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Sviluppo di tecniche di microscopia time-lapse per studio del ruolo dell'NG2 nel controllo della motilità cellulare.
No full textLa motilità cellulare è alla base di numerosi processi biologici, dalla morfogenesi all'infiammazione. Per lo studio in 2D del fenomeno sono disponibili tecniche di
microscopia in fluorescenza su campioni fissati, in cui le cellule vengono osservate in istanti di tempi precedenti o seccessivi all'aggiunta di un dato fattore, perdendo
la dinamicità dell'evento. L'avvento di tecnologie come la microscopia time-lapse ha permesso di superare tali limiti, consentendo di seguire il movimento istante per
istante e di ottenere una quantizzazione del fenomeno in termini di analisi dello spostamento delle cellule. I metodi sperimentali per lo studio della chemiotassi si
possono raggruppare in due categorie principali: saggi di tipo indiretto, in cui si registra la posizione finale delle cellule dopo un assegnato periodo di incubazione, e
saggi di tipo diretto, in cui le traiettorie di singole cellule vengono monitorate nel corso dell'esperimento . Alla prima categoria appartiene il saggio di Boyden, in cui
il comportamento chemotattico viene quantificato contando il numero di cellule che hanno attraversato un filtro interposto tra due compartimenti in risposta ad un
gradiente di concentrazione. Un altro saggio indiretto per lo studio della migrazione sotto l'effetto del gradiente di concentrazione, è l' under-agarose, in cui vengono
praticati dei pozzetti in un gel di agarosio, alcuni dei quali contenengono la sospensione di cellule, altri la soluzione del fattore chemottatico. Uno dei principali
saggi diretti per visualizzare il movimento di singole cellule in un ambiente 3D è lo studio della migrazione in gel di collagene o fibrina. Le tecniche quantitative in
uso per la caratterizzazione della motilità cellulare in 2D o 3D includono in primo luogo la ricostruzione delle traiettorie cellulari. Per la ricostruzione delle
traiettorie è necessario associare le posizioni successivamente occupate dalle singole cellule applicando un algoritmo di "matching".
Il contributo principale dell'Unità di ricerca di Napoli consisterà nella messa a punto di tecniche e di metodi di analisi per lo studio della motilità cellulare in 2D e
3D in vitro. Gli aspetti del progetto saranno:
1) Realizzazione di un sistema sperimentale per lo studio del movimento in 2D di cellule della muscolatura liscia derivanti da topi wild-type e topi NG2 knock-out in
risposta a singole molecole ECM purificate e matrici native (isolate da cellule coltivate secondo uno specifico protocollo). La motilità cellulare verrà studiata
utilizzando un sistema di video microscopia ottica basato su un microscopio ottico rovesciato fornito di un tavolo porta oggetto e di un sistema di messa a fuoco
dotati entrambi di motori passo-passo, che consentono di posizionare in modo automatico il campo di vista all'interno del campione in esame. Le immagini vengono
acquisite mediante una videocamera monocromatica CCD ed inviate ad un personal computer.
2) Misure di migrazione 2D di cellule trasformate del tipo muscolatura liscia (di fatto cellule di leiomiosarcoma) in cui sono state separate le sottopopolazioni NG2+
e NG2-. Le misure di migrazione in 2D di cellule della muscolatura liscia verranno condotte sviluppando un'analisi quantitativa del comportamento locomotorio
delle cellule, basata sulle loro traiettorie durante gli esperimenti di time-lapse. La ricostruzione delle traiettorie tridimensionali verrà effettuata mediante degli
algoritmi di matching a partire dalle coordinate delle cellule negli esperimenti di time-lapse.
3) Analisi comparativa in 2D delle cellule descritte qui sopra nelle quali siano stati stabilmente trasfettati vari costrutti di delezione dell'NG2. L'analisi sarà basata
su alcuni parametri caratteristici della motilità, quali il coefficiente di diffusione ed il tempo di persistenza. Tali parametri verranno calcolati dagli spostamenti
quadratici relativi a ciascuna traiettoria, dei quali sarà determinato il valore medio sulla popolazione di cellule in esame in funzione del tempo e confrontato con
modelli di correlated random walk.
4) Realizzazione di un sistema sperimentale per lo studio della chemiotassi in un gel di collagene. Il sistema da sviluppare per lo studio della chemiotassi si basa
sull'osservazione diretta della locomozione cellulare 3D in esperimenti di time-lapse. Il saggio di migrazione verrà effettuato in una cella rettangolare divisa in due
comparti da un setto separatore. Le immagini acquisite mediante scansione tridimensionale del gel di collagene saranno sottoposte ad elaborazione al calcolatore utilizzando algoritmi di deconvoluzione per la rimozione delle componenti fuori fuoco. L'implementazione degli algoritmi di deconvoluzione sarà effettuata in
ambienti di calcolo ad alte prestazioni
Smart and Green Interfaces, Materials and Processes for Energy Application Joint Meeting
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Saggio di Chemiotassi 2D e 3D mediante osservazione in microscopia Time Lapse in vitro, realizzando un gradiente controllato di chemioattraente in una cella
No full textLa cella per la realizzazione di un saggio di Chemiotassi in 2D e 3D consente di osservare mediante tecniche di microscopia Time Lapse in vitro, dei campioni, tipicamente delle cellule in coltura, mentre sono sottoposti a gradienti controllati di concentrazione di una specifica molecola o composto. La cella, divisa in due o più pozzetti, consente di realizzare un flusso noto di chemoattraente nei pozzetti contenenti i campioni in esame. Durante il saggio di chemiotassi la cella contenente i campioni viene mantenuta in condizioni del tutto analoghe a quelle fisiologiche, in termini di temperatura, umidità, concentrazione di CO2 e pH; inoltre la cella consente di mimare la matrice extracellulare da cui le cellule sono tipicamente circondate, sospendendole in un gel 3D di collagene; la cella consenta anche di investigare la capacità delle cellule di invadere tessuti, in presenza o meno di uno stimolo chemotattico. Il saggio consente di monitorare la traiettoria descritta dalle cellule sottoposte allo stimolo chemotattico, tramite tecniche di analisi delle immagini. Dalla analisi delle traiettorie descritte è possibile ricavare informazioni quantitative sulla motilità cellulare in presenza o meno di stimoli chemotattici noti e riproducibili
Microdispositivo per la realizzazione di un gradiente controllato di concentrazione per saggi di chemiotassi
No full textIl microdispositivo presentato nel presente brevetto per invenzione industriale consente di realizzare un gradiente controllato di chemoattraente o altra sostanza chimica, al fine di investigare la motilità chemotattica delle cellule in 2D e 3D. Il saggio di chemiotassi viene realizzato mediante osservazione in microscopia Time Lapse in vitro del campione sottoposto ad un gradiente di concentrazione controllato di una specifica sostanza, mantenendo condizioni di temperatura, umidità, concentrazione di CO2 e pH analoghe a quelle fisiologiche
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