástasis. Además, una forma estructural donde una célula esta dentro de la otra llamada entosis se ha observado en varios tumores humanos. Aquí estudiamos la interacción célula-célula entre las células madre mesenquimales (MSCs) de ratón y las células madre embrionarias (ESCs). Las MSCs no solo tienen un gran potencial para la medicina regenerativa, sino que también están involucradas en la progresión del cáncer. Aquí mostramos que las MSCs pueden fusionarse formando de este modo heterokaryons, o ser invadidas por las ESCs a través de entosis. Es importante destacar que la transición desde el heterokaryon al synkaryon se produce a través de una división celular mitótica y no por la fusión de la membrana nuclear. Por otra parte, también se observa que se requiere de la vía ROCK-actina/miosina tanto para la fusión como para la entosis en ESCs, pero solo para entosis en MSCs. En definitiva, se muestra que las MSCs pueden someterse a la fusión o entosis en cultivo mediante la generación de distintas entidades celulares funcionales. Por tanto, concluimos que ambos procesos celulares deben ser explorados para una posible aplicación terapéutica de las MSCs.Programa de doctorat en Biomedicin
Single molecule localization microscopy reveals DNA compaction and nascent RNA structure in vivo
No full textChromatin organization and gene expression are interdependent. Previously, our group showed that nucleosomes form groups, termed clutches, whose size correlates with cell state. In this thesis, we carried out 3D, 2-color super-resolution microscopy to image core histones, DNA and RNA at nanoscale resolution. We identified the “clutch DNA” as the DNA whose compaction is dependent on the clutch. Moreover, we studied how the epigenetic state of the clutch alters the radius of the clutch DNA. We also identified nanodomains of nascent RNA, how they fall within the clutch DNA radius, and how their RNA density is inversely correlated to clutch size. These results provide novel insights into chromatin organization at the nanoscale level and show how the clutches affect DNA packaging and transcriptional activity.La organización de la cromatina y la expresión génica son interdependientes. Previamente, nuestro grupo mostró que los nucleosomas forman grupos llamados “clutches”, cuyo tamaño está correlacionado con el estado celular. En esta tesis, se llevó a cabo microscopía de súper resolución en 3D y dos colores para poder obtener imágenes de histonas, ADN y ARN a una resolución nanoscópica. Se identificó el “clutch DNA” como aquel ADN cuya compactación es dependiente del “clutch”. Además, se estudió como el estado epigenético de los “clutches” altera el radio del “clutch DNA”. Se identificaron también nanodominios de ARN naciente, cuál es su ubicación dentro del radio del “clutch DNA”, y como la densidad de ARN está inversamente correlacionada con el tamaño del “clutch”. Estos resultados proporcionan nuevas perspectivas en la organización de la cromatina a escala nanométrica, y muestran como los clutches afectan tanto el empaquetamiento de ADN como la actividad transcripcional.Programa de doctorat en Biomedicin
Exogenous expression of chemokine receptors improves mouse mesenchymal stem cell migration towards the degenerating retina
No full textRetinopathies are a heterogeneous group of conditions that inevitably lead to vision incapacitation and blindness. Currently, they are incurable. Cell therapy has been proposed as a potential solution, but further development and optimization are required. In particular, this study addresses the problem of inadequate migration and integration of transplanted cells into the host tissue. In fact, the majority of the cells transplanted in the eye are unable to reach the injury site, where they are most needed. Hence, we hypothesize that improving cells’ migratory ability could appreciably enhance the therapeutic outcome of transplantation-based strategies. After identifying the chemokines that are most upregulated during retinal degeneration, we have over-expressed the corresponding receptors on mouse mesenchymal stem cells. Overall, we found that combined exogenous expression of two specific chemokine receptors significantly improves both ex vivo and in vivo migration of mouse mesenchymal stem cells. The strategy explored in this study provides a way to generate ad hoc engineered stem cells with an increased responsiveness to retina-specific signals. Ultimately, our findings could be integrated with alternative optimization strategies to make stem cell therapy in the eye a feasible and realistic option for the treatment of retinopathies, and for the achievement of visual restoration.Las retinopatías representan un grupo heterogéneo de enfermedades que causan, de forma inevitable, discapacidad visual y ceguera. En la actualidad no se dispone de una cura para estas enfermedades para las que la terapia celular podría ser una solución válida, en el caso de que ésta pudiera ser mejorada y optimizada. El presente estudio enfrenta el problema de la escasa e inadecuada migración de las células trasplantadas en el tejido diana. De hecho, la mayoría de las células trasplantadas en el globo ocular no consiguen llegar allí donde se las requiere; donde se encuentra la lesión. Por este motivo, se plantea la hipótesis de que mejorar la capacidad migratoria de las células podría resultar en una mejora substancial del resultado terapéutico de los trasplantes celulares. Después de identificar las quimiocinas más expresadas durante la degeneración de la retina, se ha procedido a sobre-expresar los receptores correspondientes en células madre mesenquimales de ratón. En general, los resultados obtenidos indican que la expresión exógena combinada de dos receptores específicos de quimiocinas mejoran significativamente la migración de células madre mesenquimales, tanto ex vivo como in vivo. La estrategia desarrollada en este estudio proporciona una forma de generar células madre con una mayor capacidad de respuesta a señales específicas de la retina. Tanto es así, que los hallazgos que en él se detallan podrían integrarse con otras estrategias de optimización, de forma que la terapia con células madre sea una opción factible y realista para el tratamiento de retinopatías.Programa de doctorat en Biomedicin
Chromatin fibers are formed by heterogeneous groups of nucleosomes in vivo
No full textLa arquitectura del genoma y la estructura de la cromatina, junto con los factores de transcripción son actores clave para la autorenovación, la pluripotencia y la diferenciación de las células madre embrionarias (ESCs). Combinando una microscopía cuantitativa de super-resolución (STORM) con simulaciones numéricas hemos sido capaz de definir cómo los nucleosomas están empaquetados en vivo, y hemos identificado un nuevo modelo de organización de la fibra de cromatina. Encontramos que la fibra de cromatina está formada por grupos de nucleosomas de diferentes tamaños, que llamamos "nucleosome clutches" y que estos están intercalados con regiones sin nucleosomas. Además, el número medio de nucleosomas y su nivel de compactación dentro de los clutches, está relacionado con el estado celular. Células madre pluripotentes, tienen en promedio clutches con menos nucleosomas incluidos y de menos densidad con respecto a las células diferenciadas.Nuclear architecture and chromatin structure, together with the transcriptional network are key players for self-renew, pluripotency and differentiation of embryonic stem cells (ESCs). Combining quantitative super-resolution microscopy (STORM) with computer simulations we resolved how nucleosomes are arranged in vivo, identifying a novel model of organization of the chromatin fiber. We found that chromatin fiber is formed by groups of nucleosomes of varying sizes, which we term “clutches” and these were interspersed with nucleosome-depleted regions. Moreover the median number of nucleosomes and their compaction inside clutches highly correlated with cellular state. Ground-state pluripotent stem cells had, on average, less dense clutches containing fewer nucleosomes with respect to differentiated cells.Programa de doctorat en Biomedicin
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