1,721,157 research outputs found
Le basi molecolari della prestazione aerobica in ipossia
No full textNei soggetti caucasici l’esposizione prolungata ad altitudini al di sopra dei 5000 metri induce nel muscolo scheletrico cambiamenti sia morfologici che strutturali. Negli arti inferiori si osserva una perdita del 10-15% della massa magra, una riduzione del 20-25% della densità mitocondriale ed una diminuzione dell’attività degli enzimi ossidativi nonché un significativo abbassamento della massima capacità anaerobica durante l’esercizio fisico.
Lo studio proteomico consente di evidenziare variazioni nell’espressione proteica muscolare indotte dall’ascesa in quota fornendo informazioni circa le basi molecolari associate ai cambiamenti morfologico-strutturali- funzionali precedente osservati.
Disegno sperimentale
Lo studio proteomico è stato condotto su biopsie di muscolo vasto laterale umano ottenute da soggetti partecipanti a due spedizioni in alta quota.
La prima spedizione è avvenuta sul Monte Rosa, la seconda spedizione, denominata Caudwell Extreme Everest Expedition, è avvenuta all’ Everest. Di seguito sono riportati brevemente i dettagli delle spedizioni.
- Monte Rosa: esposizione progressiva a ipossia ipobarica durante il percorso di salita alla Capanna Margherita (4559). Durata del percorso: 3 giorni. Numero di soggetti indagati: 10. Biopsie muscolari: 2 per soggetto, la prima biopsia è stata effettuata a livello del mare prima dell’inizio della spedizione, mentre la seconda biopsia è stata effettuata a 4559 m tra il 7° e il 9° giorno dall’inizio della spedizione.
- Everest: i soggetti partecipanti a questa spedizione si dividono in 2 gruppi:
a) early Everest: esposizione progressiva a ipossia ipobarica durante il percorso di salita fino al Base Camp (5300m) del Monte Everest. Durata del percorso: 15/20 giorni. Numero di soggetti indagati: 5. Biopsie muscolari: 2 per soggetto, la prima biopsia è stata effettuata a Londra prima della spedizione e la seconda biopsia è stata effettuata in quota all’arrivo al Base Camp.
b) late Everest: esposizione progressiva a ipossia ipobarica durante il percorso di salita fino alla cima del Monte Everest (8848m). Durata del percorso: 70 giorni circa. Numero di soggetti indagati: 8. Biopsie muscolari: 2 per soggetto, la prima biopsia è stata effettuata a Londra prima della spedizione e la seconda biopsia è stata effettuata in quota all’arrivo al Base Camp (5300m) nel percorso di discesa dalla cima.
Metodologia
Lo studio proteomico è stato condotto impiegando le tecnologie 2D-DIGE (Differential in gel electrophoresis) e ESI MS/MS (spettrometria di massa) per lo studio degli andamenti dei livelli d’espressione proteica e per l’identificazione degli spot proteici d’interesse.
Le biopsie muscolari sono state lisate in un tampone di lisi, ciascun estratto proteico è stato sottoposto a marcatura fluorescente (fluorofori CyDye) e a successiva separazione mediante elettroforesi bidimensionale. Le immagini risultanti sono state acquisite mediante scanner a raggio laser (Typhoon) e processate nel software Decyder per l’analisi computerizzata. Le differenze statisticamente significative tra i livelli d’espressione proteica sono state individuate mediante applicazione del test statistico paired Student’s T-test impiegando come livello di significatività statistica p<0.05. Gli spot proteici d’interesse sono stati identificati dopo il loro prelievo automatico da gel di tipo “preparativo”, digestione con tripsina e iniezione dei peptidi eluiti nello spettrometro di massa.
Risultati
I principali risultati ottenuti dall' analisi proteomica dei tessuti bioptici oggetto di questi studi sono elencati di seguito:
- Monte Rosa: il muscolo scheletrico di soggetti caucasici esposti per un periodo relativamente breve (7-9 giorni) all’alta quota mostra una diminuzione massiccia di proteine coinvolte nella risposta allo stress (enzimi antiossidanti, chaperone proteins) nonchè di enzimi appartenenti al ciclo degli acidi tricarbossilici, alla ossidazione e alla fosforilazione ossidativa. Risultano interessate da deregolazione anche proteine coinvolte nell’omeostasi del ferro. La valutazione, mediante immunoblotting, della stabilizzazione di HIF1 (Hypoxia inducible factor ) e dell’aumento dell’espressione della piruvato deidrogenasi chinasi 1 ha dato risultato negativo, mentre è risultato significativamente diminuito il livello d’espressione di mTOR (mammalian target of rapamicin) coinvolto nella regolazione della sintesi proteica ( Viganò et al Proteomics, 2009).
- Everest:
a) early Everest: la risposta alla diminuzione di ossigeno inspirato sembra coinvolgere, nel muscolo scheletrico, l’apparato metabolico (principalmente gli enzimi della glicolisi, l’apparato di risposta allo stress e la sintesi proteica. E’ stata notata anche una modulazione a livello della mioglobina.
b) late Everest: la risposta alla diminuzione di ossigeno per un periodo prolungato sembra riguardare con minor entità, rispetto alla condizione precedente, l’apparato metabolico (rimane più che altro compromesso il metabolismo aerobico), l’apparato di risposta allo stress e la sintesi proteica, mentre sembra interessare l’apparato contrattile, l'omeostasi del calcio e la risposta infiammatoria. Vi sono infatti evidenze che suggeriscono una deregolazione dell’omeostasi del Ca++ (diminuzione nella fosforilazione di isoforme di proteine contrattili, aumento del livello di espressione di una proteina coinvolta nel rilascio di Ca++ da parte del reticolo sarcoplasmatico). Si è inoltre osservata la variazione di proteine coinvolte nella glicogeno compensazione per la sintesi del glicogeno.
Conclusioni
Lo studio proteomico condotto su campioni prelevati da soggetti sottoposti ad altitudini e a tempi di esposizione diversi, ha permesso di tracciare un profilo degli adattamenti molecolari indotti dalla carenza di ossigeno nel tessuto muscolare
Hypoxia adaptation in human and animal models: contribution of proteomics
No full textThe exploration of cellular mechanisms underlying beneficial adaptive processes and detrimental responses to hypoxia represents the object of several current research studies leading to increase knowledge and possibly modulate or develop new treatments for human diseases. Proteome analysis on skeletal muscles represents a tool for profiling molecular changes leading to adaptation to hypoxia in physiological conditions. Muscles from animal models exposed to acute and prolonged hypoxia, human muscles biopsies from individuals at sea level and at high altitude after nine days, two weeks and after fifty days of exposure were utilized to investigate the alteration occurring in skeletal muscle proteome. The aim was, by characterizing the muscle proteome, to identify cellular processes involved in hypoxia adaptation. Proteome analysis was performed utilizing 2D-DIGE and MALDI-ToF /ToF mass spectrometry. 2D-DIGE analysis revealed that the majority of changed proteins is represented by metabolic enzymes belonging to glycolysis, tricarboxylic acid cycle, fatty acid beta oxidation and oxidative phosphorylation, and by proteins involved in the regulation of protein translation. All these proteins were considerably less abundant under hyoxia versus normoxia. Among proteins involved in stress response a down-regulation in the early fase and an up-regulation of some antioxidant enzymes in the long term exposure were identified. A marked modulation was present also in cytoskeletal and contractile proteins. In addition markers of autophagy, apoptosis, energy production and mitochondrial biogenesis appeared significantly changed during adaptation. Proteomic analysis provided a clear picture of events occurring in muscle tissue under short and long term hypoxia exposure. Particularly, it allows to underline the more relevant changes at the metabolic, functional and structural level involved in the tissue adaptation at the limit of humans tolerance of O2 deprivation.
Aknowledgements. Suppoted by MIUR (grant: FIRBRBRNO7BMCT) and by Associazione Everest-K2-CNR
Energy metabolism in hypoxia: reinterpreting some features of muscle physiology on molecular grounds
No full textAn holistic approach for interpreting classical data on the adaptation of the animal and, particularly, of the human body to hypoxic stress was promoted by the discovery of HIF-1, the "master regulator" of cell hypoxic signaling. Mitochondrial production of ROS stabilizes the O2- regulated HIF-1α subunit of the HIF-1 dimer promoting transaction functions in a large number of potential target genes, activating transcription of sequences into RNA and, eventually, protein production. The aim of the present preliminary study is to assess whether adaptive changes in oxygen sensing and metabolic signaling, particularly in the control of energy turnover known to occur in cultured cells exposed to hypoxia, are detectable also in the muscles of animals and man. For the present analysis, data obtained from the proteome of the rat gastrocnemius and of the vastus lateralis muscle of humans together with functional measurements were compared with homologous data from hypoxic cultured cells. In particular, the following variables were assessed: (1) the role of stress response proteins in the maintenance of ROS homeostasis, (2) the activity of the PDK1 gene on the shunting of pyruvate away from the TCA cycle in rodents and in humans, (3) the COX-4/COX-2 ratio in hypoxic rodents, (4) the overall efficiency of oxidative phosphorylation in humans during exercise in hypoxia, (5) some features of muscle mitochondrial autophagy in humans undergoing subchronic and chronic altitude exposure. Despite the limited number of observations and the differences in the experimental approach, some initial interesting results were obtained encouraging to pursue this innovative effort
Effects of ageing in muscle tissue: the contribution of proteomics
No full textAgeing induces a progressive functional decline affecting the entire organism, therefore, the loss of muscle mass and function (sarcopenia) contributes significantly to a loss of functional autonomy. In muscles, the age-related degenerative changes produce alteration of morphology associated to muscle fiber atrophy, loss of satellite cells, and remodelling of neuronal structures. Morphological changes induced by ageing indicate a decrement of muscle fiber size, a change in fiber type distribution and appearance of mitochondrial aggregates with an increment of lipofuscin. This functional and morphological changes are also observed in nerves, in which ageing induces biochemical, morphological and functional variations both in myelin and in axons. Beside that, mitochondrial metabolism plays a pivotal role in aging, as its alteration influences the muscle function. In particular, the two morphologically distinct mitochondrial sub-fractions, named sub-sarcolemmal (SS) and inter-myofibrillar (IMF) according to their diverse cellular localization, play different roles in muscle tissue. The modulation of the respiration rate, proteins and lipids composition, and the diverse biochemical (e.g. protein import) properties, contributes to muscle cell adaptation during ageing. The SS sub-fraction is more influenced by muscle changes and is more affected by ageing. Proteomics has been utilized to monitor, at the molecular level, the decline of muscle tissue, nerves innervating it and mitochondrial machiner
Isoelectric focusing followed by electrophoresis of protein for visualizing their titration curves by zymogram and immunofixation
No full textAfter isoelectric focusing followed by electrophoresis at right angles in the same gel slab, it is possible to visualize the titration curve of proteins by zymograms or immunofixation even of an unpurified sample. This information can be very useful for the selection of the proper purification strategy by charge-dependent methods, e.g. ion-exchange chromatography, zone and disc electrophoresis and isotachophoresis. The titration curve also gives information on the stability of the protein as a function of the prevailing pH of the medium, in the pH 3-10 range. A region of instability is found for most proteins in acidic conditions, below pH 4.5, while most proteins are stable in the alkaline pH region at least up to pH 10. The best method for developing zymograms and immunoprints appears to be the 'sandwich technique', by which a thin agarose slab, cast on an hydrophilic polyester sheet, and impregnated with appropriate reagents, is left in contact with a polyacrylamide gel thin layer used to generate the titration curves
- …
